Method Article
تؤثر المجموعة الهيكلية لألفا سينوكلين أحادي اللون على وظيفتها الفسيولوجية وخصائصها الفيزيائية الكيميائية. يصف هذا البروتوكول كيفية إجراء قياس الطيف الكتلي لتبادل الهيدروجين / الديوتيريوم بالمللي ثانية وتحليلات البيانات اللاحقة لتحديد المعلومات التوافقية عن مونومر هذا البروتين المضطرب جوهريا في ظل الظروف الفسيولوجية.
ألفا سينوكلين (aSyn) هو بروتين مضطرب في جوهره ، حيث تكون مجاميع الألياف وفيرة في أجسام ليوي والأعصاب ، والتي هي السمات المميزة لمرض باركنسون. ومع ذلك ، فإن الكثير من نشاطه البيولوجي ، وكذلك تجميعه ، ينطوي بشكل مركزي على شكل مونومر قابل للذوبان من البروتين. يتطلب توضيح الآليات الجزيئية لبيولوجيا aSyn والفيزيولوجيا المرضية طرقا عالية الحل هيكليا وحساسة للظروف البيولوجية. هياكلها المستقرة في الأصل تجعل aSyn الأحادي المستعصي على العديد من تقنيات البيولوجيا الهيكلية. هنا ، يتم وصف تطبيق أحد هذه النهج: قياس الطيف الكتلي لتبادل الهيدروجين / الديوتيريوم (HDX-MS) على مقياس زمني بالمللي ثانية لدراسة البروتينات ذات الاستقرار الديناميكي الحراري المنخفض وعوامل الحماية الضعيفة ، مثل aSyn. على النطاق الزمني للميلي ثانية ، تحتوي بيانات HDX-MS على معلومات حول إمكانية الوصول إلى المذيبات والبنية المستعبدة بالهيدروجين ل aSyn ، والتي يتم فقدانها في أوقات وضع العلامات الأطول ، مما يؤدي في النهاية إلى دقة هيكلية تصل إلى مستوى الأحماض الأمينية. لذلك ، يمكن أن يوفر HDX-MS معلومات بدقة هيكلية وزمنية عالية حول الديناميات التوافقية والديناميكا الحرارية ، والتفاعلات داخل الجزيئات وفيما بينها ، والتأثير الهيكلي للطفرات أو التغييرات في الظروف البيئية. على الرغم من أنه قابل للتطبيق على نطاق واسع ، إلا أنه تم توضيح كيفية الحصول على قياسات HDX-MS بالمللي ثانية وتحليلها وتفسيرها في aSyn الأحادية.
مرض باركنسون (PD) هو مرض تنكسي عصبي يؤثر على ملايين الأشخاص في جميع أنحاء العالم1. يتميز بتكوين شوائب سيتوبلازمية تعرف باسم أجسام ليوي وعصب ليوي في المادة السوداء في الدماغ في منطقة كومباكتا. وقد وجد أن هذه الشوائب السيتوبلازمية تحتوي على مجاميع من البروتين المضطرب جوهريا aSyn2. في PD وغيرها من اعتلالات synucleinopathies ، يتحول aSyn من حالة مضطربة قابلة للذوبان إلى حالة مرضية غير قابلة للذوبان وعالية الهيكلة. في شكله الأصلي ، يعتمد aSyn الأحادي مجموعة واسعة من التكوينات المستقرة من خلال التفاعلات الكهروستاتيكية طويلة المدى بين التفاعلات N- و C-termini والتفاعلات الكارهة للماء بين منطقة C-terminus ومكون بيتا غير الأميلويد (NAC)3،4،5،6. أي اضطرابات في تلك التفاعلات المستقرة، مثل الطفرات، والتعديلات اللاحقة للترجمة، والتغيرات في البيئة المحلية، يمكن أن تؤدي إلى سوء طي المونومر، وبالتالي إطلاق عملية التجميع7.
في حين أن هناك قدرا هائلا من الأبحاث حول الأشكال قليلة القلة والألياف من aSyn 8,9,10,11 ، هناك حاجة ماسة لدراسة الشكل الأحادي للبروتين وفهم أفضل للمطابقات الوظيفية (وكيف) والتي هي عرضة لتجميع 8,9,10,11 . نظرا لكونه مضطربا في جوهره ، وحجمه 14 كيلوداد فقط ، ويصعب تبلوره ، فإن مونومر aSyn غير قابل لمعظم التقنيات البيولوجية الهيكلية. ومع ذلك ، فإن إحدى التقنيات القادرة على قياس الديناميكيات التوافقية ل aSyn الأحادي هي HDX-MS بالمللي ثانية ، والتي ولدت مؤخرا ملاحظات هيكلية مهمة من شأنها أن تكون صعبة أو مستحيلة الحصول عليها بخلاف ذلك12،13،14. يقيس Millisecond HDX-MS بحساسية متوسط المجموعة التوافقية للبروتين من خلال مراقبة تبادل النظائر في هيدروجين الأميد ، مما يشير إلى إمكانية الوصول إلى المذيبات ومشاركة شبكة الترابط الهيدروجيني لمنطقة بروتين معينة على مقياس زمني بالمللي ثانية. من الضروري التأكيد على جانب المللي ثانية من HDX-MS لأنه ، نظرا لطبيعته المستقرة أصلا ، يعرض aSyn حركية سريعة جدا لتبادل الهيدروجين تظهر أقل بكثير من الحد الأدنى لأنظمة HDX-MS التقليدية. على سبيل المثال ، قام معظم جزيء aSyn باستبدال الهيدروجين بالكامل بالديوتيريوم تحت ظروف داخل الخلايا في أقل من 1 ثانية. وقد قامت عدة مختبرات الآن ببناء أجهزة سريعة الخلط. في هذه الحالة ، يتم استخدام نموذج أولي لأداة تدفق التبريد سريعة الخلط القادرة على أداء HDX-MS مع وقت ميت يبلغ 50 مللي ثانية ودقة زمنية تبلغ 1 مللي ثانية15. في حين أن HDX-MS بالمللي ثانية كان مؤخرا مهما للغاية في دراسة aSyn ، إلا أنه سيكون ذا قيمة في دراسة البروتينات / المناطق المضطربة داخليا على نطاق أوسع وعدد كبير من البروتينات ذات الحلقات / المناطق التي تكون مستقرة بشكل ضعيف فقط. على سبيل المثال ، أدوية الببتيد (على سبيل المثال ، الأنسولين; GLP-1 / الجلوكاجون. tirzepatide) وبروتينات اندماج الببتيد (على سبيل المثال ، مثبط فيروس نقص المناعة البشرية FN3-L35-T1144) هي أشكال دوائية رئيسية حيث يمكن أن تكون المعلومات الهيكلية والمستقرة في مرحلة الحل مدخلا حاسما لقرارات تطوير الأدوية ، ومع ذلك ، فإن الببتيد moiety غالبا ما يكون مستقرا بشكل ضعيف ومستعصيا بواسطة HDX-MS في الثواني الزمنية16،17،18،19،20 . وقد ثبت أن طرق HDX-MS الناشئة مع وضع العلامات في نطاقات الثواني / الدقائق تستمد معلومات هيكلية للحمض النووي G-quadruplexes ، ولكن يجب أن يكون من الممكن توسيع نطاق ذلك ليشمل هياكل قليلة النوكليوتيد الأكثر تنوعا عن طريق تطبيق HDX-MS21 بالمللي ثانية.
يمكن إجراء تجارب HDX-MS على ثلاثة مستويات مختلفة: (1) من أسفل إلى أعلى (حيث يتم هضم البروتين المسمى بشكل بروتيني) ، (2) من الوسط إلى الأسفل (حيث يتم هضم البروتين المسمى بشكل بروتيني ، ويتم تفتيت الببتيدات الناتجة بشكل أكبر بواسطة تقنيات التجزئة الناعمة) ، و (3) من أعلى إلى أسفل (حيث تقوم تقنيات التجزئة الناعمة بتجزئة البروتين المسمى مباشرة)22 . وبالتالي ، فإن بيانات HDX-MS دون الجزيئية تسمح لنا بتوطين سلوك التبادل إلى مناطق محددة من البروتين ، مما يجعل من الأهمية بمكان الحصول على تغطية تسلسل كافية لمثل هذه التجارب. تعتمد الدقة الهيكلية لأي تجربة HDX-MS على عدد الببتيدات المحللة للبروتين أو الشظايا المشتقة من البروتين عند الهضم أو التجزئة الناعمة ، على التوالي. في كل نوع من أنواع التجارب الثلاثة الموضحة أعلاه ، يتم تعيين التغيير في تبادل الأميد في كل ببتيد / جزء مرة أخرى على البنية الأساسية للبروتين للإشارة إلى سلوك المناطق الموضعية من البروتين. في حين يتم تحقيق أعلى دقة هيكلية من خلال التجزئة الناعمة ، فإن وصف هذه التجارب خارج نطاق الدراسة الحالية ، التي تركز على قياس تشكيلات مونومر aSyn. يمكن الحصول على نتائج ممتازة من خلال سير العمل "من أسفل إلى أعلى" المطبق بشكل شائع والموضح هنا.
هنا ، يتم توفير إجراءات حول (1) كيفية إعداد عينات aSyn والمخازن المؤقتة HDX-MS والتعامل معها ، (2) كيفية إجراء رسم خرائط الببتيد لتجربة HDX-MS من أسفل إلى أعلى ، (3) كيفية الحصول على بيانات HDX-MS على aSyn الأحادي في ظل الظروف الفسيولوجية ، وتحديدا في مجال الوقت بالمللي ثانية (باستخدام أداة مصممة خصيصا ؛ كما تم وصف الأدوات البديلة لوضع العلامات بالمللي ثانية) ، و (4) كيفية معالجة وتحليل بيانات HDX-MS. يتم توضيح الطرق التي تستخدم aSyn الأحادي عند درجة الحموضة الفسيولوجية (7.40) في حالتين من ظروف الحل هنا. على الرغم من أنها مفيدة للغاية في دراسة aSyn ، إلا أنه يمكن تطبيق هذه الإجراءات على أي بروتين ولا تقتصر على البروتينات المضطربة في جوهرها.
1. التعبير عن البروتين وتنقية aSyn
2. إعداد المخزن المؤقت HDX
ملاحظة: نظرا لأن Tris لديه معامل درجة حرارة مرتفع ، يجب ضبط قياس الرقم الهيدروجيني لدرجة الحرارة التي سيتم عندها إجراء تفاعل HDX ، وهي 20 درجة مئوية في هذا البروتوكول.
3. إجراء رسم خرائط الببتيد
4. دراسة تبادل الهيدروجين / الديوتيريوم بالمللي ثانية
5. معالجة البيانات
6. تحليل البيانات
نظرا لطبيعته المضطربة في جوهره ، من الصعب التقاط التغيرات الهيكلية المعقدة في aSyn عند درجة الحموضة الفسيولوجية. يراقب HDX-MS تبادل النظائر في هيدروجينات أميد العمود الفقري ، ويبحث في ديناميكيات وتفاعلات تكوين البروتين. إنها واحدة من التقنيات القليلة للحصول على هذه المعلومات بدقة هيكلية وزمنية عالية. ينطبق هذا البروتوكول على نطاق واسع على مجموعة واسعة من البروتينات وظروف التخزين المؤقت ، ويتجلى ذلك في قياس حركية التبادل ل aSyn في حالتين مختلفتين من المحلول: الحالة A والحالة B8 ، كما هو محدد في الخطوات 2.1.-2.2.
أولا ، تم إجراء تجربة رسم خرائط على aSyn ، وتم الحصول على خريطة تغطية الببتيد ، كما هو موضح في الشكل 1. تغطي الخريطة 100٪ من تسلسل البروتين ويبلغ متوسط التكرار 3.79. تشير قيمة التغطية بنسبة 100٪ إلى أن جميع الأحماض الأمينية في البروتين تم العثور عليها في هضم البروتين وستمكن من إجراء تحليل شامل لسلوك تبادل aSyn. تشير قيمة التكرار إلى عدد الببتيدات المتداخلة. وتزيد قيمة التكرار الأعلى من الدقة الهيكلية للخريطة النهائية، نظرا للتسطيح المطروح للبيانات للببتيدات المتداخلة32.
وباستخدام النموذج الأولي لأداة التدفق التبخيري سريع الخلط (انظر جدول المواد)، جمعت بيانات HDX-MS عالية الجودة وذات مقياس زمني ميلي ثانية عن aSyn عند الرقم الهيدروجيني 7.4 في الحالة ألف والحالة باء (الشكل 2). وبعد تعيين نظير في DynamX، تم الحصول على منحنيات امتصاص الديوتيريوم "الخام"، كما هو مبين في الشكل 3A. يظهر منحنيات امتصاص لثلاثة ببتيدات مختارة عبر كل مجال بروتين. يتم عرض دمج الديوتيريوم بمرور الوقت. يقع المحور x على مقياس زمني بالمللي ثانية ، والذي يتوافق مع الحركيات السريعة جدا ل aSyn في الظروف الفسيولوجية. تظهر المنطقة المظللة باللون الأحمر البيانات التي يتم الحصول عليها عادة من أدوات HDX التقليدية ، مع قياسات تبدأ من 30 ثانية. والأهم من ذلك، أنه لا يمكن زيادة تخفيض هذا عن طريق التلاعب بالأس الهيدروجيني لما يسمى ب "توسيع النافذة الزمنية"؛ هذا النهج غير صالح لدراسة البروتينات / المناطق المضطربة في جوهرها ، لأن تحول الرقم الهيدروجيني سيزعج المجموعة التوافقية للببتيد المتعدد المستقر بشكل ضعيف. كما يتضح هنا ، يتم تبادل معظم aSyn بالكامل بواسطة 1 s (الشكل 3C). يوضح هذا أهمية قياسات HDX بالمللي ثانية ل aSyn الأحادي حيث يتم التقاط منحنى الامتصاص الحركي الكامل لتفاعل التبادل ، مما يؤدي إلى القياس الأكثر دقة لتشكيلات المونومر.
قام HDfleX بإجراء تصحيح التبادل الخلفي باستخدام دمج الديوتيريوم الهضبة. وتم تركيب نقاط البيانات لاحقا وفقا للمعادلة 1، مما يوفر ثابت معدل ملحوظ، kobs، مما يدل على إمكانية الوصول إلى المذيبات ومشاركة الترابط الهيدروجيني لهذا الببتيد المعين (الشكل 3B).
المعادلة 1
حيث D t هو دمج الديوتيريوم في الوقت t ، nExp هو عدد المراحل الأسية ، N هو الحد الأقصى لعدد الهيدروجين الشفوي ، kobs هو ثابت سعر الصرف المرصود ، و β هو عامل تمدد30,33.
بعد تركيب المنحنى ، يمكن حساب منطقة الامتصاص تحت المنحنى المجهز عن طريق دمج الوظيفة المجهزة التي تصف منحنى الامتصاص داخل النافذة الزمنية التجريبية. تم إجراء تحليلات ذات دلالة إحصائية بين منطقة الاستيعاب في الدولتين. أولا ، تم حساب عتبة الأهمية العالمية لمنطقة الامتصاص في HDfleX عند مستوى ثقة قدره 95٪. ثم تم إنشاء مخططات فرق مساحة الامتصاص ، مما يدل على الفرق بين الحالة A والحالة B على مستويين من الدقة الهيكلية: دقة الببتيد (الشكل 4A) واستبانة الأحماض الأمينية (الشكل 4B). يوضح مخطط فرق دقة الببتيد الفرق في منطقة الامتصاص بين الحالة A والحالة B لكل ببتيد فردي ، بينما يوضح مخطط فرق دقة الأحماض الأمينية الفرق في منطقة الامتصاص بين الحالة A والحالة B المسطحة عبر تسلسل الأحماض الأمينية بالكامل من aSyn30,34. تشير كلتا المخططين إلى امتصاص أكبر للديوتيريوم بشكل عام في جميع أنحاء مونومر aSyn في الحالة B مقارنة بالحالة A. يمكن تبرير هذه النتيجة من خلال فحص مخططات امتصاص الديوتيريوم في الشكل 3 ، حيث يكون منحنى امتصاص الحالة B دائما أعلى من منحنى امتصاص الحالة A. علاوة على ذلك ، يمكن ملاحظة أن حجم الفرق في منطقة الامتصاص أعلى بكثير في المحطة C. مرة أخرى ، يمكن تبرير ذلك من خلال التتبع مرة أخرى إلى منحنيات الامتصاص الأصلية ، حيث تظهر الببتيدات الطرفية C (الببتيدات 124-140 الموضحة في الشكل 3) فجوة أكبر بكثير بين منحنيات الامتصاص من بقية البروتين. في الختام ، تسبب ظروف الحل في الحالة B زيادة في التعرض للمذيبات أو انخفاضا في مشاركة شبكة الترابط الهيدروجيني في جميع أنحاء البروتين ولكن أكثر من ذلك في المحطة C.
الشكل 1: خريطة تغطية الببتيد ل aSyn من النوع البري مع ما مجموعه 30 ببتيدا وتغطية تسلسل 100٪. يتم تمييز المجالات الثلاثة ل aSyn على النحو التالي: N-terminus (أزرق) ، ومنطقة مكون بيتا غير أميلويد (أصفر) ، و C-terminus (أحمر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: سير العمل لتجربة HDX-MS بالمللي ثانية على aSyn. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: مثال على مخططات الامتصاص من ثلاثة ببتيدات مختارة عبر المجالات الثلاثة ل aSyn للحالة A (الأصفر) والحالة B (الأزرق). (A) مؤامرة الامتصاص المصححة غير المجهزة وغير التبادلية الخلفية. (ب) قطع الامتصاص المصححة والمجهزة والتبادل الخلفي. تمثل المنطقة المظللة باللون الأحمر البيانات التي يمكن الحصول عليها بواسطة أنظمة HDX-MS التقليدية ، والتي تبدأ عادة من 30 ثانية. تتوافق أشرطة الخطأ مع الانحراف المعياري للنسخ المتماثلة الثلاثة. (ج) مخطط خريطة الحرارة للنسبة المئوية لامتصاص الديوتيريوم عبر تسلسل الأحماض الأمينية لكل نقطة زمنية. يمثل شريط اللون النسبة المئوية لامتصاص الديوتيريوم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: مخططات فرق مساحة الامتصاص عند أقصى وقت لهضبة المنحنى (14084 مللي ثانية) (أ) تظهر مخططات استبانة بقايا الببتيد فرق منطقة امتصاص كل ببتيد بين الحالة ألف والحالة ب. (ب) مخطط استبانة الأحماض الأمينية الذي يوضح فرق مساحة الامتصاص بين الحالة ألف والحالة باء التي تم تسويتها عبر تسلسل الأحماض الأمينية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
رسم خرائط مستوى الطاقة | الجهد المنحدر (V) |
منخفض | 20-40 |
متوسط | 25-45 |
عال | 30-50 |
مرتفع جدا | 35-55 |
الجدول 1: رسم خرائط لمستويات الطاقة والجهد اللاحق لمنحدر النقل.
في هذه المقالة ، يتم وصف الإجراءات التالية: (1) إجراء تجارب رسم خرائط الببتيد على aSyn الأحادي للحصول على أعلى تغطية تسلسلية ، (2) الحصول على بيانات HDX-MS بالمللي ثانية على aSyn الأحادي في ظل الظروف الفسيولوجية ، و (3) إجراء تحليل البيانات وتفسير بيانات HDX-MS الناتجة. الإجراءات المقدمة سهلة التنفيذ بشكل عام ، وعادة ما تستمر كل تجربة وضع علامات حوالي 8 ساعات فقط لثلاث نسخ متماثلة وثماني نقاط زمنية ، وتستمر تجربة رسم الخرائط حوالي 2 ساعة فقط. بالنظر إلى الأجهزة الآلية بالكامل المستخدمة هنا ، يمكن الحصول على مجموعة بيانات كاملة في يوم 1. ومع ذلك ، عند التعامل مع العينات وإعداد المخازن المؤقتة ، يجب توخي الحذر لضمان اشتقاق القياسات من البروتين المستقر بشكل ضعيف (أو مناطق البروتين) في الحالة المطلوبة. الأهم من ذلك ، أظهرت دراسة سابقة أن ظروف التخزين المختلفة ، مثل التجميد والتجميد ، أدت إلى مطابقات مختلفة لمونومر aSyn وأنه من المهم توصيف التأثير المحتمل لمعالجة العينات على المجموعة التوافقية لمونومر aSyn10. في الواقع ، HDX-MS هو مقياس حساس للغاية لمثل هذه الاضطرابات التوافقية ، مع نطاق ديناميكي من ميكروثانية إلى أشهر على الأقل. بالإضافة إلى ذلك ، إذا كانت تدرس بدقة مونومر aSyn فقط ، ينصح بشدة بالترشيح لإزالة الأوليغومرات والألياف غير المرغوب فيها التي قد تكون تشكلت في العينة عند التخزين أو المناولة. وعلاوة على ذلك، يجب التحكم بإحكام في المخازن المؤقتة HDX-MS في حدود 0.05 من الرقم الهيدروجيني أو pD المطلوب، لأن أي تناقضات ستؤثر بشكل كبير على سعر الصرف الجوهري وتؤدي إلى أخطاء غير مرغوب فيها. من المهم أيضا ملاحظة أن المقارنات بين ظروف المحلول لأي بروتين يختلف في درجة الحموضة أو درجة الحرارة أو تكوين الملح ستغير المعدل الداخلي. ولذلك، ستتطلب هذه البيانات مزيدا من التصحيحات، مثل تطبيق عامل تعديل الأس الهيدروجيني 35 أو عامل التصحيح التجريبي 8,30.
من حيث الأجهزة ، لا توجد أنظمة متاحة تجاريا تسمح بالحصول على بيانات HDX-MS بالمللي ثانية. طورت العديد من المجموعات البحثية أنظمتها الخاصة ، من أنظمة تدفق التبريد13،15،36 إلى رقائق الموائع الدقيقة37،38،39 لالتقاط حركية التبادل السريع لبعض البروتينات. تعرف طريقة أخرى تم استخدامها لتحقيق بيانات HDX-MS ذات المقياس الزمني بالمللي ثانية باسم طريقة التوسع الزمني40,41 ، حيث يتم تقليل الرقم الهيدروجيني للمخازن المؤقتة لإبطاء حركية التبادل. ومع ذلك ، لا تنطبق هذه الطريقة على aSyn (أو على أي ميزات بروتين مستقرة بشكل ضعيف) حيث أن (1) خفض الرقم الهيدروجيني يغير بشكل كبير كثافة شحنة البروتين ويزيد من معدل التجميع 8,42 ، و (2) تكون مطابقات aSyn مستقرة فقط ومن المحتمل أن تنزعج من هذه التغييرات في الأس الهيدروجيني. لهذه الأسباب ، يوصى بالحفاظ على درجة حموضة متسقة في المخازن المؤقتة HDX-MS عند دراسة تشكيلات aSyn الأحادية ، ما لم تكن ذات صلة من الناحية الفسيولوجية ، واستخدام أداة وضع العلامات بالمللي ثانية.
معظم مونومر aSyn يتبادل بالكامل في غضون 1 ثانية ، وعلى الأكثر ، يستغرق الأمر حوالي 15 ثانية للتبادل الكامل مع الديوتيريوم (الشكل 3) عند درجة حموضة ذات صلة فسيولوجيا تبلغ 7.4 (تعكس الظروف الخلوية داخل الخلايا في ما قبل المشبك العصبي). إن استخدام أنظمة HDX-MS التقليدية ، بدءا من 30 ثانية غير مناسب لأن بيانات HDX-MS تتوافق مع هضبة تفاعل التبادل ، والتي لا توفر أي معلومات توافقية مفيدة. ومع ذلك ، فإن الحد الأدنى لقياس أداة HDX بالمللي ثانية (المقابلة ل "الوقت الميت" البالغ 50 مللي ثانية) يتيح مراقبة تفاعل التبادل من إكمال ~ 25٪ لمونومر aSyn عند درجة الحموضة 7.4. سمح لنا ذلك بالتقاط غالبية منحنى الامتصاص الحركي. يوفر تركيب منحنى امتصاص الديوتيريوم مع المعادلة 1 معلومات حركية مهمة. وهو يتوافق مع تقدير ثابت المعدل المرصود ، kobs. على الرغم من عدم تغطيتها هنا ، إلا أنه من الممكن إجراء تجارب حركية التجميع وفحص مورفولوجيا الألياف في aSyn تحت نفس ظروف الحل مثل تجارب HDX-MS لأن HDX-MS متسامح للغاية مع مجموعة واسعة من المخازن المؤقتة8. وهكذا ، على سبيل المثال ، يمكن ربط kobs من تجربة HDX-MS بنتائج تجارب التجميع لاكتساب نظرة ثاقبة حول أي التكوينات هي الأكثر عرضة لبعض سلوكيات التجميع ومورفولوجيا الليف.
بالنسبة للحالة البسيطة لتجارب HDX-MS التفاضلية ، حيث يجب مقارنة شرطين أو أكثر من متغيرات البروتين ، يمكن دمج المنطقة الموجودة تحت منحنى الامتصاص المجهز لكل حالة ومقارنتها ببعضها البعض. وفي هذه الدراسة، تمت مقارنة مناطق الاستيعاب في الدولة ألف والدولة باء على مستويين مختلفين من الاستبانة الهيكلية: استبانة الببتيد واستبانة الأحماض الأمينية، وكلاهما له نقاط قوة وتحديات متميزة. فعلى سبيل المثال، تعكس بيانات استبانة الببتيد البيانات الطيفية الخام بشكل أوثق وخضعت لأقل قدر من المعالجة. ومع ذلك ، فإن بيانات استبانة الأحماض الأمينية "المسطحة" تسمح بدمج كل من معلومات الببتيد والتجزئة الناعمة في ناتج واحد بدلا من مخرجات منفصلة غير قابلة للدمج ، وفي النهاية ، تقدم البيانات بأعلى دقة هيكلية. أحد القيود المفروضة على الكشف عن قياس الطيف الكتلي لوضع العلامات HDX هو التحدي المتمثل في الحصول على دقة الأحماض الأمينية. في حين أن تقنيات "التجزئة الناعمة" ، مثل تفكك نقل الإلكترون (ETD) ، وتفكك التقاط الإلكترون (ECD) ، والتفكك الضوئي فوق البنفسجي (UVPD) ، أثبتت فعاليتها في توليد دقة أعلى ، إلا أنها لا تزال صعبة وغير متوقعة وغير فعالة30،43،44،45،46،47،48.
بالمقارنة مع التقنيات الهيكلية الأخرى ، يتمتع HDX-MS بالمللي ثانية بميزة فريدة تتمثل في التقاط الديناميكيات التوافقية ل aSyn الأحادي بدقة هيكلية وزمنية عالية. نظرا لأن حركية التبادل السريع للمونومر لم تعد عاملا مقيدا ، يمكن إجراء المزيد من الدراسات على aSyn الأحادي مع طفرات مختلفة ، وتعديلات ما بعد الترجمة ، ومكونات الملح وتركيزاته ، وشركاء الربط في درجة الحموضة الفسيولوجية. يمكن أن يوفر ربط نتائج HDX-MS بالدراسات الوظيفية ، مثل حركية التجميع ومورفولوجيا الألياف ، نظرة ثاقبة على المطابقات التي إما تعزز الوظيفة الخلوية الطبيعية أو تكون عرضة للأمراض. في نهاية المطاف، من المتوقع أن يكون هذا المللي ثانية HDX-MS حاسما لاكتشاف الأدوية المستهدفة التي تعمل على استقرار مطابقات محددة مقبولة من الناحية الفسيولوجية.
ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود مصالح متنافسة.
يتم تمويل NS من قبل منحة اليوبيل الماسي لمجلس الجامعة. يتم دعم JJP من خلال زمالة UKRI Future Leaders [رقم المنحة: MR/T02223X/1].
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 × 100 mm ACQUITY BEH 1.7 μm C18 column | Waters Corporation | 186002346 | Analytical column |
Acetonitrile HPLC grade >99.9% HiPerSolv | VWR | 20060.420 | For LC mobile phases |
CaCl2 | Sigma Aldrich | C5670 | Salt for HDX buffers |
Chronos | Axel Semrau (Purchased from Waters Corporation) | 667006090 | Scheduling software to enable multiple HDX-MS sample injections automatically. Alternative software is available from other vendors e.g. HDXDirector or LEAP Shell |
Deuterium chloride | Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) | DLM-2-50 | For HDX labelling buffers |
Deuterium oxide (99.9% D2O) | Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) | DLM-4 | Deuterated water |
DynamX 3.0 | Waters Corporation | 176016027 | Isotopic assignment and deuterium incorporation calculation |
Enzymate BEH Pepsin Column | Waters Corporation | 186007233 | Pepsin digestion column |
Formic Acid, 99.0% LC/MS Grade | Fisher Scientific | 10596814 | For LC mobile phases |
Guanidinium hydrochloride | Sigma Aldrich | RDD001-500G | Chaotrope/Denaturant |
HDfleX | University of Exeter | N/A | https://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982 |
KCl | Sigma Aldrich | P3911 | Salt for HDX buffers |
LEAP HDX-2 CTC PAL sampling robot | Waters Corporation | 725000637 | Autosampler robot |
Leucine enkephalin | Waters Corporation | 186006013 | For mass spectrometry lockspray calibration. |
MassLynx | Waters Corporation | 667004007 | Software controlling inlet methods and mass spectrometer |
Maximum recovery vials | Waters Corporation | 600000670CV | 100 pack including caps - used for quench tray in LEAP HDX-2 |
MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | Salt for HDX buffers |
Millipore 0.22 µm syringe filters | Millipore | N9CA7069B | Syringe filters |
ms2min | Applied Photophysics Ltd | N/A | fast-mix quench-flow millisecond hdx instrument |
NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | Salt for HDX buffers |
Peltier temperature controller | LEAP Technologies Inc. | HP115-COOL/D | Peltier controller to set precise temperature of chambers in the LEAP robot. |
ProteinLynx Global Server 3.0 | Waters Corporation | 715001030 | Peptide identification software. Alternative software is available from other vendors. |
Reagent pot caps | Waters Corporation | 186004632 | 100 pack |
Reagent pots for LEAP HDX-2 | Waters Corporation | 186001420 | 100 pack excluding caps - used for buffers in LEAP HDX-2 |
Sodium deuteroxide (99.5% in D2O) | Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) | DLM-57 | For HDX labelling buffers |
Spin filter microcentrifuge tubes (3 kDa MWCO) | Amicon (Merck Sigma Aldrich) | UFC5003 | Micro centrifuge tubes to concentrate protein. This facilitates buffer exchange and accurate sample loading for HDX-MS experiments. |
Synapt G2-Si mass spectrometer | Waters Corporation | 176850035 | Mass spectrometer |
Total recovery vials | Waters Corporation | 600000671CV | 100 pack including caps - used for labelling tray in LEAP HDX-2 |
Tris-HCl | Sigma Aldrich | T3253-250G | Buffer |
Trizma base | Sigma Aldrich | T60040-B2005 | Buffer |
Urea | Sigma Aldrich | U5378-1KG | Chaotrope/Denaturant |
VanGuard 2.1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 column | Waters Corporation | 186004623 | Trap desalting column |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved