Çok sütunlu plaka adaptörü kullanan ekonomik ve çok yönlü yüksek verimli protein arıtma sistemi. Merhaba, protein saflaştırma protein yapısı ve fonksiyonu çalışması için zorunludur. Ve genellikle biyofizik tekniklerle birlikte kullanılır.
Bu, özellikle yüksek verimli protein üretimi gerektiren fonksiyonel proteomik çağda önemlidir. Çok sütunlu bir plaka adaptörü olan MCPA'nın, paralel saflaştırma için çok kuyulu plakalarla farklı reçinelerin birden fazla kromatografi sütununu arayüzleyebileceği varsayımını yaptık. Bu adaptör ile otomatik bir sistem hızında yerçekimi veya vakum rakibi altında kullanılabilecek ekonomik ve çok yönlü bir protein arıtma yöntemi geliştirdik.
Burada nikel benzeşim kromatografisi ve iyon değişim kromatografisi için bu yöntemi gösteriyoruz. Uzun bir damlama plakasına delinmiş bir sızdırmazlık paspası yerleştirerek MCPA'yı monte edin, ardından istediğiniz sayıda sütunu sızdırmazlık paspasının deliklerine yerleştirin. Manifoldun tabanına açık bir toplama plakası yerleştirin ve manifoldun üst kısmıyla kapatın.
Boruyu takın ve monte edilmiş MCPA'yı üstte sütunlarla yerleştirin. Sütunlara nikel-NTA çözeltisinin pipet 1.2 mil. Pipetleme yaparken, boncukların tamamen karışık kalmasını sağlayın.
Pompayı çalıştırın ve %20 etanol'ü kolonlardan geçirip aşağıdaki toplama plakasına doğru çalıştırın. Sıvı çalıştırılıyorsa pompayı kapatın. Toplama plakasının içeriğini bir atık kutusuna atın.
Tüm sütunlara üç reçine birimi EDTA arabelleği ekleyin. Pompayı açın ve sıvıyı çalıştırın. Şimdi sütunları 0,5 molar sodyum hidroksit tamponu üç reçine hacmi ile yıkayın.
Sütunları dört reçine hacminde 100 milimolar nikel sülfat, ardından 10 reçine hacmi Mili-Q su ile yıkayın. Bir sütun daha yavaş çalışıyorsa, sıvıyı şırınna pistonu ile itin. Toplama plakalarının içeriğini bir atık kutusuna dökün.
Daha sonra sütunları 10 milimoler imidazol yıkama tamponu dört reçine hacmi ile iki kez yıkayın ve toplama plakalarını boşaltın. Birden fazla numune saflaştırılıyorsa, açık toplama plakalarını 48 kuyu plakalarıyla değiştirin. Vakum kapalıyken, lisatları sütunlara yükleyin.
Bağlamayı en üst düzeye çıkarmak için sütundaki boncukları ve lysates'i hafifçe karıştırmak için ince bir plastik karıştırıcı kullanın. Pompayı açın ve sıvıyı çalıştırın. Bir sütun engellenirse, lisat reçine karışımını taze filtreli bir sütuna aktarın.
Akışlarınızı içerecek şekilde toplama plakalarını dondurun. Açık bir toplama plakası ile değiştirildi ve ardından sütunları 10 milimolar imidazol yıkama tamponunun dokuz reçine hacmiyle yıkayın. Bu adımı dört veya beş kez tekrarlayın.
Taşmasını önlemek için atık plakalarını periyodik olarak boşaltın. Açık toplama plakalarını 96 kuyulu bir plaka ile değiştirerek A1'in sol üst köşede olmasını sağlayın. Sütunlara bir denatüre elution arabelleği bir reçine hacmi pipet.
Sıvıyı çalıştırın ve kuyular arasında kirlenme olmadığından emin olmak için toplama plakasını kontrol edin. Bir sonraki seyreltme için, önceki adımları tekrarlayın ve taze bir toplama plakasında toplayın. Saflık ve konsantrasyon analizi için her bir elutiondan 50 mikroliter aliquot alın.
Daha sonra, sütunları iki mililitre% 20 etanol ile yıkayın. Sütunlara iki milyon % 20 etanol daha ekleyin ve dört santigrat derecede depolama için 50 mil tüpe aktarmadan önce etanoldeki boncukları karıştırmak için taze ince plastik karıştırıcıyı kullanın. MCPA'yı vakum manifoldunda açık bir toplama plakası ve tüm sütunlarda şırıng pistonları ile monte edin.
Tüm şırınna pistonlarını ön sıradan çıkarın. Lastik contayı beş mil şırınna pistonundan çıkarın ve ardından ortada bir delik açın. Daha sonra açık bir sütunun altını delinmiş kauçuk contadan geçirin.
Bu adımları yineleyin ve sütunların ön satırına ekleyin. Q sepharose boncuklarının tamamen karıştığından emin olun. Ve alttan iki santimetre kesilen mavi pipet ucuyla, Q sepharose boncuklarının 800 mikrolitresini açık sütunlara borulayın.
Boncuklar kolonların altına yerleştikten sonra, vakum pompasını% 20 etanolden geçecek kadar çalıştırın. Sütunları iki milyon 10 milimolar Tris ile iki kez yıkayın. Reçinenin kurumasını önlemek için Tris tamponu çalışmadan hemen önce pompayı kapatın.
Runoff atılabilir ve 48 kuyulu bir toplama plakası ile değiştirilebilir. Saflaştırılacak tüm numuneleri ilk sıradaki Q Sepharose sütunlarına aktarın ve vakum pompasını açmadan önce numuneleri ve boncukları yaklaşık iki dakika karıştırmak için ince bir plastik karıştırıcı kullanın. Daha sonraki analizler için akışınızı saklayın veya dondurun.
Açık bir toplama plakası ile sütunları iki milyon 10 milimolar Tris ile iki kez yıkayın. Açık toplama plakalarını 96 kuyu plakası ile değiştirin. İlk elution kesir ilk satırda veya ikinci satırda toplanabilir.
İkinci sırada elute etmek için şırındıcı pistonları bu konumlardan çıkarın. Q Sepharose sütunlarını bu konumlara getirin ve sonra şırındıcı pistonları ilk satırdaki açık sütunlara yerleştirin. Q Sepharose sütunlarına ilk tuz konsantrasyonlarının bir mililitresini borulayın.
Pompayı açın ve elution'ı toplayın. Bir sonraki elution toplamak için şırınna pistonlarını bir sonraki konumlardan çıkarın, Q Sepharose sütunlarını bu konumlara getirin ve ardından pistonları önceki konumlarda değiştirin. Elute etmek için kullanılan her ardışık tuz konsantrasyonu için bu adımları tekrarlayın.
Her dört elution için yeni bir toplama plakası kullanıldığından ve her plakanın etiketlenerek depolandığından emin olun. Açık bir toplama plakası ile sütunları iki milyon dört azı dişi sodyum klorür, 10 milimolar Tris ile yıkayın. %20 etanolden iki milyon boru ve boncukların hemen üzerine çıkana kadar bunu çalıştırın ve sonra sütunları depolama için kapatın.
Örnek olarak, MCPA 14 AbpSH3 mutantını beş sent-NTA ile denatüre koşullarında başarıyla arındırmıştır. Protein hala büyük ölçüde saf olmasına rağmen, 25 kilodaltonda küçük bir kirletici görülebilir. Denatüre koşullarında görülen küçük kirleticiler doğal koşullarda çıkarılır.
Bu, 11 farklı SH3 etki alanı temizlendiğinde gösterildi. Bu, MCPA'nın saflaştırma koşullarının karşılaştırılması için kullanılabileceğini göstermektedir. AbpSH3, iyon değişimi saflaştırması yoluyla kirleticilerin çoğundan lysates'ten ayrılabilir.
Önemli ölçüde saf AbpSH3 proteininin iyi verimleri, çeşitli yüksek moleküler ağırlıklardaki kirleticilerle geri kazanıldı. MCPA ile iyon değişimi kullanılarak nikel-NTA sonrası numunelerin saflaştırılması, bu yüksek ağırlıkta kirleticileri başarıyla çıkarmıştır. Hala hafif bir kontaminasyon olmasına rağmen, fraksiyonlar hala büyük ölçüde saftır ve NMR ve termal kimyasal denatürasyon testlerini kullanarak iyi biyofiziksel veriler elde etmişlerdir.
Sonuç olarak, sonuçlarımız hipotezimizin doğru olduğunu ve MCPA'nın farklı kromatografi teknikleri kullanarak miligram protein miktarlarını başarıyla saflaştırabileceğini göstermektedir. MCPA sistemi, saflaştırma koşullarını optimize etmek için aynı çalıştırmalar içinde birden çok şekilde yapılandırılabilir. Kurulum basit, ucuz ve deneyimsiz kullanıcıları eğitmek kolaydır, özellikle proteinleri rutin olarak arındırmayan laboratuvarlarda.
