Desarrollamos un ensayo sensible y cuantitativo basado en cultivos celulares que se puede utilizar para evaluar la señalización de Sonic Hedgehog, que se transduce principalmente a través de los cilios primarios. Este ensayo se puede utilizar para examinar las alteraciones genéticas y epigenéticas, que se asocian con la disfunción primaria de los cilios. A pesar del papel central de los cilios primarios en la señalización de Sonic Hedgehog, las metodologías actuales a menudo carecen de la sensibilidad necesaria para evaluar la función de los cilios primarios bajo alteraciones genéticas.
Este protocolo llena este vacío al proporcionar un ensayo basado en cultivos celulares, que imita la activación de Sonic Hedgehog y la expresión génica diana de Sonic Hedgehog en células ciliadas. En comparación con otros protocolos, como la localización de la proteína suavizada a lo largo de los cilios primarios tras la activación de la vía Sonic Hedgehog, nuestro ensayo es cuantitativo, fácil de seguir y sensible, ya que se basa en el cultivo celular. Para comenzar, retire el matraz de cultivo celular T25 que contiene células RPE-1 casi confluentes que crecen en cinco mililitros de medio completo desde una incubadora de 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono.
Deseche el medio de cultivo del matraz de cultivo celular y desaloje las células con la actividad enzimática de una solución precalentada de tripsina-EDTA al 0,25%. Vuelva a suspender las células en un matraz utilizando un medio completo precalentado. Cuente las células en un hemocitómetro para determinar la densidad celular de la suspensión.
Coloque dos cubreobjetos estériles de 12 milímetros en dos placas de cultivo celular de 35 milímetros. Siembra dos veces 10 a la potencia de cinco células RPE-1 que crecen de forma asincrónica en cada placa que contiene cubreobjetos. Agregue dos mililitros de medio completo a cada plato y haga crecer las células durante 24 horas.
Después de la incubación, retire el medio de las células RPE-1 en crecimiento y lave las células una vez con un mililitro de tampón DPBS precalentado. Agregue dos mililitros de medio DMEM precalentado que contenga 1% de penicilina estreptomicina sin FBS a cada plato. Incubar las células a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 24 horas.
Al día siguiente, reemplace el medio con un medio hambriento de suero que contenga un agonista suavizado a una concentración final de 250 nanomolares. Incubar las células durante otras 24 horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Después de la incubación, transfiera los cubreobjetos a una placa de 24 pocillos, colocando un cubreobjetos en cada pocillo.
Agregue 0,5 mililitros de metanol enfriado a cada pocillo para fijar las celdas. Incuba la placa a menos 20 grados centígrados durante 10 minutos. Lave inmediatamente los cubreobjetos tres veces con 0,5 mililitros de tampón de lavado.
Deseche el medio de los platos. Agregue 0,5 mililitros de reactivo TRIzol directamente a cada plato. Distribuya el reactivo uniformemente y déjelo reposar durante cinco minutos.
Pipetear hacia arriba y hacia abajo varias veces para crear una mezcla homogénea y recogerla en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros sin nucleasas Agregue 0,1 mililitros de cloroformo a cada tubo que contenga células mezcladas con TRIzol tratadas con un agonista suavizado y DMSO. Incubar los tubos durante dos o tres minutos antes de centrifugar a 12.000 g a cuatro grados centígrados. Transfiera la fase acuosa que contiene el ARN a tubos de microcentrífuga nuevos.
Añadir 0,25 mililitros de isopropanol a la fase acuosa e incubar los tubos durante 10 minutos. Centrifugar las muestras a 12.000 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Observe la formación de una bolita de ARN blanca similar a un gel.
Deseche cuidadosamente el sobrenadante con una micropipeta. A continuación, vuelva a suspender el gránulo de ARN en 0,5 mililitros de etanol al 75% recién diluido. Agite brevemente los tubos para asegurar la mezcla.
Centrifugar las muestras a 7.500 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Deseche cuidadosamente el sobrenadante con una micropipeta. Seque al aire los gránulos de ARN durante 10 minutos.
Vuelva a suspender los pellets en 25 microlitros de agua libre de nucleasas. Mida la concentración total de ARN utilizando un espectrofotómetro de microvolumen a 260 nanómetros. Utilice de uno a tres microgramos de ARN total de cada muestra para sintetizar ADNc siguiendo las instrucciones del fabricante para un kit de síntesis de ADNc.
Configure las reacciones de qPCR por triplicado utilizando de uno a cinco ADNc diluidos de cada muestra con conjuntos de cebadores de genes GLI1, PTCH1, HHIP, SMO y beta-actina, con una mezcla maestra de qPCR en una placa de PCR sensible a fluorescentes de múltiples pocillos. Cubra la placa PCR con un sellador adecuado. Coloque la placa en un instrumento de qPCR.
Ejecute el programa qPCR estandarizado con 40 ciclos de amplificación, seguidos de un análisis de la curva de fusión. Después de la ejecución, verifique la curva de fusión de cada amplicón para ver si hay un solo pico a la temperatura deseada. Exporte los datos de amplificación a una hoja de cálculo.
Calcule la expresión relativa de cada transcripción mediante la normalización con respecto a la expresión de beta-actina, trace los datos de expresión relativa en un gráfico y calcule la significación estadística de los cambios en la expresión utilizando una prueba t no apareada. La mayoría de las células hambrientas de suero ensamblaron cilios primarios con más del 85% de ciliación. En esta condición, los niveles de expresión de GLI1, PTCH1 y HHIP aumentaron significativamente en las células tratadas con agonistas lisos en comparación con las células tratadas con DMSO, mientras que los niveles de transcripción de SMO no mostraron cambios significativos.
