JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا نصف مقايسة نشاط عامل نسيج الحويصلة خارج الخلية في المنزل. تم استخدام المقايسات القائمة على النشاط والمقايسات القائمة على المستضد لقياس عامل الأنسجة في الحويصلات خارج الخلية من عينات البلازما البشرية. المقايسات القائمة على النشاط لها حساسية وخصوصية أعلى من المقايسات القائمة على المستضد.

Abstract

عامل الأنسجة (TF) هو مستقبل عبر الغشاء للعامل (F) VII و FVIIa. يبدأ مجمع TF / FVIIa سلسلة التخثر عن طريق تنشيط كل من FIX و FX. يتم إطلاق TF من الخلايا إلى الدورة الدموية في شكل حويصلات خارج الخلية (EVs). يزداد مستوى EVs الإيجابية (+) في أمراض مختلفة ، بما في ذلك السرطان والالتهابات البكتيرية والفيروسية وتليف الكبد ، ويرتبط بالتخثر والتخثر المنتشر داخل الأوعية وشدة المرض والوفيات. هناك طريقتان لقياس TF + EVs في البلازما: المقايسات القائمة على المستضد والنشاط. تشير البيانات إلى أن المقايسات القائمة على النشاط لها حساسية وخصوصية أعلى من المقايسات القائمة على المستضد. تصف هذه الورقة مقايسة نشاط EVTF الداخلية الخاصة بنا بناء على فحص جيل FXa على مرحلتين. تتم إضافة FVIIa و FX والكالسيوم إلى العينات المحتوية على TF + EV لتوليد FXa في وجود وغياب الأجسام المضادة المضادة ل TF لتمييز جيل FXa المعتمد على TF عن جيل FXa المستقل عن TF. يتم استخدام ركيزة كروموجينية مشقوقة بواسطة FXa لتحديد مستوى FXa ، بينما يتم استخدام منحنى قياسي تم إنشاؤه باستخدام TF المؤتلف المعاد تدبيره لتحديد تركيز TF. يتميز اختبار نشاط EVTF الداخلي هذا بحساسية وخصوصية أعلى من مقايسة نشاط TF التجاري.

Introduction

يبدأ تخثر الدم بربط العامل (F) VII / VIIa بعامل الأنسجة (TF) 1. ينشط مركب TF / FVIIa كلا من FIX و FX لتنشيط تخثر الدم1. هناك نوعان من TF كامل الطول المرتبط بالغشاء: مشفر ونشط. بالإضافة إلى ذلك ، هناك شكل مقسم بدلا من TF (asTF). يحافظ Sphingomyelin و phosphatidylcholine في النشرة الخارجية لغشاء الخلية على TF في حالة مشفرة2،3،4. عندما يتم تنشيط الخلايا أو تلفها ، ينقل الفوسفوليبيد سكرامبلاز الفوسفاتيديل سيرين وغيره من الدهون الفوسفاتية سالبة الشحنة إلى النشرة الخارجية1. يؤدي تنشيط الخلايا أيضا إلى نقل حمض السفينغوميليناز إلى النشرة الخارجية حيث يتحلل السفينغوميلين إلى سيراميد5. تقوم هاتان الآليتان بتحويل TF المشفر إلى النموذج النشط. يقترح أيضا أن إيزوميراز ثاني كبريتيد البروتين يتوسط تكوين رابطة ثاني كبريتيد بين Cys186 و Cys209 في TF المشفر ، مما يؤدي إلى فك تشفير TF6،7،8. asTF موجود أيضا في الدورة الدموية ولكنه يفتقر إلى المجال عبر الغشاء وبالتالي فهو قابل للذوبان 9,10. الأهم من ذلك ، أن asTF لديها مستويات منخفضة جدا من نشاط التخثر مقارنة ب TF10,11 النشط كامل الطول.

يتم إطلاق الحويصلات خارج الخلية (EVs) من الخلايا المضيفة التي تستريح وتنشط وتموت ، وكذلك الخلايا السرطانية12. تعبر المركبات الكهربائية عن البروتينات من خلاياها الأبوية12. يتم إطلاق EVs النشطة الحاملة ل TF من الخلايا الوحيدة المنشطة والخلايا البطانية والخلايا السرطانية في الدورة الدموية13،14،15. يمكن قياس مستويات TF في البلازما عن طريق المقايسات القائمة على النشاط والمستضد. تشمل المقايسات القائمة على المستضد ELISA وقياس التدفقالخلوي 16. هناك نوعان مختلفان من المقايسات القائمة على النشاط: مقايسات نشاط TF على مرحلتين ومرحلتين. يعتمد الفحص أحادي المرحلة على مقايسة التخثر القائمة على البلازما. تضاف العينة المحتوية على TF إلى البلازما ويتم قياس وقت تكوين الجلطة بعد إعادة التكلس. يقيس الفحص المكون من مرحلتين جيل FXa من العينات عن طريق إضافة FVII أو FVIIa و FX والكالسيوم. يتم تحديد مستويات FXa باستخدام ركيزة مشقوقة بواسطة FXa.

في كل من مقايسات نشاط TF ذات المرحلة الواحدة والمرحلتين ، يتم تحديد تركيز TF باستخدام منحنى قياسي تم إنشاؤه باستخدام TF المؤتلف. تتمتع المقايسات ذات المرحلتين بحساسية وخصوصية أعلى من الفحص أحادي المرحلة. أكدت العديد من الدراسات أن المقايسات القائمة على النشاط لها حساسية وخصوصية أعلى من المقايسات القائمة على المستضد17،18،19،20،21. بالإضافة إلى ذلك ، فإن مقايسة النشاط الداخلي لدينا لها حساسية وخصوصية أعلى من مقايسة النشاط التجاري22. الأفراد الأصحاء لديهم مستويات منخفضة جدا أو لا يمكن اكتشافها من نشاط EVTF في البلازما. في المقابل ، فإن الأفراد الذين يعانون من حالات مرضية ، مثل السرطان وتليف الكبد والإنتان والعدوى الفيروسية ، لديهم مستويات يمكن اكتشافها من نشاط EVTF وهذا يرتبط بالتخثر ، والتخثر المنتشر داخل الأوعية الدموية ، وشدة المرض ، والوفيات23،24،25،26،27،28. هنا ، سنصف اختبار نشاط EVTF الداخلي المكون من مرحلتين.

Protocol

تمت الموافقة على البحث من قبل مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة نورث كارولينا في تشابل هيل (رقم البروتوكول: 14-2108).

1. جمع الدم من المتبرعين

  1. جمع الدم الكامل باستخدام بزل الوريد النظيف في الوريد قبل المرفقي بإبرة 21 جرام. تخلص من أول 3 مل من الدم لأن هذا الجزء من الدم قد يحتوي على TF من الخلايا المحيطة بالأوعية.
  2. اسحب 2.7 أو 1.8 مل (حسب حجم الأنابيب) من الدم إلى مفرغ يحتوي على 3.2٪ سترات الصوديوم (0.109 مول / لتر). لا تفرط في ملء الأنابيب أو تنقصها. اقلب الأنابيب برفق مباشرة بعد جمع الدم لتفريق سترات الصوديوم.
  3. تجنب الهياج إذا تم نقل الأنابيب قبل المعالجة. تحضير البلازما في غضون 2 ساعة من جمع الدم.

2. إعداد بلازما السيطرة السلبية

ملاحظة: يجب عدم وضع العينات على الثلج في أي وقت قبل التجميد النهائي.

  1. تحضير بلازما السيطرة السلبية باستخدام الدم الكامل من متطوعين أصحاء. مباشرة بعد جمع الدم ، قم بإعداد البلازما الخالية من الصفائح الدموية على النحو التالي.
    1. نقل عينات الدم من الأنابيب المفرغمة إلى أنابيب سعة 15 مل.
    2. عينات دم أجهزة الطرد المركزي عند 2500 × جم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (20-24 درجة مئوية) بدون فرامل.
    3. انقل المادة الطافية (البلازما الفقيرة بالصفائح الدموية) إلى أنبوب جديد وكرر الدوران في نفس الظروف.
    4. نقل المادة الطافية (البلازما المستنفدة للصفائح الدموية) إلى أنبوب جديد.
    5. قسمة العينة إلى ≥100 ميكرولتر من القسامة. اترك حوالي 100 ميكرولتر في قاع الأنبوب.
    6. قم بتجميد البلازما المستنفدة للصفائح الدموية على الفور عند -80 درجة مئوية (الشكل 1).

3. إعداد بلازما التحكم الإيجابي

ملاحظة: الاستجابة لعديد السكاريد الشحمي متغيرة بين الأفراد.

  1. نقل عينات الدم من vacutainers إلى أنابيب 15 مل.
  2. تحضير بلازما التحكم الإيجابي باستخدام الدم الكامل من متطوعين أصحاء تم تحفيزهم باستخدام عديد السكاريد الشحمي (LPS) من الإشريكية القولونية O111: B4 (10 ميكروغرام / مل) لمدة 5 ساعات عند 37 درجة مئوية مع التقليب.
  3. بعد حضانة 5 ساعات ، اتبع الخطوات 2.1.2 إلى 2.1.6.

4. عزل الحويصلات خارج الخلية من البلازما

ملاحظة: قد لا تكون كريات EV مرئية. يعتمد وقت إزالة الجليد على حجم العينة ولكننا عادة ما نقوم بإذابة 100 ميكرولتر من البلازما لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

  1. تذويب عينات البلازما عند 37 درجة مئوية.
  2. أضف 1 مل من HBSA بدون محلول الكالسيوم [HBSA-Ca(-)] [137 mM NaCl ، 5.38 mM KCl ، 5.55 mM الجلوكوز ، 10 mM HEPES ، 0.1٪ (w / v) ألبومين مصل البقري] لكل 100 ميكرولتر من عينة البلازما في أنبوب 1.5 مل.
  3. عينات بلازما الطرد المركزي عند 20000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  4. نضح المادة الطافية حتى 20 ميكرولتر دون إزعاج حبيبات EV.
  5. أعد تكوين حبيبات EV عن طريق إضافة 1 مل من المخزن المؤقت HBSA-Ca(-) إلى كل أنبوب, ماصة لأعلى ولأسفل في موقع حبيبات EV, ودوامة كل أنبوب قبل الطرد المركزي للمرة الثانية عند 20,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  6. نضح المادة الطافية حتى 20 ميكرولتر دون إزعاج حبيبات EV.
  7. أعد تكوين حبيبات EV في 80 ميكرولتر من HBSA-Ca (-) والماصة لأعلى ولأسفل في موقع حبيبات EV (الشكل 2).

5. الخيار: عزل الحويصلات الصغيرة خارج الخلية باستخدام أجهزة الطرد المركزي الفائقة

  1. بعد الخطوة 4.3 ، اجمع المادة الطافية وأجهزة الطرد المركزي الفائقة عند 100000 × جم لمدة 70 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  2. نضح المادة الطافية حتى 20 ميكرولتر دون إزعاج حبيبات EV.
  3. أعد تكوين حبيبات EV عن طريق إضافة 1 مل من المخزن المؤقت HBSA-Ca(-) إلى كل أنبوب ودوامة كل أنبوب قبل الطرد المركزي الفائق للمرة الثانية عند 100000 × جم لمدة 70 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  4. نضح المادة الطافية حتى 20 ميكرولتر دون إزعاج حبيبات EV.
  5. إعادة تكوين حبيبات EV في 80 ميكرولتر من HBSA-Ca(-).

6. قياس نشاط عامل نسيج الحويصلة خارج الخلية

ملاحظة: يجب سحب عينات EV ودوامة جيدا لخلطها قبل إضافتها إلى الآبار. سوف يمنع EDTA-disodium قدرة FXa على شق الركيزة الكروموجينية. لذلك ، لا يمكن استخدام EDTA-disodium كبديل ل EDTA-tetrasodium في الخطوة 6.7.

  1. أضف 40 ميكرولتر من عينة EV إلى بئرين من صفيحة 96 بئرا.
  2. أضف 11 ميكرولتر من فأر مثبط مضاد للإنسان TF IgG [(36.4 ميكروغرام / مل ، التركيز النهائي 7.8 ميكروغرام / مل)] إلى بئر واحد من عينة EV و 11 ميكرولتر من فأر التحكم IgG [(36.4 ميكروغرام / مل ، التركيز النهائي 7.8 ميكروغرام / مل)] إلى البئر الآخر.
  3. احتضن لوحة 96 بئرا لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. خلال فترة الحضانة ، قم بإعداد 50 ميكرولتر / بئر من معايير TF (0 ، 0.32 ، 0.63 ، 1.25 ، 2.5 ، 5 ، 10 ، و 20 بيكوغرام / مل) في نسختين باستخدام TF المؤتلف المعاد دهن.
  5. تحضير مزيج العوامل عن طريق خلط 4 مل من HBSA مع الكالسيوم [HBSA-Ca(+)] [HBSA-Ca(-) + 10 mM CaCl2 ، التركيز النهائي 10 mM] ، 800 ميكرولتر من 900 نانومتر FX في HBSA-Ca(+) (التركيز النهائي: 146.4 نانومتر) ، و 120 ميكرولتر من 200 نانومتر FVIIa في HBSA-CA (+) (التركيز النهائي: 4.8 نانومتر).
  6. أضف 50 ميكرولتر من محلول مزيج العوامل إلى كل بئر ، وقم بتغطية اللوحة بالفيلم ، واحتضانها لمدة 2 ساعة في حاضنة عند 37 درجة مئوية.
  7. بعد 2 ساعة ، أوقف توليد FXa بإضافة 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت HBSA ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) [HBSA-Ca(-) + 25 mM EDTA-tetrasodium ، التركيز النهائي 5 mM] واحتضانه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  8. أعد تكوين الركيزة الكروموجينية المشقوقة بواسطة FXa إلى 4mM (أضف 8.7 مل من الماء المقطر إلى قارورة 25 مجم).
  9. أضف 25 ميكرولتر من محلول الركيزة الكروموجينيك إلى كل بئر ، وقم بتغطية اللوحة بالفيلم ثم بورق الألمنيوم لحمايتها من الضوء ، واحتضانها لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  10. بعد 15 دقيقة من الحضانة ، قم بإزالة الفقاعات بإبرة أو عن طريق الطرد المركزي عند 1500 × جم لمدة دقيقة واحدة.
  11. اقرأ اللوحة عند 405 نانومتر باستخدام قارئ لوحة بمزيج واحد قبل القراءة.
  12. قم بتحويل جيل FXa لكل بئر إلى نشاط TF باستخدام المنحنى القياسي المتولد باستخدام TF المؤتلف المعاد تشكيله.
  13. احسب توليد FXa المعتمد على TF (نشاط EVTF) باستخدام المعادلة (1):
    جيل FXa المعتمد على TF (نشاط EVTF [pg / mL]) = إجمالي توليد FXa (التحكم في IgG جيدا) - جيل FXa المستقل عن TF (بئر IgG المضاد ل TF) (الشكل 3) (1)

النتائج

تعطي النتيجة الناجحة قيمة تحكم إيجابية تبلغ ≥0.5 بيكوغرام / مل وقيمة تحكم سلبية تبلغ <0.5 بيكوغرام / مل. من الأفضل العثور على مستجيب LPS مرتفع مع نشاط EVTF >1.0 بيكوغرام / مل للتحكم الإيجابي. تظهر النتيجة التمثيلية نشاط EVTF للمركبات الكهربائية المعزولة من البلازما من الدم الكامل ل 11 متبرعا صحيا ، مع أو بدون تنشيط LPS (الشكل 4). كان ستة من أصل أحد عشر متبرعا (الجهات المانحة 2 ، 4 ، 5 ، 8 ، 10 ، 11) من المستجيبين ل LPS متوسطين إلى مرتفعين ، في حين أن خمسة من أصل أحد عشر متبرعا (الجهات المانحة 1 ، 3 ، 6 ، 7 ، 9) كانوا مستجيبين منخفضي LPS.

figure-results-670
الشكل 1: تحضير البلازما المستنفدة للصفائح الدموية. تم تعديل الرقم من هيسادا وماكمان29. اختصار: PDP = البلازما المستنفدة للصفائح الدموية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-1172
الشكل 2: عزل الحويصلات خارج الخلية عن البلازما المستنفدة للصفائح الدموية. تم تعديل الرقم من هيسادا وماكمان29. الاختصارات: PDP = البلازما المستنفدة للصفائح الدموية. EVs = حويصلات خارج الخلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-1732
الشكل 3: قياس نشاط عامل نسيج الحويصلة خارج الخلية. تم تعديل الرقم من هيسادا وماكمان29. الاختصارات: TF = عامل الأنسجة. EVs = حويصلات خارج الخلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2246
الشكل 4: نشاط EVTF للبلازما من الدم الكامل ل 11 متبرعا صحيا ، مع وبدون تنشيط LPS. تم إجراء تنشيط LPS تحت نفس حالة التحكم الإيجابي. كانت السيطرة الإيجابية من مستجيب LPS معروف في حين أن الاستجابات ل LPS ل 11 متبرعا صحيا لم تكن معروفة في وقت التجربة. تشير الأشرطة البيضاء والسوداء مع وبدون تنشيط LPS ، على التوالي. الاختصارات: EVTF = عامل نسيج الحويصلة خارج الخلية. LPS = عديد السكاريد الشحمي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: ملخص للدراسات التي تقارن بين مقايسة نشاط EVTF الداخلية ، و TF ELISA التجاري ، وفحص النشاط. الاختصارات: EVTF = عامل نسيج الحويصلة خارج الخلية. ELISA = مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

Discussion

هنا ، يتم تقديم بروتوكول فحص نشاط EVTF الداخلي الخاص بنا. هناك ثلاث خطوات حاسمة في البروتوكول. عند إعادة تكوين حبيبات EV, من المهم أن تكون ماصة لأعلى ولأسفل في موقع حبيبات EV حتى لو لم تكن مرئية. ستؤدي إعادة التكوين غير الكاملة لحبيبات EV إلى سلبية خاطئة أو تقليل تقدير قيم نشاط EVTF للعينات. ثانيا ، يعد استخدام HBSA-Ca(+) أمرا بالغ الأهمية في خطوة البروتوكول 6.5 لأنه لا يمكن توليد توليد FXa بدون الكالسيوم. ثالثا ، يعد استخدام EDTA-tetrasodium ولكن ليس EDTA-disodium لوقف توليد FXa أمرا بالغ الأهمية لأن الأخير يمنع قدرة FXa على شق الركيزة الكروموجينية.

نوصي بطريقة التخزين والاستخدام التالية لكل كاشف. نقوم بتخزين مخازن الفحص والركيزة المعاد تشكيلها عند 4 درجات مئوية ونستخدمها بشكل متكرر حتى نفادها. إذا لم ننفد من الركيزة في غضون 2-3 أسابيع ، فإننا نتجاهلها لأنها تتحول إلى اللون الأصفر. نقوم بتخزين TF المؤتلف والأجسام المضادة و FVIIa و FX عند -80 درجة مئوية ونوصي بعمل حصص لفحص واحد لتجنب دورة التجميد والذوبان.

في دراسة أولية ، تركنا عينات البلازما لمدة 9 ساعات في درجة حرارة الغرفة ، وأعدنا تجميدها عند -80 درجة مئوية طوال الليل ، وأجرينا الفحص في اليوم التالي. كعنصر تحكم ، قمنا بإذابة نفس البلازما وإعادة تجميدها على الفور. وجدنا أن العينة التي تركت لمدة 9 ساعات في درجة حرارة الغرفة لديها انخفاض بنسبة 16٪ في نشاط EVTF مقارنة بالعينة التي تم إذابتها وإعادة تجميدها على الفور (Hisada and Mackman ، بيانات غير منشورة 2017).

بالإضافة إلى الاختلاف في الاستجابة ل LPS ، فإن الاختلاف في تركيز EVs في البلازما من المتبرعين الأفراد قد يفسر نشاط EVTF المختلف للمتبرعين المختلفين. في الواقع ، لاحظنا بعض الاختلافات في تركيزات EVs في البلازما من الدم الكامل المحفز LPS (1.9 ± 0.6 × 1010 جسيمات / مل ، ن = 6 ، متوسط ± الانحراف المعياري)30.

يحتوي اختبار نشاط EVTF الداخلي هذا على العديد من الميزات التي لا تمتلكها المقايسات التجارية. أولا ، يستخدم الفحص جسما مضادا ل TF للتمييز بين جيل FXa المعتمد على TF وجيل FXa المستقل عن TF. يزعم أن ثلاثة مقايسات للنشاط التجاري تقيس نشاط TF في البلازما ولكن لا يستخدم أي منها الأجسام المضادة المضادة ل TF16. لذلك ، فإن هذه المقايسات التجارية تقيس ببساطة إجمالي توليد FXa ولكن ليس جيل FXa المعتمد على TF. ثانيا ، نستخدم 2.4 نانومتر من FVIIa (التركيز النهائي في التفاعل) لتقليل توليد FXa المستقل عن TF بواسطة FVIIa. يستخدم أحد مقايسات النشاط التجاري 12 نانومتر من FVIIa في التفاعل ، مما يعطي خلفية عالية22. في الواقع ، يقوم FVIIa بتنشيط FX خطيا اعتمادا على تركيز FVIIa في غياب TF31. قمنا بتلخيص الدراسات التي قارنت بين مقايسة نشاط EVTF الداخلية و TF ELISA التجاري وفحص النشاط في الجدول 1.

وتقترح أربعة تصنيفات استجابة لنشاط EVTF للبلازما الفقيرة بالصفائح الدموية السيترة: صفر (0 إلى <0.5 بيكوغرام/مل)؛ صفر (0 إلى 0.5 بيكوغرام/مل)؛ صفر (0 إلى 0.5 بيكوغرام/مل)؛ صفر (صفر (0 إلى 0.5 بيكوغرام/مل)؛ صفر (0 إلى 0.5 بيكوغرام/مل)؛ صفر ( ضعيف (0.5 إلى <1.0 بيكوغرام / مل) ، معتدل (1.0 إلى <2.0 بيكوغرام / مل) ، وقوي (≥2.0 بيكوغرام / مل)23. والجدير بالذكر أن مضادات التخثر المختلفة تؤثر على نتائج فحوصات نشاط EVTF. على سبيل المثال ، لوحظت مستويات أعلى من نشاط EVTF باستخدام الهيبارين بعد تحفيز LPS مقارنة بسترات الصوديوم (المانح أ: 4.6 (سيترات) مقابل 28.6 (هيبارين) بيكوغرام / مل والمتبرع ب: 3.4 (سيترات) مقابل 26.0 (هيبارين) بيكوغرام / مل ، على التوالي ، بيانات Hisada و Mackman غير المنشورة 2017). في المقابل ، لوحظت مستويات أقل من نشاط EVTF باستخدام EDTA بعد تحفيز LPS مقارنة بسترات الصوديوم (Donor C: 3.9 (سيترات) مقابل 1.4 (EDTA) بيكوغرام / مل ، مانح D: 3.8 (سيترات) مقابل 0.4 (EDTA) بيكوغرام / مل ، على التوالي ، بيانات تاتسومي وماكمان غير المنشورة 2016). تشير هذه النتائج إلى أن بيانات نشاط EVTF غير قابلة للمقارنة عند استخدام مضادات التخثر المختلفة.

هناك بعض القيود على الطريقة. معامل الاختلاف (CV) مرتفع نسبيا مقارنة بالمقايسات السريرية. في الواقع ، كانت السيرة الذاتية للتحكم الإيجابي في سبع دراسات مستقلة 24٪ 17,29. عزل المركبات الكهربائية باستخدام كريات الطرد المركزي ليس فقط EVs ولكن أيضا الحطام الخلوي. قمنا سابقا بتحليل حبيبات البلازما الغنية بالصفائح الدموية عن طريق المجهر الإلكتروني النافذ ولاحظ الصفائح الدموية والمركبات الكهربائية والحطام الخلوي32. نحن نستخدم دوارا ثابت الزاوية ولم نشهد دوارا متأرجحا للخارج للطرد المركزي 20000 × جرام. لقد وجدنا مؤخرا أن المركبات الكهربائية الصغيرة التي يمكن تكويرها ب 100,000 × جم ولكن ليس ب 20,000 × جم لها نشاط EVTF في مرضى سرطان البنكرياس و COVID-1930. يشير هذا إلى أن هذا البروتوكول لا يقيس نشاط EVTF من المركبات الكهربائية الصغيرة ، مثل exosomes. والجدير بالذكر أن exosomes هي EVs غنية بالسفينغوميلين وقد تم الإبلاغ عن وجود exosomes الحاملة ل TF30،33،34،35. نوصي بتكوير المركبات الكهربائية في البلازما باستخدام 100000 × جم لتحديد الكمية الإجمالية لنشاط EVTF في العينة بدقة أكبر. وتجدر الإشارة إلى أنه يتطلب جهاز طرد مركزي فائق ووقت فحص أطول لأن وقت الطرد المركزي يزيد من 15 دقيقة إلى 70 دقيقة.

يمكن تطبيق هذه الطريقة على عينات البلازما من أي نوع من الأمراض. يرتبط نشاط EVTF بشدة المرض والبقاء على قيد الحياة لدى المرضى الذين يعانون من أمراض مختلفة ، بما في ذلك السرطان و COVID-19 والعدوى البكتيرية وتليف الكبد23،26،27.

Disclosures

لا توجد مصالح متنافسة للإفصاح عنها.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة NHLBI R35HL155657 (NM) وأستاذ جون سي باركر (NM). نود أن نشكر السيدة سييرا ج. أرشيبالد على تعليقاتها المفيدة

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL tube for 20,000 x g centrifugeany companyN/AWe use the one from Fisher Scientific (Catalog number: 05-408-129).
1.5 mL tube for ultracentrifugeany companyN/AWe use the one from Beckman Coulter (Catalog number: 357448)
15 mL tubeany companyN/AWe use the one from VWR (Catalog number: 89039-666)
21 G x .75 in. BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set with 12 in. tubing and luer adapterBD367281
96-well plateany companyN/AWe use the one from Globe Scientific (Catalog number: 120338).
BD Vacutainer Citrate TubesBD363083
Bovine serum albuminSigma AldrichA9418
Calcium chlorideFisher ScientificC69-500
Centrifuge for 1.5 mL tubeany companyN/AWe use the Centrifuge 5417R (Eppendorf).
Centrifuge for 15 mL tubeany companyN/AWe use the Centrifuge 5810R (Eppendorf).
D-(+)-GlucoseSigma AldrichG7021
Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrateSigma AldrichE6511
HepesSigma AldrichH4034
Human FVIIaEnzyme Research LaboratoryHFVIIaThe solution should be diluted with HBSA-Ca(+).
Human FXEnzyme Research LaboratoryHFX1010The solution should be diluted with HBSA-Ca(+).
Inhibitory mouse anti-human tissue factor IgG, clone HTF-1Fisher Scientific550252
Lipopolysaccharide from Escherichia coli O111:B4Sigma AldrichL2630There are several lipopolysaccharide from different E. coli. Different lipopolysaccharide have different potential to activate monocytes.
Mouse IgGSigma AldrichI5381
Pefachrome FXa 8595Enzyme Research Laboratory085-27
Plate readerany companyN/AWe use the SpectraMax i3x from Molecular Devices
Re-lipidated recombinant tissue factor, Dade InnovinSiemens10873566
Sodium chloride Fisher ScientificS271-500
UltracentrifugeBeckman CoulterOptima TLX
Ultracentrifuge rotorBeckman CoulterTLA-55

References

  1. Grover, S. P., Mackman, N. Tissue factor: an essential mediator of hemostasis and trigger of thrombosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (4), 709-725 (2018).
  2. Shaw, A. W., Pureza, V. S., Sligar, S. G., Morrissey, J. H. The local phospholipid environment modulates the activation of blood clotting. Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6556-6563 (2007).
  3. Tavoosi, N., et al. Molecular determinants of phospholipid synergy in blood clotting. Journal of Biological Chemistry. 286 (26), 23247-23253 (2011).
  4. Wang, J., Pendurthi, U. R., Rao, L. V. M. Sphingomyelin encrypts tissue factor: ATP-induced activation of A-SMase leads to tissue factor decryption and microvesicle shedding. Blood Advances. 1 (13), 849-862 (2017).
  5. Kornhuber, J., Rhein, C., Muller, C. P., Muhle, C. Secretory sphingomyelinase in health and disease. Biological Chemistry. 396 (6-7), 707-736 (2015).
  6. Versteeg, H. H., Ruf, W. Tissue factor coagulant function is enhanced by protein-disulfide isomerase independent of oxidoreductase activity. Journal of Biological Chemistry. 282 (35), 25416-25424 (2007).
  7. Reinhardt, C., et al. Protein disulfide isomerase acts as an injury response signal that enhances fibrin generation via tissue factor activation. Journal of Clinical Investigation. 118 (3), 1110-1122 (2008).
  8. Langer, F., et al. Rapid activation of monocyte tissue factor by antithymocyte globulin is dependent on complement and protein disulfide isomerase. Blood. 121 (12), 2324-2335 (2013).
  9. Bogdanov, V. Y., et al. Alternatively spliced human tissue factor: a circulating, soluble, thrombogenic protein. Nature Medicine. 9 (4), 458-462 (2003).
  10. Mackman, N. Alternatively spliced tissue factor - one cut too many. Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 5-8 (2007).
  11. Censarek, P., Bobbe, A., Grandoch, M., Schror, K., Weber, A. A. Alternatively spliced human tissue factor (asHTF) is not pro-coagulant. Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 11-14 (2007).
  12. Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
  13. Osterud, B., Bjorklid, E. Tissue factor in blood cells and endothelial cells. Frontiers in Bioscience (Elite Edition). 4 (1), 289-299 (2012).
  14. Hisada, Y., Mackman, N. Cancer cell-derived tissue factor-positive extracellular vesicles: biomarkers of thrombosis and survival. Current Opinion in Hematology. 26 (5), 349-356 (2019).
  15. Vatsyayan, R., Kothari, H., Pendurthi, U. R., Rao, L. V. 4-Hydroxy-2-nonenal enhances tissue factor activity in human monocytic cells via p38 mitogen-activated protein kinase activation-dependent phosphatidylserine exposure. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (7), 1601-1611 (2013).
  16. Mackman, N., Sachetto, A. T. A., Hisada, Y. Measurement of tissue factor-positive extracellular vesicles in plasma: strengths and weaknesses of current methods. Current Opinion in Hematology. 29 (5), 266-274 (2022).
  17. Lee, R. D., et al. Pre-analytical and analytical variables affecting the measurement of plasma-derived microparticle tissue factor activity. Thrombosis Research. 129 (1), 80-85 (2012).
  18. Claussen, C., et al. Microvesicle-associated tissue factor procoagulant activity for the preoperative diagnosis of ovarian cancer. Thrombosis Research. 141, 39-48 (2016).
  19. Mackman, N., Hisada, Y., Archibald, S. J., et al. Tissue factor and its procoagulant activity on cancer-associated thromboembolism in pancreatic cancer: Comment by Mackman et al. Cancer Science. 113 (5), 1885-1887 (2022).
  20. Sachetto, A. T. A., et al. Evaluation of four commercial ELISAs to measure tissue factor in human plasma. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 7 (3), 100133 (2023).
  21. Archibald, S. J., Hisada, Y., Bae-Jump, V. L., Mackman, N. Evaluation of a new bead-based assay to measure levels of human tissue factor antigen in extracellular vesicles in plasma. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 6 (2), e12677 (2022).
  22. Tatsumi, K., et al. Evaluation of a new commercial assay to measure microparticle tissue factor activity in plasma: communication from the SSC of the ISTH. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (11), 1932-1934 (2014).
  23. Hisada, Y., et al. Measurement of microparticle tissue factor activity in clinical samples: A summary of two tissue factor-dependent FXa generation assays. Thrombosis Research. 139, 90-97 (2016).
  24. Tatsumi, K., Hisada, Y., Connolly, A. F., Buranda, T., Mackman, N. Patients with severe orthohantavirus cardiopulmonary syndrome due to Sin Nombre Virus infection have increased circulating extracellular vesicle tissue factor and an activated coagulation system. Thrombosis Research. 179, 31-33 (2019).
  25. Schmedes, C. M., et al. Circulating Extracellular Vesicle Tissue Factor Activity During Orthohantavirus Infection Is Associated With Intravascular Coagulation. Journal of Infectious Diseases. 222 (8), 1392-1399 (2020).
  26. Rosell, A., et al. Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-Brief report. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).
  27. Campbell, R. A., et al. Comparison of the coagulopathies associated with COVID-19 and sepsis. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 5 (4), e12525 (2021).
  28. Guervilly, C., et al. Dissemination of extreme levels of extracellular vesicles: tissue factor activity in patients with severe COVID-19. Blood Advances. 5 (3), 628-634 (2021).
  29. Hisada, Y., Mackman, N. Measurement of tissue factor activity in extracellular vesicles from human plasma samples. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 3 (1), 44-48 (2019).
  30. Sachetto, A. T. A., et al. Tissue factor activity of small and large extracellular vesicles in different diseases. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 7 (3), 100124 (2023).
  31. Bom, V. J., Bertina, R. M. The contributions of Ca2+, phospholipids and tissue-factor apoprotein to the activation of human blood-coagulation factor X by activated factor VII. Biochemical Journal. 265 (2), 327-336 (1990).
  32. Tilley, R. E., Holscher, T., Belani, R., Nieva, J., Mackman, N. Tissue factor activity is increased in a combined platelet and microparticle sample from cancer patients. Thrombosis Research. 122 (5), 604-609 (2008).
  33. Gurung, S., Perocheau, D., Touramanidou, L., Baruteau, J. The exosome journey: from biogenesis to uptake and intracellular signalling. Cell Communication and Signaling. 19 (1), 47 (2021).
  34. Garnier, D., et al. Cancer cells induced to express mesenchymal phenotype release exosome-like extracellular vesicles carrying tissue factor. Journal of Biological Chemistry. 287 (52), 43565-43572 (2012).
  35. Park, J. A., et al. Tissue factor-bearing exosome secretion from human mechanically stimulated bronchial epithelial cells in vitro and in vivo. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 130 (6), 1375-1383 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

202

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved