نظام تنقية البروتين عالي الإنتاجية اقتصادي ومتعدد الاستخدامات باستخدام محول لوحة عمود متعدد. مرحبا، تنقية البروتين أمر حتمي لدراسة بنية البروتين ووظيفة. وعادة ما يستخدم في تركيبة مع التقنيات الفيزيائية الحيوية.
وهذا مهم بشكل خاص في عصر البروتيوميات الوظيفية التي تتطلب إنتاج البروتين عالية الإنتاجية. افترضنا أن محول لوحة متعدد الأعمدة ، MCPA ، يمكن أن يواجهة أعمدة لونية متعددة من راتنجات مختلفة مع لوحات متعددة الآبار للتنقية المتوازية. مع هذا المحول، قمنا بتطوير طريقة اقتصادية وتنوعا لتنقية البروتين التي يمكن استخدامها تحت الجاذبية أو فراغ المنافس في سرعة نظام الآلي.
هنا نعرض هذه الطريقة للكروماتوغرافيا تقارب النيكل والكروماتوغرافيا تبادل الأيونات. تجميع MCPA عن طريق وضع ثقب ختم حصيرة على لوحة بالتنقيط طويلة، ثم إدراج العدد المطلوب من الأعمدة في ثقوب حصيرة الختم. وضع لوحات جمع مفتوحة في قاعدة متعددة وقريبة مع الجزء العلوي من متعددة.
إرفاق أنابيب ووضع MCPA تجميعها مع أعمدة في الجزء العلوي. Pipet 1.2 ميل من محلول النيكل وNTA في الأعمدة. أثناء الأنابيب، تأكد من أن الخرز لا تزال مختلطة تماما.
قم بتشغيل المضخة وتشغيل الإيثانول بنسبة 20٪ من خلال الأعمدة وإلى لوحة التجميع أدناه. إيقاف تشغيل المضخة مرة واحدة يتم تشغيل السائل من خلال. التخلص من محتويات لوحة جمع في صندوق النفايات.
إضافة ثلاثة وحدات تخزين الراتنج من المخزن المؤقت EDTA إلى كافة الأعمدة. بدوره على المضخة وتشغيل السائل من خلال. الآن غسل الأعمدة مع ثلاثة أحجام الراتنج من 0.5 الضرس الصوديوم هيدروكسيد العازلة.
غسل الأعمدة مع أربعة أحجام الراتنج من كبريتات النيكل 100 ملليمولار، ثم 10 أحجام الراتنج من المياه ميلي كيو. إذا كان العمود يعمل بشكل أبطأ، ادفع السائل من خلال المكبس المحقن. صب محتويات لوحات جمع في صندوق النفايات.
ثم غسل الأعمدة مرتين مع أربعة أحجام الراتنج من 10 ملليمولار imidazole غسل العازلة وتفريغ لوحات جمع. إذا تم تنقية عينات متعددة، استبدل لوحات التجميع المفتوحة بلوحات من 48 بئرا. مع فراغ قبالة، تحميل lysates في الأعمدة.
استخدام ستيرر البلاستيك رقيقة لخلط بلطف الخرز واليسات في العمود لتحقيق أقصى قدر من الربط. بدوره على المضخة وتشغيل السائل من خلال. إذا أصبح عمود محظورا، قم بنقل خليط راتنج اللحواف إلى عمود باستخدام فلتر جديد.
تجميد لوحات جمع لاحتواء التدفق الخاص بك من خلال. استبدال لوحة جمع مفتوحة ومن ثم غسل الأعمدة مع تسعة أحجام الراتنج من 10 ميليمولار imidazole غسل العازلة. كرر هذه الخطوة أربع أو خمس مرات.
لتجنب تجاوز السعة، قم بإفراغ لوحات النفايات بشكل دوري. استبدل لوحات التجميع المفتوحة بلوحة من 96 بئرا، مما يضمن وجود A1 في الزاوية اليسرى العليا. Pipet حجم واحد من الراتنج من إزالة العازلة elution في الأعمدة.
تشغيل السائل من خلال والتحقق من لوحة جمع للتأكد من عدم وجود تلوث بين الآبار. لتخفيف المقبل، كرر الخطوات السابقة وجمع في لوحة جمع جديدة. خذ 50 ميكرولتر aliquot من كل elution لتحليل النقاء والتركيز.
بعد ذلك، اغسل الأعمدة بمليلترين من الإيثانول بنسبة 20٪. إضافة اثنين آخرين من ميل من الإيثانول 20٪ إلى الأعمدة واستخدام ستيرر البلاستيك رقيقة جديدة لخلط الخرز في الإيثانول قبل نقل إلى أنبوب 50 مل لتخزين في أربع درجات مئوية. تجميع MCPA في فراغ متعددة مع لوحة جمع مفتوحة ومكبس المحاقن في جميع الأعمدة.
إزالة كل من المكبس حقنة من الصف الأمامي. إزالة طوقا المطاط من المكبس حقنة خمسة مل ومن ثم ثقب ثقب في المركز. ثم دفع الجزء السفلي من عمود مفتوح من خلال طوقا المطاط ثقب.
كرر هذه الخطوات وأدخل في الصف الأمامي من الأعمدة. تأكد من أن حبات Q sepharose مختلطة تماما. ومع طرف ماصة الأزرق الذي يتم قطع سنتيمترين من القاع، pipet 800 ميكرولتر من الخرز Q sepharose في الأعمدة المفتوحة.
مرة واحدة وقد استقر الخرز إلى الجزء السفلي من الأعمدة، والتبديل على مضخة فراغ ما يكفي لتشغيل الإيثانول 20٪ من خلال. غسل الأعمدة مرتين مع اثنين من ميل من 10 ملليمولار تريس. إيقاف تشغيل المضخة قبل أن يتم تشغيل المخزن المؤقت تريس من خلال لمنع تجفيف الراتنج.
يمكن التخلص من الجريان السطحي واستبداله بلوحات جمع من 48 بئرا. نقل جميع العينات لتنقيتها إلى أعمدة Q Sepharose في الصف الأول واستخدام ستيرر بلاستيكية رقيقة لخلط العينات والخرز لمدة دقيقتين تقريبا قبل تشغيل مضخة فراغ. تخزين أو تجميد التدفق من خلال لتحليل لاحق.
مع لوحة جمع مفتوحة، وغسل الأعمدة مرتين مع اثنين من ميل من 10 ملليمولار تريس. استبدل لوحات التجميع المفتوحة بلوحة من 96 بئرا. يمكن جمع الكسر elution الأول في الصف الأول أو في الصف الثاني.
إلى elute في الصف الثاني، وإزالة المكبس حقنة من هذه المواقف. نقل الأعمدة Q Sepharose في هذه المواقف ومن ثم وضع المكبس حقنة في الأعمدة المفتوحة في الصف الأول. Pipet ملليلتر واحد من تركيزات الملح الأولى في أعمدة س سيفاروز.
بدوره على المضخة وجمع elution. لجمع elution المقبل، وإزالة المكبس حقنة من المواقف التالية، ونقل الأعمدة Q Sepharose في هذه المواقف ومن ثم استبدال المكبس في المواقف السابقة. كرر هذه الخطوات لكل تركيز الملح المتعاقبة المستخدمة لealute.
تأكد من استخدام لوحة تجميع جديدة لكل أربعة إلوضوءات وأن كل لوحة تحمل علامة ويتم تخزينها. مع لوحات جمع مفتوحة، وغسل الأعمدة مع اثنين من مليون من أربعة كلوريد الصوديوم الضرس، 10 ملليمولار تريس. Pipet اثنين من ميل من 20 ٪ الإيثانول وتشغيل هذا من خلال حتى انها فقط فوق الخرز ومن ثم ختم الأعمدة للتخزين.
على سبيل المثال ، نجحت MCPA في تنقية 14 متحولا AbpSH3 في ظروف الإزالة بواسطة النيكل-NTA. ويمكن رؤية ملوث صغير في 25 كيلودالتون، على الرغم من أن البروتين لا يزال نقيا إلى حد كبير. تتم إزالة الملوثات الصغيرة التي شوهدت في ظروف الإزالة في الظروف الأصلية.
وقد ظهر هذا عندما تم تنقية 11 مجال SH3 مختلفة. وهذا يدل على أنه يمكن استخدام MCPA للمقارنة بين شروط تنقية. يمكن فصل AbpSH3 عن غالبية الملوثات عن طريق تنقية تبادل الأيونات من اللسات.
تم استرداد غلة جيدة من بروتين AbpSH3 النقي إلى حد كبير مع مختلف الملوثات الأوزان الجزيئية أعلى. وقد نجح تنقية العينات بعد النيكل-NTA باستخدام تبادل الأيونات مع MCPA في إزالة هذه الملوثات عالية الوزن. على الرغم من أنه لا يزال هناك تلوث طفيف ، إلا أن الكسور لا تزال نقية إلى حد كبير وأسفرت عن بيانات بيوفيزيائية جيدة باستخدام NMR ومقاايسات التشبع الكيميائي الحراري.
في الختام، تظهر نتائجنا أن فرضيتنا صحيحة وأن MCPA يمكن أن تنقي بنجاح كميات ملليغرام من البروتينات باستخدام تقنيات الكروماتوغرافيا المختلفة. يمكن تكوين نظام MCPA بطرق متعددة ضمن نفس الأشواط لتحسين ظروف التنقية. الإعداد بسيط ورخيص وسهل لتدريب المستخدمين عديمي الخبرة، وخاصة في المختبرات التي لا تنقية البروتينات بشكل روتيني.
