يستخدم هذا البروتوكول CRISPR-Cas9 لإنشاء خطوط خروج المغلوب أو خروج المغلوب. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه من السهل والكفاءة لمتابعة خاصة بالنسبة للباحثين المبتدئين. بالنسبة لـ الخلايا، قم بمعالجة الخلايا المستزرعة بين عشية وضحاها بمليلترين بنسبة 0.25٪ لتربيتين EDTA لكل صفيحة عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين.
عندما تكون الخلايا قد رفعت من قيعان لوحة، تحييد رد فعل انزيمي مع ملليلتر اثنين من خلية ثقافة المتوسطة، ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تثبيت بيليه في خمسة ملليلتر من خلية جديدة ثقافة المتوسطة للعد. ثم البذور 1.8 مرات 10 إلى الخلايا الخامسة في بئر واحد من 24 بئرا لوحة ثقافة الأنسجة لثقافة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
بالنسبة لtransfection من الخلايا، إضافة حجم مناسب من المزيج transfection التي تحتوي على التركيز المناسب من البلازميد CRISPR إلى الحجم المناسب من كاشف transfection، وفقا للتصميم التجريبي وتعليمات الشركة المصنعة. بعد احتضان مزيج transfection في درجة حرارة الغرفة لفترة الموصى بها من الزمن، إضافة الحل إلى الخلايا بطريقة قطرة الحكمة. ثم تدور بلطف لوحة لخلط ووضع لوحة في حاضنة درجة مئوية مرطبة 37 مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
في نهاية transfection، إضافة 150 ميكرولترات من تريبسين-EDTA لفصل الخلايا كما أظهرت للتو وجمع الخلايا المنفصلة عن طريق الطرد المركزي. Resuspend بيليه في مصل البقر 2٪ الجنين في PBS وتصفية الخلايا من خلال 30 ميكرومتر شبكة مصفاة في خلية خمس ملليلتر تنشيط الفلورانس الفرز، أو أنبوب FACS. ثم استخدام الخلايا غير المُزوَّرة لتعيين بوابة تحكم سلبية على مقياس التدفق وفرز الخلايا المُزوّرة وفقاً لعلامة الفلورسنت على الـ CRISPR plasmid المستخدم في عملية نقل العدوى إلى أنبوب يحتوي على 100 ميكرولترات من خلية متوسطة.
عندما تم جمع جميع الخلايا المصابة، بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في السرعة القصوى وإعادة تعليق بيليه في 300 ميكرولترات من خلية ثقافة المتوسطة. بذور 200 ميكرولتر من الخلايا في بئر واحد من لوحة ثقافة الأنسجة 24 جيدا والسماح للخلايا لاسترداد لبضعة أيام في حاضنة 37 درجة مئوية. بيليه المتبقية 100 ميكرولترات من الخلايا فرزها في السرعة القصوى لمدة خمس دقائق واستخراج الحمض النووي الجينومي من بيليه الناتجة وفقا لبروتوكولات استخراج الحمض النووي القياسية.
بعد ذلك ، إضافة 10 ميكرولترات من البوليميراز العازلة تفاعل سلسلة ، وميكر واحد من مزيج ديوكسينويكليوتيد ، 2.5 microliters من التمهيدي العكسي المحدد من قبل المستخدم ، 0.5 ميكرولترات من بوليميراز الحمض النووي ، واثنين إلى خمسة ميكرولترات من قالب الحمض النووي الجينوم المستخرج وكميات كافية من المياه المقطرة المزدوجة لتحقيق التفاعل إلى حجم النهائي من 50 ميكرولتر. تشغيل الخليط على دورة حرارية وحل التفاعل على هلام agarose 2٪ باستخدام 1X TAE العازلة وفقا للبروتوكولات القياسية. استخدام مشرط نظيفة، حادة لاستخلاص من سلسلة البوليميراز رد فعل المنتج وتنقية الحمض النووي باستخدام مجموعة استخراج هلام وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
قياس تركيز المنتج باستخدام مقياس الطيفي في امتصاص 260 نانومتر. إعداد مزيج تحليلي يحتوي على 200 نانوغرام من الحمض النووي المعزول، واثنين من ميكرولترات من T7 endonuclease I العازلة رد فعل، وكميات كافية من المياه المقطرة المزدوجة لتحقيق الحجم النهائي للخليط إلى 19 ميكرولترات. Reanneal تفاعل البوليميراز سلسلة المنتج في دورة حرارية في المعلمات المشار إليها وخلط خمس وحدات من T7 endonuclease الأول مع المنتج reannealed لاحتضان 50 دقيقة في 37 درجة مئوية.
في نهاية الحضانة، حل الحمض النووي هضم على هلام agarose 2.5٪ باستخدام 1X TAE العازلة، وصورة الجل على نظام التصوير هلام المناسبة. افتح صورة الجل في ImageJ وارسم مربع مستطيل حول النطاق أقرب إلى حده قدر الإمكان. انقر فوق تحليل، ثم قم بتعيين القياسات، مع التأكيد على أن المساحة، والقيمة الرمادية المتوسطة، وخيارات الكثافة المتكاملة قد تم تحديدها.
انقر فوق موافق، وحدد تحليل، وقياس. متوسط، أو قيمة كثافة كثافة الخام، يدل على كثافة الفرقة. عندما تبدأ الخلايا المُعدة للثقافة في أن تصبح اُكتبسة، افصلها بالتريبسين-EDTA، كما هو موضح، وبذّر الخلايا بشكل متفرق في طبق ثقافة الأنسجة 100 ملليمتر للسماح بمساحة كافية للمستعمرات الفردية للنمو قبل إعادة الخلايا إلى حاضنة ثقافة الخلية.
عندما تبدأ المستعمرات في التشكل، استخدم المجهر مع التكبير 4 X لاختيار المستعمرات الفردية لنقلها إلى آبار فردية من لوحة 24-well تحتوي على 500 ميكرولترات من خلية ثقافة المتوسطة في بئر. الحرص على أن تلميح الخاص بك لا تلمس المستعمرات المحيطة بها لمنع خلط المستعمرات داخل الآبار الفردية أو اختيار من منطقة من نمو مستعمرة متفرق. عندما تم اختيار جميع المستنسخين ، ضع اللوحة في حاضنة ثقافة الخلية حتى تصبح الثقافات التقاء.
كما البلازميدات غير المهضومة هي فائقة ملفوف، فإنها تميل إلى تشغيل أسرع من نظرائهم خطي. لتحديد ما إذا كان قد تم استنساخ oligonucleotides بنجاح في العمود الفقري كريسبر plasmid، يتم تنفيذ PCR مستعمرة ويتم تلقيح المستنسخات الإيجابية قبل استخراج البلازميدات وإرسالها لتسلسل سانجر. يمكن تصور إشارة الفلورسنت بسهولة تحت المجهر عند التسليم الناجح للـ بلازميدات ، مما يسمح للخلايا المصابة بالعدوى أن يتم فرزها حسب قياس التدفق.
يتم إجراء فحص T7 endonuclease I للتحقق من كفاءة الانقسام من الحمض النووي الجينومي ، كما تم حسابه من شدة الفرق الملاحظة على هلام agarose. بالإضافة إلى ذلك، إذا تم تصميم تجربة مستندة إلى إصلاح موجهة من homology لدمج موقع تقييد في موضع الهدف، يمكن إجراء تحليل تعدد أشكال طول جزء القيد مع إنزيم تقييد المقابلة. لمزيد من التحقق من صحة أن جين ترميز البروتين قد تم تعطيل بنجاح، يمكن تنفيذ لطخة الغربية لضمان عدم وجود البروتين المستهدف.
فرز الخلايا بعد transfection يزيل الخلايا دون البلازميدات المدمجة، وبالتالي زيادة النسبة المئوية للخلايا فحص في مراحل لاحقة كما وجود خروج المغلوب أو ضرب في الجينات. مع تطور هذه التقنية ، ونحن الآن قادرون على إنتاج خطوط الخلايا خروج التدريجي لدراسة وظيفة الجينات وخطوط الخلايا ضرب في نموذج أمراض معينة لفهم آلياتها.
