مقارنة الوصول إلى خلف الصفاق عبر الصفاق والثقب عن طريق الجلد لنمذجة تنكس القرص القطني في الأرانب

قارن هذا البروتوكول الثقوب عن طريق الجلد وعبر خلف الصفاق في نموذج تنكس القرص الفقري للأرانب (IVDD). كلتا الطريقتين تحفزت IVDD. ومع ذلك ، أدى النهج عبر خلف الصفاق إلى تغييرات أكثر شمولا وانخفاض معدل الوفيات.

تقارن هذه الدراسة فعالية طريقتين لإحداث تنكس القرص الفقري (IVDD) في الأرانب: ثقب الحلقة الليفية عن طريق الجلد وعبر خلف الصفاق. تم تعيين خمسة عشر من الأرانب البيضاء النيوزيلندية السليمة بشكل عشوائي إلى ثلاث مجموعات: الزائفة ، والثقب عن طريق الجلد ، والثقب عبر خلف الصفاق. تم إجراء تقييم شامل ، بما في ذلك معدلات الوفيات ، والتقييمات المورفولوجية والنسيجية ، والتصوير الإشعاعي ، وتحليل المؤشرات الحيوية ، لضمان مقارنة دقيقة ومفصلة بين الطريقتين. توضح النتائج أن كلتا تقنيتي الثقب نجحتا في تحفيز IVDD في نموذج الأرانب. ومع ذلك ، أدى النهج عبر خلف الصفاق إلى تغيرات تنكسية أكثر وضوحا في الأقراص الفقرية مع الحفاظ على معدل وفيات أقل بكثير مقارنة بالطريقة عن طريق الجلد. تسلط هذه النتائج الضوء على مزايا النهج عبر خلف الصفاق في نمذجة IVDD. تقدم هذه الدراسة رؤى قيمة حول إنشاء نماذج IVDD وتضع أساسا للتحقيقات المستقبلية في استراتيجيات العلاج الفعالة لآلام أسفل الظهر ، مما يؤدي في النهاية إلى تحسين نتائج المرضى.

على مدى العقود القليلة الماضية ، ظهرت آلام أسفل الظهر (LBP) كأهم اضطراب عضلي هيكلي يؤثر على نوعية الحياة¹. أصبح الليرة اللبنانية مصدر قلق متزايد الأهمية للصحة العامة ، حيث يفرض عبئا اقتصاديا كبيرا على المجتمع بسبب العمالة المفقودة والنفقات الطبية الإضافية^2،3. في الولايات المتحدة وحدها ، تتجاوز التكاليف المباشرة وغير المباشرة المرتبطة بالليرة اللبنانية 100 مليار دولار سنويا ، بما في ذلك النفقات الطبية وخسائر الدخل وخسائر^{العمالة.} غالبا ما يحدث LBP بسبب تنكس القرص الفقري (IVDD) ^5،6،7،8. نظرا لارتفاع معدل انتشار LBP وتأثيره الاقتصادي ، فإن النمذجة الدقيقة ل IVDD أمر بالغ الأهمية لاستكشاف استراتيجيات العلاج.

لفهم الفيزيولوجيا المرضية ل IVDD وتقييم استراتيجيات العلاج ، تم تطوير واستخدام العديد من النماذج الحيوانية قبل السريرية في الجسم الحي ⁹. تم استخدام طرق متعددة في هذه النماذج للحث على تنكس القرص ، بما في ذلك إصابة القرص الجراحي أو الكيميائي ، والإجهاد الميكانيكي غير الجراحي ، والتعديل الجيني ، والحدوث الطبيعي¹⁰. من بين هذه الطرق ، تمثل الإصابة الجراحية ما يصل إلى 64.9٪ من تحريض IVDD ، مع كون ثقب الإبرة هو التقنية الجراحية الأساسية¹¹. يتميز نموذج ثقب الإبرة بسهولة إنشائه والحد الأدنى من الضرر الذي يلحق بحيوانات التجارب. تشمل مناهج ثقب الإبرة الشائعة الوصول المفتوح خلف الصفاق إلى مساحة القرص القطني والثقب الخلفي الوحشي عن طريق الجلد. يمكن تحديد عمق الإدخال باستخدام المراقبة الشعاعية أو طول الإبرة. والجدير بالذكر أن النهج عن طريق الجلد قد يقلل من تلف الأنسجة علاجي المنشأ مقارنة بالطرق الجراحية المفتوحة ، بينما يوفر الوصول إلى خلف الصفاق فائدة ميزات التصور المباشر التي لم تتم مقارنتها كميا في الأدبيات السابقة. بينما بحثت الدراسات في آثار استخدام الإبر بأقطار مختلفة¹² وثقب أقراص^{مختلفة 10} على تحريض IVDD ، فإن الدراسات المقارنة التي تركز على مناهج ثقب الإبرة المختلفة لا تزال محدودة. يوفر نموذج الأرانب المختار فائدة خاصة للباحثين الذين يحتاجون إلى دراسات طولية فعالة من حيث التكلفة مع تقييمات تصوير متكررة ، نظرا لتشابهه التشريحي مع الأقراص البشرية ومزاياه على نماذج القوارض من حيث الحجم والهيكل¹³.

في هذه الدراسة ، تم إنشاء نماذج الأرانب من IVDD القطني باستخدام طريقتين: الوصول المفتوح خلف الصفاق لثقب مساحة القرص القطني والبزل الخلفي الجانبي عن طريق الجلد. تم تحليل مجموعة شاملة من مقاييس النتائج ، بما في ذلك التغيرات المورفولوجية والنسيجية والإشعاعية.

التزمت الإجراءات التجريبية الحيوانية بصرامة بدليل رعاية واستخدام المختبر الصادر عن المعاهد الوطنية للصحة وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة أخلاقيات التجريبي بجامعة تشنغدو للطب الصيني التقليدي (رقم الموافقة على الأخلاقيات: 2021-23). تم استخدام خمسة عشر أرنبا نيوزيلندا أبيض سليما يبلغ من العمر 4 أشهر ونظيفا (2.25 كجم ± 0.25 كجم) ، بما في ذلك سبعة ذكور وثماني إناث. تم إيواء في بيئة بدرجة حرارة الغرفة تتراوح بين 23 درجة مئوية ± 3 درجات مئوية ورطوبة تتراوح بين 60٪ ± 10٪ تقريبا لمدة أسبوع واحد من التكيف ، مع حرية الوصول إلى الماء والغذاء. قبل التجربة ، تم تعيين الأرانب ال 15 بشكل عشوائي إلى واحدة من ثلاث مجموعات: المجموعة الوهمية (المجموعة أ) ، ومجموعة البزل الليفي الحلقي عن طريق الجلد (المجموعة ب) ، ومجموعة ثقب الحلقة الليفية الفضائية عبر الصفاق (المجموعة ج) ، مع خمسة أرانب في كل مجموعة. تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. إنشاء نموذج IVDD للأرانب عن طريق ثقب الحلقة الليفية عن طريق الجلد

ملاحظة: تم إنشاء نموذج IVDD للأرانب باستخدام طريقة البزل الحلقي الليفي عن طريق الجلد. اتبع الإجراء طريقة نمذجة الثقب الموصوفة بواسطة Luo TD et ^al.14 وتم إجراؤه تحت توجيه الأشعة السينية (الشكل 1).

1. تحضير الأرنب.
   1. قم بصيام الأرانب لمدة 24 ساعة قبل الجراحة ، مع ضمان الوصول إلى الماء.
   2. يتم تطبيق التخدير عن طريق الحقن الوريدي بنسبة 3٪ من البنتوباربيتال الصوديوم (1.3 مل/كغ) في وريد الأذن (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا).
   3. تأكد من التخدير الناجح عن طريق التحقق من عدم الحركة ، واسترخاء العضلات ، ونقص منعكس القرنية ، وغياب الاستجابة للألم.
2. ضع ووضع علامة على الأرنب.
   1. ثبت الأرنب في وضع الانبطاح على لوحة التثبيت.
   2. حلق وإعداد المنطقة الجراحية ، ثم تحسس معالم العظام.
   3. المس المعالم العظمية على ظهر أسفل ظهر الأرنب. حدد موقع الضلع السفلي على الأرنب ، والذي يتوافق عادة مع الفقرة فوق العملية الشوكية L1 مباشرة.
   4. حدد العملية الشائكة أسفل هذه الفقرة مباشرة لتحديد العملية الشائكة L1.
   5. حدد أعلى نقاط القمم الحرقفية ، تقريبا مع الفقرة L6.
   6. تتبع من العملية الشائكة L1 لتحديد كل عملية شائكة بالتتابع وصولا إلى L7.
   7. استخدم قلم وسم لتمييز العملية الشائكة L1 بوضوح على ظهر الأرنب.
   8. انتقل إلى العملية الشائكة التالية وقم بتمييزها على أنها L2.
   9. استمر في وضع علامة على كل عملية شائكة لاحقة على أنها L3 و L4 و L5 و L6 و L7. تأكد من أن كل علامة مميزة وبترتيب تسلسلي لتحديد الهوية بوضوح.
3. حدد موقع الثقب وحدد موقعه.
   1. جس العمليات المستعرضة وحدد موقع نقطة المنتصف بين الأطراف البعيدة ل L5 و L6.
   2. ضع علامة على هذه النقطة واستعد لإدخال إبرة الثقب فوقها حوالي 1 سم.
4. أدخل إبرة الثقب.
   1. أمسك إبرة الثقب أفقيا وأدخلها باتجاه الأرض ، مما يؤدي إلى كسر الجلد.
   2. تقدم الإبرة للوصول إلى الجسم الفقري L4 وتحقق من الوضع الصحيح تحت توجيه الأشعة السينية.
   3. قم بإمالة الإبرة رأسية قليلا بزاوية حوالي 20 درجة باتجاه القرص الفقري L4-5. ثقب القرص وتأكيد دقة الثقب تحت فحص الأشعة السينية.
5. إجراء ثقوب القرص.
   1. ثقب الحلقة الليفية بدقة ، باستخدام توجيه الأشعة السينية إذا لزم الأمر.
   2. كرر عملية الثقب للأقراص الفقرية L2-3 و L3-4 ، مع ثقب كل مرة.
   3. حافظ على عمق ثقب يبلغ حوالي 5 مم مع وقت مكوث يبلغ 5 ثوان لكل قرص.
6. رعاية ما بعد العملية
   1. تطهير وتضميد موقع البزل.
   2. حقن البنسلين في العضل في الألوية الكبرى بجرعة 40,000 U لكل أرنب يوميا لمدة 3 أيام.
      ملاحظة: اضبط النهج إذا واجهت الإبرة أنسجة صلبة. استخدم توجيه الأشعة السينية للثقب الدقيق. راقب تعافي الأرنب وقدم الرعاية المناسبة.

2. إنشاء نموذج IVDD للأرانب عن طريق ثقب الحلقة الليفية عبر الفضاء خلف الصفاق

ملاحظة: تم إنشاء نموذج IVDD للأرانب باستخدام طريقة ثقب الحلقة الليفية الليفية عبر خلف الصفاق¹² (الشكل 2).

1. قم بصيام الأرانب لمدة 24 ساعة قبل الجراحة ، مما يسمح بالوصول إلى الماء.
2. تخدير الأرنب عن طريق حقن 3٪ من الصوديوم البنتوباربيتال (1.3 مل / كغ) في وريد الأذن (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا).
3. تأكد من أن الأرنب غير متحرك ، مع عضلات مسترخية ، ولا يوجد رد فعل للقرنية ، ولا استجابة للألم للضغط لتأكيد التخدير الناجح.
4. ثبت الأرنب في وضع الانبطاح على لوحة التثبيت.
5. حلق وإعداد المنطقة الجراحية.
6. ملامح العظام ، بمناسبة العمليات الشائكة القطنية L1-L7 على ظهر أسفل الظهر للأرنب بقلم وسم.
7. أعد ملامسة العمليات العرضية للأرنب لتحديد موقع الشق الجراحي.
8. ضع ستارة معقمة وقم بتطهير الجلد المحلي لضمان ظروف معقمة.
9. استخدم نهجا خلف الصفاق الخلفي لتشريح اللفافة والعضلات طبقة تلو الأخرى ، مما يؤدي إلى تعريض الجانب الجانبي للقرص الفقري القطني.
10. ثقب الحلقة الليفية بإبرة ثقب على عمق حوالي 5 مم ووقت سكون 5 ثوان.
11. قم بثقب الأقراص الفقرية L3-4 و L4-5 و L5-6 بالتتابع ، مما يضمن ثقب كل قرص مرة واحدة فقط.
12. خياطة الأنسجة طبقة تلو الأخرى باستخدام خيط خياطة قطرها 0.25 مم.
13. تطهير وضمادة موقع البزل بعد النمذجة.
14. حقن البنسلين في العضل في الألوية الكبيرة للأرنب يوميا بجرعة 40,000 U لكل أرنب لمدة ثلاثة أيام متتالية.
    ملاحظة: استخدم البنسلين بمواصفات 800,000 وحدة / قارورة ورقم الموافقة 140051251 الأدوية البيطرية.

3. اختيار نماذج IVDD وتقييم النتائج

1. تقييم الوفيات والحالة العامة للأرانب
   1. راقب الأرانب أسبوعيا لتحديد البقاء على قيد الحياة وتسجيل الحالة العامة ، بما في ذلك الحالة العقلية وأنماط النشاط وتناول الطعام والماء ، بالإضافة إلى إخراج البراز والبول.
   2. سجل الملاحظات بدقة ولاحظ أي تغييرات في الحالة.
2. مراقبة وزن الأرانب
   1. سجل وزن جسم الأرانب قبل وبعد إنشاء النموذج ، وكذلك قبل جمع الأنسجة.
   2. تأكد من تسجيل الوزن بدقة ولاحظ أي تغييرات مهمة.
3. التقييم الإشعاعي
   1. احصل على تصوير رنين مغناطيسي سهمي 1.5T T2 لتسلسل النبات الفقري القطني بالكامل لكل أرنب أبيض قبل وبعد 4 أسابيع من إنشاء النموذج.
   2. لاحظ مدى تنكس القرص الفقري.
   3. قم بإجراء تقييم كمي لتنكس القرص الفقري باستخدام نظام تصنيف Pfirrmann المعدل الذي اقترحه Griffith et ^al.15. اطلب من ثلاثة أخصائيي أشعة مستقلين أعمى تقييم تسلسلات التصوير بالرنين المغناطيسي المرجحة ب T2 وفقا للمعايير المعمول بها: ارتفاع القرص ، وشدة إشارة النواة اللبية ، وسلامة الليف الحلقي.
   4. تحديد الدرجات النهائية من خلال الإجماع عندما تتجاوز التناقضات مستوى صف واحد. قم بإجراء جميع التقييمات باستخدام برنامج عرض DICOM القياسي مع إعدادات العرض المعايرة.
4. التقييم النسيجي المرضي والتسجيل
   1. قم بالقتل الرحيم للأرانب بعد 4 أسابيع من النمذجة باستخدام جرعة زائدة في الوريد من الصوديوم البنتوباربيتال (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا) ، ثم قم بحصاد الأقراص الفقرية L2-L3 و L3-L4 و L4-L5 بسرعة على الجليد¹⁵.
   2. قم بتثبيت أقراص L2-L3 في 4٪ بارافورمالدهيد وقم بتخزين العينات المتبقية عند -80 درجة مئوية.
   3. اغمر الأقراص الثابتة في محلول مزيل للتكلس ، مثل 10٪ EDTA ، مما يضمن الغمر الكامل. قم بتغيير محلول إزالة الكلس كل 2-3 أيام للحفاظ على الفعالية.
   4. راقب عملية إزالة الكلس بانتظام حتى يتم تحقيق إزالة الكلس الكامل ، والتي قد تستغرق من عدة أيام إلى أسبوع ، اعتمادا على حجم القرص وسمكه.
   5. اشطف الأقراص منزوعة الكلس جيدا بالماء الجاري لإزالة أي آثار لمحلول إزالة الكلس.
   6. قم بتجفيف الأقراص عن طريق غمرها في سلسلة من محاليل الإيثانول المتدرجة ، بدءا من 70٪ من الإيثانول وزيادة تدريجية إلى 100٪ من الإيثانول. قم بإجراء كل خطوة من خطوات الجفاف لمدة 1-2 ساعة لكل درجة.
   7. تسلل الأقراص المجففة بشمع البارافين (نقطة الانصهار 56-58 درجة مئوية) لمدة 2 ساعة على الأقل ، مما يضمن التسلل الكامل.
   8. قم بتضمين الأقراص المخللة في كتلة شمع ، ووضعها للتقسيم. اترك كتلة الشمع تبرد وتتصلب تماما.
   9. قسم الأقراص المدمجة إلى شرائح رفيعة وموحدة (5-10 ميكرومتر) باستخدام ميكروتوم. قم بتركيب الأقسام على شرائح زجاجية لمزيد من التحليل ، مثل التلوين النسيجي أو الكيمياء المناعية^12،13.
   10. قم بإجراء تلطيخ الهيماتوكسيلين واليوزين (HE) ، والتقط الصور تحت المجهر البصري ، وقم بتعيين درجات تلطيخ HE باستخدام مقياس الدرجات النسيجي^{المرضي IVD 12}.
5. اختبار TUNEL
   1. إزالة الشمع وإعادة ترطيب أقسام أنسجة القرص الفقري ، ثم إجراء استرجاع المستضد ونفاذية الغشاء.
   2. أضف خليطا من الكاشف 1 (TdT) والكاشف 2 (dUTP) بنسبة 1: 9 واحتضانه في غرفة رطبة.
   3. اغسل الأقسام باستخدام المخزن المؤقت PBS ، وقم بتطبيق صبغة DAPI ، واحتضانها في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
   4. التقط الصور باستخدام ماسح ضوئي بانورامي مؤتمت بالكامل وبرنامج معالجة.
6. كشف السيتوكين
   1. قتل الأرانب التجريبية (الخطوة 3.4.1) وجمع عينات الدم من الشريان الأورطي البطني.
   2. عينات دم أرنب الطرد المركزي عند 2000 × جم لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية لفصل المصل عن خلايا الدم. اجمع المادة الطافية (المصل) بعناية ، مع التأكد من عدم تضمين أي بقايا خلوية.
   3. اتبع التعليمات الواردة في مجموعة ELISA للكشف عن تعبير TGF-β في عينات المصل.
   4. قم بإعداد الكواشف والمعايير وفقا للتوجيهات الواردة في مجموعة ELISA.
   5. أضف عينات المصل إلى الآبار المناسبة في لوحة ELISA.
   6. احتضن اللوحة في درجة الحرارة والمدة الموصى بها وفقا لتعليمات المجموعة.
   7. اغسل اللوحة حسب التعليمات لإزالة الكواشف غير المرتبطة.
   8. أضف الجسم المضاد للكشف والكواشف الضرورية الأخرى ، باتباع بروتوكول المجموعة.
   9. احتضان اللوحة مرة أخرى للوقت ودرجة الحرارة المحددين.
   10. اغسل الطبق جيدا لإزالة الكواشف الزائدة.
   11. أضف محلول الركيزة إلى الآبار واحتضنه للفترة الموصى بها للسماح بتطوير اللون.
   12. قم بقياس الكثافة الضوئية (OD) باستخدام مقياس الطيف الضوئي بالطول الموجي المحدد في تعليمات المجموعة.
   13. احسب تركيزات العينة عن طريق استبدال قيم OD في المعادلة المقدمة أو باستخدام المنحنى القياسي المتولد من التركيزات المعروفة للمعايير.

4. التحليل الإحصائي

1. إجراء التحليل الإحصائي باستخدام البرامج المتاحة تجاريا.
2. عبر عن المتغيرات المستمرة كمتوسط ± انحراف معياري.
3. استخدم ANOVA أحادي الاتجاه لاختبار الاختلافات بين المجموعات.
4. تطبيق اختبارات LSD للمقارنات الزوجية.
5. استخدم المقاييس المتكررة ANOVA لتحليل بيانات المقاييس المتكررة.
6. إجراء تحليل ارتباط سبيرمان لتقييم الارتباط بين المتغيرات.
7. اضبط مستوى الدلالة على α = 0.05 واعتبر قيم P الأقل من 0.05 ذات دلالة إحصائية.

تم إجراء العمليات الجراحية دون مطارقات. توفي أرنب واحد من المجموعة ب (مجموعة البزل عن طريق الجلد) بعد العملية. استأنفت جميع الأخرى أنماط التغذية والنشاط الطبيعية بعد الجراحة ونجت طوال الفترة التجريبية. لم يلاحظ أي نزيف أو عدوى طويلة الأمد في مواقع الجراحة.

تقييم الوفيات والحالة العامة
كان معدل الوفيات 0٪ لكل من المجموعة A والمجموعة C ، بينما كان 20٪ لكل من المجموعة B (الجدول 1). أظهرت الأرانب في المجموعة أ ظروفا عامة طبيعية. قبل النمذجة ، عرضت الأرانب في المجموعة B ظروفا مماثلة لتلك الموجودة في المجموعة الوهمية. ومع ذلك ، في اليوم الثاني بعد النمذجة ، أظهرت الأرانب في المجموعة ب انخفاضا في الحيوية ، وانخفاض النشاط ، وتفضيلا للتجمع في زوايا أقفاصها ، وانخفاض كبير في تناول الطعام ، وتناول الماء دون تغيير نسبيا ، والفراء الباهت ، وزيادة إنتاج البراز ، والبراز الرخو. بمرور الوقت ، مات أرنب واحد من المجموعة ب ، بينما استعادت الأرانب المتبقية تدريجيا تناولها الغذائي إلى مستويات ما قبل النمذجة. ومع ذلك ، ظلت حيويتها ونشاطها وحالة الفراء واتساق البراز أدنى من مستويات ما قبل النمذجة. في المقابل ، أظهرت الأرانب في المجموعة C حيوية ونشاطا وتناول طعام ولمعان الفراء واتساق البراز مقارنة بتلك الموجودة في المجموعة ب ، بدءا من الأسبوع الثاني بعد النمذجة.

تقييم وزن الجسم
كان وزن جسم الأرانب متشابها في جميع المجموعات قبل النمذجة. ومع ذلك ، قبل أخذ العينات ، كانت الأرانب في المجموعة B تزن أكثر من تلك الموجودة في المجموعتين A و C (الشكل 3).

التقييم الإشعاعي للأقراص الفقرية
لوحظ فقدان ارتفاع القرص الفقري (IVD) في المجموعتين B و C بدءا من أسبوع واحد بعد الجراحة (الشكل 4). أظهر تصنيف Pfirrmann اختلافات كبيرة بين المجموعات (p < 0.001 ، اختبار Kruskal-Wallis مع تحليل Dunn اللاحق). حافظت المجموعة الوهمية (المجموعة أ) على مورفولوجيا القرص السليمة ، مع درجات موحدة من الدرجة 1 عبر جميع العينات (متوسط [النطاق]: 1 [1-1]). أظهرت مجموعة البزل عن طريق الجلد (المجموعة ب) تنكسا معتدلا إلى شديدا (متوسط [النطاق]: 6 [5-6]) ، بينما أظهرت مجموعة النهج خلف الصفاق (المجموعة ج) درجة مماثلة من التنكس (متوسط [النطاق]: 5 [5-6]). كشفت المقارنات الزوجية عن اختلافات كبيرة بين: (1) المجموعة أ مقابل المجموعة ب (ص = 0.0039) ؛ (2) المجموعة أ مقابل. المجموعة ج (ص = 0.0039) ؛ (3) المجموعة ب مقابل. المجموعة ج (ص = 0.206). ظلت الموثوقية بين المقيمين ممتازة (α كريبندورف = 0.87) (الجدول 2).

التقييم النسيجي المرضي والتسجيل
كشف التحليل النسيجي النوعي عن اختلافات في البنية التحتية وتسلل الأوعية الدموية وترسب الأنسجة الحبيبية بين المجموعات A و B و C (الشكل 5). أشارت الدرجات المرضية إلى درجات أعلى بشكل ملحوظ في المجموعتين B و C مقارنة بالمجموعة A ، حيث أظهرت المجموعة C درجة أعلى من المجموعة B (الجدول 3).

نتائج فحص TUNEL
لم يلاحظ أي خلايا موت الخلايا المبرمج ذات النقاط الخضراء أو موت الخلايا المبرمج للخلايا اللبية في المجموعة أ. في المقابل ، أظهرت المجموعتان B و C العديد من الخلايا المبرمج المبرمج الخضراء المنقطة وموت الخلايا المبرمج لخلايا النواة اللبية الشديدة مقارنة بالمجموعة أ. ومع ذلك ، عرضت المجموعة B عددا أقل نسبيا من الخلايا المبرمج الخضراء المنقطة وموت الخلايا المبرمج للنواة اللبية أقل من المجموعة C (الشكل 6).

نتائج الكشف عن TGF-β
كشف التحليل الكمي لمستويات TGF-β عن اختلافات كبيرة بين المجموعات (ANOVA أحادي الاتجاه ، F (2،12) = 87.3 ، ص < 0.0001). أظهرت المجموعة الوهمية (المجموعة ألف) تركيزات خط الأساس TGF-β (متوسط ± SD: 1944.6 بيكوغرام/مل ± 182.3 بيكوغرام/مل)، بينما أظهرت مجموعة البزل عن طريق الجلد (المجموعة ب) ارتفاعا معتدلا (2635.4 بيكوغرام/مل ± 136.7 بيكوغرام/مل). والجدير بالذكر أن مجموعة النهج خلف الصفاق (المجموعة C) أظهرت تنظيما كبيرا ل TGF-β (4143.7 بيكوغرام / مل ± 353.7 بيكوغرام / مل) ، متجاوزة مستويات المجموعة ب بنسبة 57.2٪ (بعد هوك توكي: ص < 0.0001). ظلت الاختلافات البيولوجية الفردية في حدود 15٪ من متوسط المجموعة (نطاق معامل التباين: 5.2٪ -8.5٪) (الشكل 7 ، الجدول 4).

الشكل 1: نمذجة ثقب الحلقة الليفية عن طريق الجلد تحت توجيه الأشعة السينية. تم استخدام التصوير بالأشعة السينية لضمان ثقب دقيق للحلقة الليفية. يوضح الشكل إبرة الثقب الموضعية تحت الأشعة السينية قبل اختراق القرص. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: إنشاء نموذج أرنب أبيض لتنكس القرص الفقري (IVDD) باستخدام ثقب فجوة خلف الصفاق عبر الصفاق في الحلقة الليفية. (أ) بعد التخدير ، تم إجراء شق في الجزء الفقري القطني. (ب) كشف التشريح الحاد عن الحلقة الليفية القطنية. (ج) تم ثقب الحلقة الليفية بإبرة لتعطيل النواة اللبية. (د) كان نسيج النواة اللبية البيضاء الشبيهة بالهلام مرئيا عند طرف الإبرة عند الانسحاب. (ه) تم خياطة الشق بعد اكتمال البزل. (و) تم تضميد الجرح بعد الجراحة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: متوسط أوزان جسم الأرانب البيضاء في كل مجموعة قبل النمذجة وأخذ العينات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4: صور التصوير بالرنين المغناطيسي للأقراص الفقرية للأرانب قبل النمذجة وبعدها. ولوحظ فقدان كبير في الارتفاع في المجموعتين باء وجيم بعد النمذجة، مع خسارة أكبر في المجموعة جيم مقارنة بالمجموعة باء.

الشكل 5: الصور النسيجية للأقراص الفقرية للأرانب. (أ) أظهرت المجموعة أ شكل نواة لب منتظمة ، وتوزيع وفير للخلايا ، وفجوات في المصفوفة الجيلاتينية (الأسهم السوداء) ، والصفائح الليفية الغضرفية المنظمة (الأسهم الصفراء). (ب) أظهرت المجموعة ب شكل نواة لب غير منتظمة ، وانخفاض عدد الخلايا ، وتوزيع المصفوفة العنقودية ، والتجاويف الكبيرة (الأسهم الزرقاء) ، والصفائح الليفية الغضروفية المعطلة المنفصلة عن النواة اللبية (الأسهم الخضراء). (ج) أظهرت المجموعة C شكل نواة لب غير منتظم ، وفقدان كبير للخلايا (الأسهم الأرجوانية) ، وتوزيع المصفوفة العنقودية ، والأشكال غير المنتظمة ، والصفائح الليفية الغضروفي المعطلة (الأسهم الحمراء). شريط المقياس: 200 ميكرومتر (ينطبق على جميع الألواح). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: نتائج فحص TUNEL للأقراص الفقرية للأرانب بعد النمذجة في ثلاث مجموعات. شريط المقياس: 50 ميكرومتر (ينطبق على جميع الألواح). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7: مستويات مصل TGF-β في الأرانب من كل مجموعة. أظهرت كلتا المجموعتين B و C مستويات أعلى من TGF-β مقارنة بالمجموعة A ، حيث أظهرت المجموعة C أعلى المستويات. تمثل أشرطة الخطأ متوسط ± الانحراف المعياري (SD). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: معدل الوفيات بعد النمذجة في مجموعات الأرانب.

الجدول 2: تحليل مقارن لتنكس القرص الفقري باستخدام نظام تصنيف Pfirrmann المعدل.

الجدول 3: متوسط الدرجات المرضية للأرانب في كل مجموعة.

الجدول 4: ملامح تركيز TGF-β عبر المجموعات التجريبية.

تشير نتائج هذه الدراسة إلى أن كلا من أساليب البزل عن طريق الجلد وعبر خلف الصفاق فعالة في إحداث تنكس القرص الفقري (IVDD) في نماذج الأرانب. والجدير بالذكر أنه بناء على تقييم شامل للحالة العامة ، والوفيات ، والتقييم النسيجي المرضي ، ومقايسة TUNEL ، ومستويات TGF-β في الدم ، أدى نموذج البزل عبر خلف الصفاق إلى تغييرات تنكسية أكثر شمولا في الأقراص الفقرية مع الحفاظ على معدل وفيات أقل.

الإصابة الجراحية هي الطريقة الأكثر استخداما لإنشاء نماذج IVDD. منذ أن نجح ليبسون وموير (1981) في تطوير نموذج IVDD في الأرانب باستخدام بضع الحلقة الجراحية^{للمشرط 16} ، ظهرت تقنيات إصابة مختلفة ، بما في ذلك ثقب الإبرة^12،14،17 ، واستئصال الحلقة الليفية¹⁸ ، واستئصال القرص الكلي ، وبضع النواة الجزئي والكلي¹⁹ ، وشفط النواة اللبية^20،21،22 ، وإصابة^{الحفر 23،24 ، 26}. تفرض هذه الطرق الجراحية أعباء فسيولوجية مختلفة على ، مما يؤدي إلى درجات متفاوتة من تحريض IVDD. بالمقارنة مع نماذج إصابة المشرط ، فإن نماذج ثقب الإبرة تحاكي بشكل أفضل الطبيعة البطيئة والتقدمية لتنكس القرص¹⁴.

بينما قدم Masuda et ^al.12 تقنية البزل عبر خلف الصفاق ، فإن هذا النهج الجراحي المفتوح يتطلب وقتا أطول للعملية ، ومهارة جراحية أكبر ، وموارد جراحية أكثر شمولا. بالإضافة إلى ذلك ، قد يزيد الشق الذي تم إنشاؤه أثناء الجراحة المفتوحة من خطر الإصابة بالعدوى وألم ما بعد الجراحة والوفيات في التجارب. في المقابل ، فإن تقنية البزل الخلفي الوحشي عن طريق الجلد التي اقترحها Luo et ^al.14 أكثر وضوحا وجدوى. تؤكد نتائج هذه الدراسة أن نموذج البزل عبر الصفاق خلف الصفاق يحفز تغييرات تنكسية أكثر شمولا في الأقراص الفقرية مع الحفاظ على معدل وفيات أقل.

في نماذج ثقب الإبرة ، يتأثر مدى وطبيعة التغيرات التنكسية في القرص الفقري بعوامل ميكانيكية وبيولوجية متعددة تختلف بمرور الوقت^27،28. هذه العوامل هي المساهمات المرضية المعروفة في تنكس القرص. يؤدي ثقب الإبرة إلى تعطيل سلامة الحلقة الليفية ، ويقلل من مرونة النواة اللبية ، ويعزز موت الخلايا المبرمج للنواة اللبية ، ويغير توزيع الإجهاد الميكانيكي داخل العمود^{الفقري 29}. بالإضافة إلى ذلك ، يثير الموقع المصاب استجابات التهابية وإصلاح مبكرة ، بما في ذلك تكاثر الشعيرات الدموية في الحلقة الليفية الخارجية وترسب التحبيب والأنسجة الليفية. تم وصف هذه التفاعلات المرضية في العديد من النماذج الحيوانية لتنكس القرص^30،31ولوحظت أيضا في فتق القرص القطني البشري.

في هذه الدراسة ، كانت هذه الاستجابات المرضية واضحة في كلا النموذجين. بالمقارنة مع البزل عن طريق الجلد ، يوفر البزل عبر خلف الصفاق رؤية ثقب أوضح ، مما يسهل تعطيلا أكثر دقة للحلقة الليفية ويؤدي إلى التهاب أكبر في موقع الإصابة. قد يفسر هذا سبب إحداث نموذج البزل عبر خلف الصفاق إلى تغييرات تنكسية أكثر شمولا في الأقراص الفقرية. على العكس من ذلك ، فإن الرؤية المحدودة في البزل عن طريق الجلد تزيد من احتمالية حدوث خلل في الحبل الشوكي أو الهياكل الأخرى ، مما قد يفسر معدل الوفيات الأعلى الذي لوحظ في هذه الدراسة.

يتم إنشاء نماذج ثقب الإبرة لتنكس القرص بشكل شائع في الصغيرة مثل الفئران والفئران³² ، وكذلك الأرانب^12،14،16. ومع ذلك ، فإن هذه التقنية قابلة للتطبيق أيضا على الكبيرة ، بما في ذلك³³ ، والأغنام³⁴ ، والماشية³⁵ ،^{الريسوس 36} ، لتطوير نموذج IVDD. على الرغم من وجود مخاوف بشأن الاختلافات بين النماذج الحيوانية رباعية الأرجل والعمود الفقري البشري ذو القدمين ، تشير الدراسات الميكانيكية الحيوية إلى أن العمود الفقري رباعي الأرجل يعاني في المقام الأول من الضغط المحوري ، على غرار العمود الفقري البشري^37،38. يتم مواجهة قوى الانحناء والالتواء الشديدة التي تعمل على العمود الفقري رباعي الأرجل من خلال العضلات والأربطة المجاورة للنشاع التي تولد قوى شد كبيرة على طول المحور^{الطويل 38}. نظرا للقيود الأخلاقية والعملية ، فإن الأرانب الأكبر حجما مكلفة ويصعب الحصول عليها ، مما يجعل الأرانب نموذجا مثاليا لأبحاث IVDD. علاوة على ذلك ، فإن التماثل التشريحي بين الأرانب والأقراص الفقرية البشرية - لا سيما وجود مفاصل الوجه والعضلات المجاورة الشوكية والأربطة - يدعم أيضا ملاءمة الأرانب لهذا البحث^13،39.

ومع ذلك ، توجد اختلافات كبيرة بين هذه النماذج الحيوانية والأقراص الفقرية البشرية ، مما يمثل قيدا لهذه الدراسة. تشمل هذه الاختلافات الاختلافات في حجم القرص ، والخصائص التشريحية ، ووجود الخلايا الظهرية ، وقابلية ترجمة النتائج التجريبية. وبالتالي ، تواجه هذه الدراسة بعض التحديات. بالإضافة إلى ذلك ، في الممارسة السريرية ، غالبا ما يعاني المرضى من تغيرات تنكسية موجودة مسبقا في القرص الفقري ، مما قد يؤدي في النهاية إلى فتق القرص والضغط العصبي. في المقابل ، تسببت النماذج الحيوانية في هذه الدراسة في التنكس عن طريق إصابة الأقراص السليمة. قد تقل الأقراص المتدهورة من قدرات الإصلاح الذاتي والتجدد بعد الإصابة أو قد تظهر تنكسا أكثر حدة مقارنة بالأقراص السليمة التي تم فحصها في هذه التجربة. يجب أن تأخذ الأبحاث المستقبلية حول النماذج الحيوانية لتنكس القرص الفقري هذه العوامل في الاعتبار الكامل.

تعتبر كل من أساليب البزل عن طريق الجلد وعبر خلف الصفاق فعالة في إنشاء نماذج تنكس القرص الفقري في الأرانب. ومع ذلك ، فإن تقنية البزل عبر خلف الصفاق تحفز تغييرات تنكسية أكثر شمولا بينما ترتبط أيضا بمعدل وفيات أقل.

اي.

تم دعم هذا المشروع من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 82004497) ، ومؤسسة علوم ما بعد الدكتوراه الصينية (رقم 2021M693788) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 82105043) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية لمقاطعة سيتشوان (رقم 2023NSFSC1814).