מערכת טיהור חלבונים חסכונית ורב-תכליתית בעלת תפוקה גבוהה באמצעות מתאם צלחת מרובה עמודות. היי, טיהור חלבונים הוא הכרחי לחקר מבנה החלבון ותפקודו. והוא משמש בדרך כלל בשילוב עם טכניקות ביופיזיות.
זה חשוב במיוחד בעידן של פרוטאומיקה תפקודית הדורשת ייצור חלבון בעל תפוקה גבוהה. שיערנו שמתאם צלחת מרובה עמודות, ה- MCPA, יכול לממשק עמודות כרומטוגרפיה מרובות של שרפים שונים עם לוחות רב-באר לטיהור מקבילי. עם מתאם זה, פיתחנו שיטה חסכונית ורב-תכליתית של טיהור חלבונים שניתן להשתמש בה תחת כוח המשיכה או יריב ואקום במהירות של מערכת אוטומטית.
כאן אנו מראים שיטה זו עבור כרומטוגרפיה זיקה ניקל כרומטוגרפיה חילופי יון. להרכיב את MCPA על ידי הנחת מחצלת איטום מנוקבת על צלחת טפטוף ארוכה, ולאחר מכן להכניס את מספר העמודים הרצוי לתוך החורים של מחצלת איטום. מניחים צלחות אוסף פתוחות בבסיס הסעפת וסוגרים עם החלק העליון של הסעפת.
חבר צינורות והנח את ה- MCPA המורכב עם עמודות בחלק העליון. פיפט 1.2 מיליון של פתרון ניקל-NTA לתוך העמודות. תוך כדי צנרת, ודא כי החרוזים נשארים מעורבים לחלוטין.
הפעל את המשאבה והפעל את האתנול 20% דרך העמודות לתוך צלחת האיסוף להלן. כבה את המשאבה ברגע שהנוזל עובר. יש להשליך את תכולת צלחת האיסוף לתוך קופסת פסולת.
הוסף שלושה אמצעי אחסון של EDTA לכל העמודות. הפעל את המשאבה והפעל את הנוזל. עכשיו לשטוף את העמודים עם שלושה כמויות של שף של 0.5 חוצץ נתרן הידרוקסידי טוחן.
לשטוף את העמודים עם ארבעה כמויות שרף של 100 מילימולר ניקל סולפט, אז 10 כמויות שרף של מים Mili-Q. אם עמודה פועלת לאט יותר, דחוף את הנוזל דרך עם בוכנה מזרק. יוצקים את תכולת צלחות האיסוף לתוך קופסת פסולת.
ואז לשטוף את העמודים פעמיים עם ארבעה כרכים שרף של 10 חיץ לשטוף imidazole מילימולאר ולרוקן את צלחות האוסף. אם דגימות מרובות מטוהרות, החלף את לוחות האיסוף הפתוחים בלוחות של 48 בארות. עם הוואקום כבוי, לטעון את lysates לתוך העמודים.
השתמש מערבל פלסטיק דק בעדינות לערבב את החרוזים ואת lysates בעמודה כדי למקסם את הכריכה. הפעל את המשאבה והפעל את הנוזל. אם עמודה נחסמת, העבר את תערובת lysate resin לעמודה עם מסנן חדש.
להקפיא את לוחות האיסוף כדי להכיל את הזרימה שלך. הוחלף בצלחת איסוף פתוחה ולאחר מכן לשטוף את העמודים עם תשעה כרכים שרף של 10 חיץ שטיפת imidazole מילימולאר. חזור על שלב זה ארבע או חמש פעמים.
כדי למנוע גלישה, מעת לעת לרוקן את צלחות הפסולת. החליפו את לוחות האיסוף הפתוחים בצלחת של 96 בארות, והבטיחו ש-A1 נמצא בפינה השמאלית העליונה. צנרת נפח אחד של רף של מאגר התרוממות רוח לתוך העמודות.
הפעל את הנוזל דרך ולבדוק את צלחת האיסוף כדי לוודא כי אין זיהום בין בארות. לדילול הבא, חזרו על השלבים הקודמים ואספו בצלחת איסוף טרייה. קח aliquot 50 מיקרוליטר של כל elution לניתוח טוהר וריכוז.
לאחר מכן, לשטוף את העמודים עם שני מיליליטר של 20% אתנול. מוסיפים עוד שני מיליון של 20% אתנול לעמודים ומשתמשים בתערובת הפלסטיק הדקה והרעננה כדי לערבב את החרוזים באתנול לפני שהם מעבירים לצינור של 50 מיליון לאחסון בארבע מעלות צלזיוס. להרכיב את MCPA בסעפת ואקום עם צלחת אוסף פתוחה בוכנות מזרק בכל העמודים.
הסר את כל בוכנות המזרק מהשורה הראשונה. הסר את אטם הגומי מ בוכנה מזרק חמישה מיליון ולאחר מכן לנקב חור במרכז. ואז לדחוף את החלק התחתון של עמוד פתוח דרך אטם גומי מנוקב.
חזור על שלבים אלה והוסף לשורה הראשונה של העמודות. ודאו שפירוזי ה-Q sepharose מעורבבים במלואם. ועם קצה פיפטה כחול כי הוא לחתוך שני סנטימטרים מלמטה, pipet 800 microliters של חרוזי Sepharose Q לתוך העמודים הפתוחים.
לאחר החרוזים התיישבו לתחתית העמודות, להפעיל את משאבת ואקום מספיק כדי להפעיל את 20% אתנול דרך. לשטוף את העמודים פעמיים עם שני מיליון של 10 tris מילימולאר. כבה את המשאבה רגע לפני שמאגר Tris עבר כדי למנוע את התייבשות בשרף.
ניתן להשליך את הנגר ולהחליף אותו בצלחות איסוף של 48 בארות. מעבירים את כל הדגימות לטיהור לעמודי Q Sepharose בשורה הראשונה ומשתמשים בוונדר פלסטיק דק כדי לערבב את הדגימות והחרוזים במשך כשתי דקות לפני הפעלת משאבת הוואקום. אחסן או הקפיא את הזרימה שלך לניתוח מאוחר יותר.
עם צלחת אוסף פתוחה, לשטוף את העמודים פעמיים עם שני מיליון של 10 tris מילימולאר. החליפו את לוחות האיסוף הפתוחים בצלחת של 96 באר. ניתן לאסוף את שבר ההקלה הראשון בשורה הראשונה או בשורה השניה.
כדי לרכך בשורה השנייה, להסיר את בוכנות מזרק מעמדות אלה. העבר את עמודות Q Sepharose למיקומים אלה ולאחר מכן מקם בוכנות מזרק בעמודות הפתוחות בשורה הראשונה. צינור מיליליטר אחד של ריכוזי המלח הראשונים לתוך עמודי Q Sepharose.
הפעל את המשאבה ולאסוף את elution. כדי לאסוף את elution הבא, להסיר את בוכנות מזרק מהמיקומים הבאים, להעביר את עמודות Q Sepharose לתוך עמדות אלה ולאחר מכן להחליף את הבוכנות בעמדות הקודמות. חזור על שלבים אלה עבור כל ריכוז מלח עוקב המשמש כדי elute.
ודא כי צלחת אוסף חדשה משמשת עבור כל ארבעה elutions וכי כל צלחת מסומנת ומאוחסנת. עם צלחות אוסף פתוחות, לשטוף את העמודים עם שני מיליון של ארבעה נתרן כלורי טוחנת, 10 tris מילימולאר. צנרת שני מיליון של 20% אתנול ולהפעיל את זה דרך עד שהוא רק מעל החרוזים ולאחר מכן לאטום את העמודות לאחסון.
כדוגמה, MCPA טיהר בהצלחה 14 מוטציות AbpSH3 בתנאים denaturing על ידי ניקל-NTA. מזהם קטן ניתן לראות ב 25 קילודאלטון, אם כי החלבון הוא עדיין טהור במידה רבה. המזהמים הקטנים שנראים בתנאים דאנטטוריים מוסרים בתנאים מקומיים.
זה הוצג כאשר 11 תחומי SH3 שונים טוהרו. זה מראה כי MCPA יכול לשמש להשוואה של תנאי טיהור. AbpSH3 ניתן להפריד מרוב המזהמים באמצעות טיהור חילופי יון מ lysates.
תשואות טובות של חלבון AbpSH3 טהור במידה ניכרת התאוששו עם מזהמים שונים משקלים מולקולריים גבוהים יותר. טיהור דגימות לאחר ניקל-NTA באמצעות חילופי יון עם MCPA הסיר בהצלחה אלה מזהמים במשקל גבוה. למרות שיש עדיין זיהום קל, השברים הם עדיין טהורים במידה רבה הניבו נתונים ביופיזיים טובים באמצעות NMR ו מבחני denaturation כימי תרמי.
לסיכום, התוצאות שלנו מראות כי ההשערה שלנו נכונה וכי MCPA יכול לטהר בהצלחה כמויות מיליגרם של חלבונים באמצעות טכניקות כרומטוגרפיה שונות. ניתן להגדיר את מערכת MCPA במספר דרכים באותן ריצות כדי למטב את תנאי הטיהור. ההתקנה היא פשוטה, זולה וקלה לאמן משתמשים לא מנוסים, במיוחד במעבדות שאינן מטהרות חלבונים באופן שגרתי.
