基于定量 PCR 的测定法测量纤毛发生细胞模型中的 Sonic Hedgehog 信号传导

我们开发了一种基于细胞培养的灵敏定量检测方法，可用于评估 Sonic Hedgehog 信号传导，该信号主要通过初级纤毛转导。该测定可用于检查与原发性纤毛功能障碍相关的遗传和表观遗传改变。尽管初级纤毛在 Sonic Hedgehog 信号传导中起着核心作用，但目前的方法通常缺乏评估初级纤毛在遗传改变下功能所需的敏感性。

该方案通过提供基于细胞培养的检测来填补这一空白，模拟纤毛细胞中的 Sonic Hedgehog 激活和 Sonic Hedgehog 靶基因表达。与其他方案相比，例如在 Sonic Hedgehog 通路激活后沿初级纤毛定位平滑蛋白，我们的检测是定量的、易于遵循的且灵敏的，因为它是基于细胞培养的。首先，从 37 摄氏度和 5% 二氧化碳培养箱中取出含有在 5 毫升完全培养基中生长的近乎汇合的 RPE-1 细胞的 T25 细胞培养瓶。

弃去细胞培养瓶中的培养基，并使用预热的 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液的酶活性去除细胞。使用预热的完全培养基将细胞重悬于培养瓶中。在血细胞计数器上计数细胞以确定悬浮液的细胞密度。

将两张无菌的 12 毫米盖玻片放入两个 35 毫米的细胞培养皿中。在每个包含盖玻片的培养皿中，以 5 个异步生长的 RPE-1 细胞的 2 次 10 次方接种。向每个培养皿中加入 2 mL 完全培养基，并使细胞生长 24 小时。

孵育后，从生长的 RPE-1 细胞中取出培养基，并用 1 毫升预热的 DPBS 缓冲液洗涤细胞一次。向每个培养皿中加入 2 毫升预热的 DMEM 培养基，其中含有不含 FBS 的 1% 青霉素链霉素。将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 24 小时。

第二天，用含有终浓度为 250 纳摩尔的平滑激动剂的血清饥饿培养基替换培养基。将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下再孵育 24 小时。孵育后，将盖玻片转移到 24 孔板中，在每个孔中放置一个盖玻片。

向每个孔中加入 0.5 mL冷冻甲醇以固定细胞。将板在零下 20 摄氏度下孵育 10 分钟。立即用 0.5 ml 洗涤缓冲液清洗盖玻片 3 次。

丢弃盘子中的培养基。向每个培养皿中直接添加 0.5 ml TRIzol 试剂。将试剂均匀分布，静置 5 分钟。

上下移液几次以产生均匀的混合物，并将其收集在 1.5 毫升、无核酸酶的微量离心管中向每个含有经平滑激动剂和 DMSO 处理的 TRIzol 混合细胞的试管中加入 0.1 毫升氯仿。将试管孵育 2 到 3 分钟，然后在 4 摄氏度下以 12， 000g 离心。将含有 RNA 的水相转移到新鲜的微量离心管中。

向水相中加入 0.25 毫升异丙醇，并将试管孵育 10 分钟。将样品在 12， 000 g 下在 4 摄氏度下离心 10 分钟。观察白色凝胶状 RNA 沉淀的形成。

使用微量移液器小心丢弃上清液。然后，将 RNA 沉淀重悬于 0.5 mL 新鲜稀释的 75% 乙醇中。短暂涡旋试管以确保混合。

将样品在 7， 500 g 和 4 摄氏度下离心 5 分钟。使用微量移液器小心丢弃上清液。将 RNA 沉淀风干 10 分钟。

将沉淀重悬于 25 μL 无核酸酶水中。使用 260 纳米的超微量分光光度计测量总 RNA 浓度。按照制造商的 cDNA 合成试剂盒说明，从每个样品中使用 1 至 3 μg 总 RNA 合成 cDNA。

使用来自每个样品的 1：5 稀释的 cDNA 和 GLI1、PTCH1、HHIP、SMO 和 β-肌动蛋白基因引物组，在多孔荧光敏感 PCR 板中使用 qPCR 预混液，一式三份构建 qPCR 反应。用合适的密封剂覆盖 PCR 板。将板放入 qPCR 仪器中。

运行 40 个扩增循环的标准化 qPCR 程序，然后进行熔解曲线分析。运行后，检查每个扩增子的熔解曲线，在所需温度下是否有单峰。将扩增数据导出到电子表格。

通过对 β-肌动蛋白表达进行标准化来计算每个转录本的相对表达，在图表上绘制相对表达数据，并使用未配对的 t 检验计算表达变化的统计显着性。大多数血清饥饿细胞以超过 85% 的纤毛组装初级纤毛。在这种情况下，与 DMSO 处理的细胞相比，光滑激动剂处理的细胞中 GLI1 、 PTCH1 和 HHIP 的表达水平显着增加，而 SMO 转录水平没有显着变化。