멀티 컬럼 플레이트 어댑터를 사용하여 경제적이고 다재다능한 고처리량 단백질 정제 시스템. 안녕하세요, 단백질 정제는 단백질 구조와 기능에 대한 연구에 필수적입니다. 그리고 그것은 일반적으로 생물 물리학 기술과 함께 사용.
이것은 높은 처리량 단백질 생산을 요구하는 기능성 proteomics의 시대에 특히 중요합니다. 우리는 다중 컬럼 플레이트 어댑터인 MCPA가 병렬 정화를 위해 다중 웰 플레이트와 다른 수지의 여러 크로마토그래피 컬럼을 인터페이스할 수 있다고 가설했습니다. 이 어댑터를 통해, 우리는 자동화 된 시스템의 속도로 중력 또는 진공 경쟁하에서 사용할 수있는 경제적이고 다양한 단백질 정제 방법을 개발했습니다.
여기서 우리는 니켈 친화성 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피를 위한 이 방법을 보여줍니다. 긴 드립 플레이트에 천공 밀봉 매트를 배치하여 MCPA를 조립한 다음 원하는 수의 열을 밀봉 매트구멍에 삽입합니다. 매니폴드 의 바닥에 열린 컬렉션 플레이트를 놓고 매니폴드의 상단으로 닫습니다.
튜빙을 부착하고 조립된 MCPA를 상단에 열로 놓습니다. 니켈-NTA 용액의 파이프 1.2 밀을 열로 넣습니다. 파이펫팅 하는 동안 구슬이 완전히 혼합 된 상태로 유지되도록하십시오.
펌프를 켜고 컬럼을 통해 아래 컬렉션 플레이트에 20% 에탄올을 실행합니다. 액체가 통과되면 펌프를 끕니다. 수거판의 내용을 폐기상자에 넣습니다.
모든 열에 EDTA 버퍼의 세 수지 볼륨을 추가합니다. 펌프를 켜고 액체를 통해 실행합니다. 이제 0.5 어금다 나트륨 수산화 나트륨 버퍼의 세 수지 볼륨으로 컬럼을 세척합니다.
100 밀리머 니켈 황산염의 4 개의 수지 부피, 밀리-Q 물의 10 수지 부피로 열을 씻어. 컬럼이 느리게 실행되는 경우 주사기 플런저로 액체를 밀어 넣습니다. 수거판의 내용물을 쓰레기 상자에 붓습니다.
그런 다음 10 밀리머 이미다졸 세척 버퍼의 네 수지 볼륨으로 열을 두 번 세척하고 수집 판을 비웁다. 여러 샘플이 정제되는 경우 열린 컬렉션 플레이트를 48웰 플레이트로 교체합니다. 진공을 끄면 용하를 열에 로드합니다.
얇은 플라스틱 교반기를 사용하여 구슬과 기둥의 용재를 부드럽게 혼합하여 바인딩을 최대화합니다. 펌프를 켜고 액체를 통해 실행합니다. 컬럼이 막히면 리자테 수지 혼합물을 새 필터가 있는 열로 옮기습니다.
유동을 포함하도록 컬렉션 플레이트를 동결합니다. 오픈 컬렉션 플레이트로 교체한 다음 10밀리머 이미다졸 워시 버퍼의 9개의 수지 부피로 컬럼을 세척합니다. 이 단계를 4~5회 반복합니다.
오버플로를 방지하려면 정기적으로 폐기물 플레이트를 비웁웁타입니다. 오픈 컬렉션 플레이트를 96웰 플레이트로 교체하여 A1이 왼쪽 상단 모서리에 있는지 확인합니다. 열에 용출 버퍼를 데스팅하는 한 수지 볼륨을 파이프화합니다.
액체를 통해 실행하고 우물 사이에 오염이 없는지 확인하기 위해 수집 판을 확인하십시오. 다음 희석을 위해 이전 단계를 반복하고 신선한 컬렉션 플레이트로 수집합니다. 순도 및 농도 분석을 위해 각 용출의 50 마이크로리터 알리쿼트(aliquot)를 복용하십시오.
다음으로, 20%에탄올의 2밀리리터로 컬럼을 씻는다. 기둥에 20%에탄올의 또 다른 두 개의 밀을 추가하고 신선한 얇은 플라스틱 교반기를 사용하여 에탄올의 구슬을 혼합한 후 섭씨 4도에서 보관할 수 있는 50mil 튜브로 옮길 수 있습니다. 모든 컬럼에 열린 컬렉션 플레이트와 주사기 플런지로 MCPA를 진공 매니폴드에 조립합니다.
앞줄에서 주사기 플런서를 모두 제거합니다. 5 마일 주사기 플런저에서 고무 개스킷을 제거한 다음 중앙에 구멍을 뚫습니다. 그런 다음 구멍이 뚫린 고무 개스킷을 통해 열린 열의 바닥을 밀어 넣습니다.
이러한 단계를 반복하고 열의 앞줄에 삽입합니다. Q 세파로즈 구슬이 완전히 혼합되어 있는지 확인합니다. 그리고 바닥에서 2센티미터 절단된 파란색 파이펫 팁으로 Q 세파로즈 구슬의 파이프 800 마이크로리터가 열린 기둥으로 들어갑니다.
구슬이 기둥 의 바닥에 정착되면, 진공 펌프를 통해 20 %의 에탄올을 실행할 만큼 충분히 켭돌. 10 밀리머 트리의 두 밀로 열을 두 번 세척합니다. Tris 버퍼가 실행되기 직전에 펌프를 끄면 수지 건조를 방지합니다.
유출을 폐기하고 48웰 컬렉션 플레이트로 교체할 수 있습니다. 모든 샘플을 첫 번째 행의 Q Sepharose 컬럼으로 정결시키고 얇은 플라스틱 교반기를 사용하여 진공 펌프를 켜기 전에 약 2 분 동안 샘플과 구슬을 혼합합니다. 나중에 분석을 위해 흐름 스루를 저장하거나 동결합니다.
오픈 컬렉션 플레이트를 통해 10밀리머 트리의 두 밀로 컬럼을 두 번 씻으세요. 오픈 컬렉션 플레이트를 96웰 플레이트로 교체합니다. 첫 번째 용출 분획은 첫 번째 행 또는 두 번째 행에서 수집할 수 있습니다.
두 번째 행에서 elute하려면 이러한 위치에서 주사기 플런서를 제거합니다. Q 세파로즈 열을 이러한 위치로 이동한 다음 주사기 플런저를 첫 번째 행의 열린 열에 배치합니다. 첫 번째 염 농도의 1 밀리리터를 Q 세파로즈 기둥에 넣습니다.
펌프를 켜고 용출을 수집합니다. 다음 용출을 수집하려면 다음 위치에서 주사기 플런서를 제거하고 Q Sepharose 열을 이러한 위치로 이동한 다음 이전 위치에서 플런처를 교체합니다. 엘루트에 사용되는 각 연속염 농도에 대해 이 단계를 반복하십시오.
4개의 elutions마다 새 컬렉션 플레이트가 사용되고 모든 플레이트에 레이블을 지정하고 저장되도록 합니다. 오픈 컬렉션 플레이트를 사용하여 4개의 어금니 나트륨 염화나트륨 2마일, 10밀리머 트리스로 컬럼을 세척합니다. 20%에탄올의 두 밀을 파이프로 고정하고 구슬 바로 위에 있을 때까지 이를 실행한 다음 열을 밀봉하여 보관합니다.
예를 들어, MCPA는 니켈-NTA에 의한 데칭 조건에서 14개의 AbpSH3 돌연변이를 성공적으로 정제했습니다. 단백질은 여전히 크게 순수하지만 작은 오염 물질은 25 킬로달톤에서 볼 수 있습니다. 데니튜징 조건에서 볼 수 있는 작은 오염 물질은 네이티브 조건에서 제거됩니다.
이는 11개의 다른 SH3 도메인이 정제되었을 때 나타났습니다. 이는 MCPA가 정화 조건의 비교에 사용될 수 있음을 보여준다. AbpSH3는 용액으로부터 정화를 통해 대부분의 오염 물질로부터 분리될 수 있다.
상당히 순수한 AbpSH3 단백질의 좋은 수확량은 다양한 더 높은 분자량 오염 물질로 회복되었다. MCPA와의 이온 교환을 사용하여 니켈-NTA 이후의 시료의 정제는 이러한 고중량 오염 물질을 성공적으로 제거했습니다. 여전히 약간의 오염이 있지만, 분수는 여전히 크게 순수하고 NMR 및 열 화학 적 분해 분석을 사용하여 좋은 생물 물리학 데이터를 산출했다.
결론적으로, 우리의 결과는 우리의 가설이 정확하고 MCPA가 다른 크로마토그래피 기술을 사용하여 단백질의 밀리그램 양을 성공적으로 정화할 수 있다는 것을 보여줍니다. MCPA 시스템은 정화 조건을 최적화하기 위해 동일한 실행 내에서 여러 가지 방법으로 구성할 수 있습니다. 이 설정은 간단하고 저렴하며 경험이 부족한 사용자를 훈련하기 쉽고, 특히 단백질을 일상적으로 정화하지 않는 실험실에서 쉽게 훈련할 수 있습니다.
