تحليل تمايز الخلايا ، والتشكل ، والتنميط أثناء التكوين الجنيني للدجاج باستخدام فحص الخرز المنقوع

تتضمن مقايسة الخرزة المنقوعة التسليم المستهدف لكاشف الاختبار في أي نقطة زمنية تنموية لدراسة تنظيم تمايز الخلايا وتكوين المورفوجينيا. يتم تقديم بروتوكول مفصل ، ينطبق على أي نموذج حيواني تجريبي ، لإعداد ثلاثة أنواع مختلفة من الخرز المنقوع وزرعها في الأرقام الداخلية لجنين الدجاج.

يتم تنشيط العديد من البرامج الجينية أثناء التطور الجنيني الذي ينسق تمايز الخلايا لتوليد تنوع مذهل من الخلايا الجسدية والأنسجة والأعضاء. يتم تنظيم التنشيط الدقيق لهذه البرامج الجينية بواسطة مورفوجينات ، وهي جزيئات قابلة للانتشار توجه مصير الخلية عند عتبات مختلفة. يتطلب فهم كيفية تنسيق التنشيط الجيني للمورفوجينيا دراسة التفاعلات المحلية التي تسببها المورفوجينات أثناء التطور. يتيح استخدام الخرز المنقوع في البروتينات أو الأدوية المزروعة في مناطق متميزة من الجنين دراسة دور جزيئات معينة في إنشاء الأرقام والعمليات التنموية الأخرى. توفر هذه التقنية التجريبية معلومات عن التحكم في تحريض الخلايا ومصير الخلية وتكوين الأنماط. وبالتالي ، فإن اختبار الخرز المنقوع هذا هو أداة تجريبية قوية وقيمة للغاية تنطبق على النماذج الجنينية الأخرى.

سمحت لنا الاختراقات في الآليات الجزيئية التي تتحكم في التعبير الجيني أثناء التطور الجنيني بفهم كيفية تحديد مصير الخلية. يحدث الالتزام بسلالات الخلايا المختلفة بمجرد أن تبدأ الخلايا التعبير الجزيئي لعوامل النسخ¹. يتم تنسيق نمط التعبير هذا بشكل كبير في المكان والزمان ، وبالتالي يوجه تشكيل وتحديد المواقع ونمط الخلايا والأنسجة والأعضاء¹،²،^3،4،5. الحث الجنيني هو العملية التي تلتزم بها الخلايا بسلالات محددة من خلال إنشاء تسلسلات هرمية تقيد إمكانات الخلايا ، والتي تشمل حتى توليد خطة الجسم الأساسية كما يحدث مع منظم سبيمان ^6,7. تحفز الشفة الظهرية البلاستوبور محورا جنينيا ثانيا في الجنين المضيف ^8,9. اليوم ، بمساعدة التطعيم والتجارب الكلاسيكية الأخرى جنبا إلى جنب مع النهج الجزيئية ، من المعروف أن عوامل النسخ المختلفة وعوامل النمو تعمل على توجيه الحث الجنيني في منظم سبيمان¹⁰. وبالتالي ، فإن التلاعب التجريبي هو أداة مهمة لفهم تمايز الخلايا ، وتكوين التشكل ، وعمليات النقش أثناء تكوين الجنين.

ومن المثير للاهتمام ، في الأنظمة الجنينية حيث يكون زرع الأنسجة صعبا أو عندما تكون المحفزات معروفة بالفعل ، يتم استخدام الناقلات لتوصيل الجزيئات (على سبيل المثال ، البروتينات والمواد الكيميائية والسموم ، وما إلى ذلك) لتنظيم تمايز الخلايا ، والتشكل ، وحتى النقش. يتضمن أحد هذه الأنظمة الحاملة زرع حبات غارقة في جزيء معين في أي كائن حي تجريبي في أي نقطة زمنية للتطور لتحديد تأثير الكاشف المذكور أو توجيه تمايز النموذج المذكور. على سبيل المثال ، من خلال زرع حبات منقوعة بحمض الريتينويك (RA) في برعم أطراف جناح الدجاج ، أثبتت Cheryl Tickle et al. (1985) أن RA يحفز التعبير عن القنفذ الصوتي في منطقة نشاط الاستقطاب (ZPA) ^11,12. تم استخدام نفس الاستراتيجية التجريبية لاكتشاف أن التهاب المفاصل الروماتويدي يتحكم في عدم تناسق السوميت وموت الخلايا في برعم الأطراف أثناء تطور الأرقام وفي مناطق الأطراف الجنينية الأخرى¹³،^14،15. تم استخدام عوامل أخرى ، وخاصة البروتينات (على سبيل المثال ، عوامل نمو الخلايا الليفية [FGF] ، وتحويل عامل النمو بيتا [TGF-ß]) لتحفيز الأطراف في أجنحة الأجنة المبكرة والأرقام الجديدة في المنطقة بين الرقمية ، على التوالي¹⁶،^17،18،¹⁹،^20،21 . تثبت هذه التجارب قوة وفائدة هذه التقنية في تحديد مرحلة التزام أو كفاءة الأنسجة أو مجموعات الخلايا المعرضة للجزيئات.

في هذا البروتوكول ، كان طرف الفرخ في مرحلة تكوين الأرقام بمثابة النموذج التجريبي لتقديم خطوة بخطوة كيفية تحضير وزرع الخرز المنقوع. ومع ذلك ، فإن هذه الأداة التجريبية لا تقتصر على هذا التطبيق ولكن يمكن استغلالها في أي نموذج حيواني تجريبي وفي أي نقطة زمنية في المختبر وفي الجسم الحي لدراسة الحث والتمايز وموت الخلايا والنمط.

تمت مراجعة هذا البحث والموافقة عليه من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لرعاية واستخدام المختبر التابع لمعهد التحقيقات الطبية الحيوية ، الجامعة الوطنية المستقلة في المكسيك (UNAM ، مكسيكو سيتي ، المكسيك).

1. حضانة البيض وتدريج الأجنة

ملاحظة: يمكن الحصول على بيض الدجاج المخصب من المزارع المحلية. يتم استخدام بيض الدجاج الأبيض المخصب Leghorn الأكثر استخداما. تخزين بيض الدجاج المخصب الطازج في 15 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد قبل الحضانة.

1. احتضن بيض الدجاج المخصب عموديا مع الجانب المدبب لأسفل في حاضنة رطبة عند 38 درجة مئوية ورطوبة نسبية 70٪ حتى تصل إلى مرحلة 28 HH (حوالي 5.5 أيام وفقا لهاميلتون وهامبورغر ، 1951)²². قم بتدوير البيض أثناء الحضانة لمنع الجنين من الالتصاق بغشاء القشرة.
   ملاحظة: يتم اختيار المرحلة التنموية من خلال الأهداف التجريبية. في هذه الحالة ، تكون مرحلة 28 HH مثالية لزرع الخرز بين الأرقام للحث على رقم خارج الرحم أو تعزيز موت الخلايا.
2. قم بإزالة البيض من الحاضنة ، ومسحه بالإيثانول بنسبة 70٪ ، واتركه ليجف في الهواء. تطهير منطقة العمل والمجاهر والأدوات بنسبة 70٪ من الإيثانول.
3. شمعة البويضة لتحديد الأوعية الدموية وتحديد موقع الجنين. تخلص من البيض الذي ليس لديه جنين.
4. باستخدام نهاية الملقط غير المسنن ، افتح نافذة في حوالي خمس بيضات عن طريق النقر على الطرف الحاد للبيضة ، وقم بإزالة قسم^{1-cm 2} من القشرة باستخدام الملقط.
5. انقل البيضة إلى حامل كرتوني أو بلاستيكي وضعها تحت المجهر المجسم. قم بإزالة غشاء الهواء عن طريق ثقبه وسحبه للخارج باستخدام ملقط جراحي دقيق. قم بإزالة أي قطعة صغيرة من قشر البيض يمكن أن تتصل بالجنين.
   ملاحظة: غشاء الهواء هو الغشاء الأبيض غير الشفاف الذي لوحظ مباشرة بعد نافذة البيضة.
6. راقب تحت المجهر أثناء فتح الكيس الأمنيوسي قليلا ، وتمزيقه باستخدام الملقط الجراحي الدقيق. احرص على عدم إتلاف الأوعية الدموية للغشاء المشيمي.
   ملاحظة: السلى هو الغشاء الشفاف المحيط بالجنين عن كثب والذي يغلفه في السائل الأمنيوسي.
7. مرحلة الأجنة في البيضة لتحديد ما إذا كانت في المرحلة المطلوبة. يمكن إعادة الأجنة في المراحل المبكرة إلى الحاضنة بعد إغلاق نافذة قشر البيض بشريط.

2. إعداد الخرز

ملاحظة: اعتمادا على الهدف التجريبي والعلاج المعني ، قد تكون أنواع الخرز البديلة (على سبيل المثال ، Affi-Gel ، AG1-X2 ، الهيبارين) أكثر ملاءمة. تعتبر حبات Affi-Gel مثالية للبروتينات (على سبيل المثال ، TGF-ß1) ، في حين أن حبات الهيبارين مثالية لعوامل النمو (على سبيل المثال ، FGFs ، WNT) وخرز AG1-X2 للمواد الكيميائية القابلة للذوبان في المذيبات العضوية (على سبيل المثال ، DMSO).

1. تحضير حبة Affi-Gel والهيبارين
   1. قطع مربع من parafilm لتناسب طبق بتري 45 ملم. ضع البارافيلم عبر الجزء السفلي من طبق بتري لتغطيته وتثبيته في الجزء السفلي من طبق بتري عن طريق دفع كل قمة باستخدام نهاية ملقط غير مسننة. جانبا.
   2. باستخدام ماصة أو ملعقة ، انقل الخرز إلى أنبوب طرد مركزي دقيق واغسلها مرتين في 1x PBS عن طريق الاستقرار والسحب.
   3. انقل ~ 40-50 حبة مع ماصة دقيقة إلى وسط طبق بتري المظلي من الخطوة 1.
   4. باستخدام المجهر ، حدد ~ 30 Affi-Gel أو حبات الهيبارين ~ 100 ميكرومتر في القطر للاستخدام. استخدام شبكة عدسة المجهر لتحديد حجم الخرز أو استخدام الرقم البيني الثالث لجنين HH 28 كمرجع ؛ يجب أن تكون الخرزة أصغر من الأرقام البينية.
   5. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من PBS الزائد المحيط بالخرز بعناية وانقعه في 2-5 ميكرولتر من محلول العلاج. تأكد من أن الحل يغطي الخرز بالكامل.
   6. في موازاة ذلك ، قم بإعداد حبات التحكم عن طريق النقع في محلول يحتوي على نفس كمية السيارة المستخدمة في محلول المعالجة التجريبية.
      ملاحظة: يجب حساب التركيزات لكل علاج وفقا للتجربة. استخدم معدات الحماية الشخصية المناسبة عند التعامل مع الكواشف التي يحتمل أن تكون ضارة.
   7. احتضان الخرز في المحلول لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. لمنع الخرز من الجفاف أثناء الحضانة ، ماصة بضع قطرات من 1x PBS أو الماء حول الخرز لترطيب الجو المحلي وتغطية الطبق بالبارافيلم لإبطاء التبخر.
   8. ضع طبق البتري على الثلج وازرع الخرز في نفس اليوم.
2. AG 1-X2 إعداد حبة
   1. قطع مربع من parafilm لتناسب طبق بتري 45 ملم. قم بتغطية الجزء السفلي من طبق بتري بالبارافيلم واللصق عن طريق دفع كل قمة باستخدام نهاية ملقط غير مسننة. جانبا.
   2. استخدم ملعقة لنقل حبات AG 1-X2 إلى أنبوب جهاز طرد مركزي صغير. أضف 30-50 ميكرولتر من محلول المعالجة عند التركيز النهائي المطلوب.
   3. في موازاة ذلك ، احتضن حبات التحكم في محلول مع السيارة وحدها ، محضرة بدون المادة الكيميائية التجريبية أو البروتين ذي الاهتمام.
   4. احتضن الخرز لمدة 20 دقيقة بينما تهتز ببطء في درجة حرارة الغرفة. لف أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة بورق القصدير للحماية من الضوء أثناء كل فترة حضانة ، نظرا لأن العديد من هذه الجزيئات حساسة للضوء
   5. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المحلول باستخدام ماصة ووصمة عار مع 2٪ من الفينول الأحمر المذاب في الماء في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين مع إثارة خفيفة في دوامة.
      ملاحظة: صباغة حبات AG 1-X2 الشفافة تسهل زرعها في الجنين.
   6. إزالة 2٪ الفينول الأحمر وغسل الخرز مرتين في 1x PBS لإزالة أي صبغة زائدة.
   7. باستخدام طرف ماصة دقيقة ، انقل حبات 40-50 AG 1-X2 إلى وسط طبق Petri المغطى بالبارافيلم المحضر في الخطوة 1 وانقعها في 5 ميكرولتر من 1x PBS. تحت المجهر ، حدد حوالي 30 خرزة قطرها ~ 100 ميكرومتر في الحجم. تخلص من الخرز غير المستخدم.
   8. الخرز جاهز للزرع. تأكد من غمر الخرز في PBS طوال عملية الزرع عن طريق سحب بضع قطرات من 1x PBS أو الماء حول الخرز لترطيب الجو المحلي و / أو تغطية الطبق بالبارافيلم لإبطاء التبخر.

3. التلاعب بالأجنة وزرع بين الأرقام

1. قبل التلاعب بالأجنة ، رتب مجهرين ستيريويين بجوار بعضهما البعض على سطح الطاولة. أحدهما للتلاعب بالجنين وزرع الخرز ، والآخر هو للحفاظ على الخرز المعالج جاهزا للزرع في الجنين.
2. باستخدام ملقط غير مسنن ، قم بإنشاء نافذة في البيض المتبقي كما هو موضح في قسم حضانة البيض وتدريج الجنين.
3. تحت المجهر ، افتح الكيس الأمنيوسي عن طريق تمزيق الغشاء الأمنيوسي بملقط جراحي دقيق بالقرب من الطرف الخلفي الأيمن فقط بالكمية اللازمة لإنجاز الإجراء (أي بأقل قدر ممكن).
4. باستخدام ملقط ناعم ، أمسك الجنين بالغشاء الأمنيوسي لفضح الطرف الخلفي الأيمن. باستخدام إبرة التنغستن الدقيقة ، قم بعمل ثقب يتمركز في أقصى الحدود من الرقم الثالث من الطرف الخلفي.
5. دون إطلاق الجنين والطرف الخلفي المكشوف ، خذ حبة معالجة واحدة من المجهر الآخر باستخدام أحد أطراف الملقط. يجب أن يكون الملقط في وضع مفتوح حتى تلتصق حبة واحدة بطرف الملقط.
6. انقل الخرزة إلى جنين الفرخ بالقرب من الطرف الخلفي وضعها فوق الثقب بين الأرقام.
7. أغلق الملقط للضغط على الخرزة حتى تدخل الحفرة.
8. حرر الجنين وأغلق نافذة قشر البيض بشريط.
9. أعد البيض إلى الحاضنة حتى يصل إلى المرحلة المطلوبة. كرر الإجراء حتى يتم الوصول إلى العدد المطلوب من الأجنة التي تم التلاعب بها. من الضروري التأكد من أن الخرز لا يجف في أي وقت.
   ملاحظة: لمراقبة إصبع خارج الرحم كامل ، احتضن لمدة ~ 72 ساعة بعد زرع الخرزة. في المقابل ، يتم التعبير عن جينات التمايز المبكر (على سبيل المثال ، Sox9) بعد حوالي 30 دقيقة من زرع حبة غارقة في TGF-ß1.

استخدام الخرز المنقوع لتقييم سلوك الخلية في طرف الفرخ الجنيني
لضمان فعالية هذا الفحص ، يجب وضع الخرزة باستمرار وبدقة في الموقع الصحيح ؛ في هذه الحالة ، فإن الجزء البعيد من الرقم البيني الثالث تحت التلال القمية للجلد الخارجي AER (الشكل 1A). يسمح هذا الوضع للجزيء المعني بالانتشار بالتساوي في جميع أنحاء الأنسجة الرقمية. علاوة على ذلك ، تحتوي المنطقة الموجودة أسفل AER على خلايا غير متمايزة تستجيب بسهولة للعلاج. لتقييم التأثيرات على تمايز الخلايا ، يمكن تلطيخ الأجنة باللون الأزرق الألسياني والأحمر أليزارين لإثبات تكوين عناصر الهيكل العظمي (الشكل 1 ب). كما أن مقايسة الخرز المنقوع مناسبة تماما لتقييم موت الخلايا باللون الأحمر المحايد (الشكل 1C) وتنظيم الجينات عن طريق التهجين في الموقع (الشكل 1D). يتم تعيين شريط المقياس عند 250 ميكرومتر.

الشكل 1: زرع الخرزة في الأنسجة الرقمية لطرف الفرخ. أ )الموقع الصحيح للخرزة المنقوعة تحت AER في طرف خلفي 28 HH. (ب) الأزرق السياني والأحمر أليزارين تلطيخ الهيكل العظمي دليل على تشكيل رقم خارج الرحم الناجم عن 4 أيام بعد زرع حبة غارقة TGF-ß1. (ج) علامات تلطيخ حمراء محايدة تحريض موت الخلايا (رأس السهم) 24 ساعة بعد زرع حبة غارقة في RA في الأنسجة الرقمية في مرحلة 28 HH. (د) التهجين Sox9 في الموقع 4 ساعات بعد زرع حبة غارقة TGF-ß1. يتم تعيين شريط المقياس عند 250 ميكرومتر. الصور المعروضة في B و C مأخوذة من Díaz-Hernández et al.23,24. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الميزة الرئيسية للأداة التجريبية المفصلة في هذا البروتوكول هي القدرة على التحكم في وقت وموقع التعرض للخرز المنقوع في جزيء تجريبي معين. يوفر الجمع بين تحديد المواقع الصحيح والتوقيت التنموي الدقيق إمكانيات هائلة لدراسة عمليات تمايز الخلايا. يتيح إجراء هذه التجارب في الأنسجة غير المتمايزة التحقيق في الأحداث الحاسمة الأولى في النسب الخلوي. على سبيل المثال ، يؤدي وضع حبة غارقة في TGFß في الأنسجة الرقمية للأطراف الجنينية 28 HH إلى تكوين رقم خارج الرحم يتم فيه تشغيل شلال جزيئي يحفز التعبير الجيني للجيل الرئيسي Sox9²⁵. ومن اللافت للنظر أن أنسجة الغضروف المستحثة تنظم أيضا في رقم مع تشكيل الكتائب.

ومن المثير للاهتمام أن التهاب المفاصل الروماتويدي يؤدي إلى موت الخلايا في نفس المنطقة بين الرقمية من خلال تنظيم التعبير الجيني للبروتينات المورفوجينية العظمية التي توجه مصير الخلايا غير المتمايزة نحو موت الخلية¹⁰. وبالتالي ، يمكن التحقيق في تمايز الخلايا ، وموت الخلايا ، والتشكل ، والأنماط في وقت واحد في نفس المنطقة من الجنين وتكييفها مع أي منطقة ومسار وراثي ذي أهمية ^8,9.

تشمل العناصر الحاسمة لنجاح هذا البروتوكول عدم السماح أبدا للخرز المنقوع بالجفاف (أي أنه يجب أن يظل رطبا دائما). أيضا ، يعد اختيار الخرز المناسب أمرا ضروريا: Affi-Gel وخرز الهيبارين مخصصان للبروتينات ، في حين أن AG1-X2 مخصصان للمواد الكيميائية الذائبة في المذيبات العضوية. نقطة حرجة أخرى هي تركيز الجزيء الموجود في المحلول المستخدم لنقع الخرز ، والذي عادة ما يكون أكثر تركيزا بمقدار 1000 مرة مما يمكن استخدامه في الدراسات المخبرية . ومع ذلك ، فإن إزعاج هذه الطريقة هو أن التركيز النهائي للجزيئات المنبعثة من الخرز المنقوع غير معروف ، وكذلك سرعة الإطلاق. في البروتوكول يذكر أن قطر الخرز 100 ميكرومتر أكثر ملاءمة للاستخدام. ضع في اعتبارك هذا عندما يتم التلاعب بالأطراف. الأهم من ذلك ، يجب اختيار قطر الخرز وفقا لمنطقة الزرع والحفاظ عليه باستمرار في كل جنين. ومع ذلك ، من غير المحتمل أن يؤثر الاختلاف الطفيف في حجم الخرزة بين التجارب على النتائج.

في الختام ، تعتمد إمكانات فحص الخرز المنقوع الموضح هنا فقط على خيال الباحث. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على أي تجريبي أو مزرعة خلايا أو نموذج ثقافة عضوي ، بما في ذلك المواد العضوية. علاوة على ذلك ، يعد هذا البروتوكول أداة تعليمية مفيدة ومباشرة لتعليم الطلاب مفاهيم البيولوجيا التنموية الأساسية والمهارات التقنية من خلال ممارسة هذا التلاعب التجريبي في فصول البيولوجيا التنموية.

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

وقد دعم هذا العمل المديرية العامة للأكاديمية الشخصية (DGAPA) - الجامعة الوطنية المستقلة في المكسيك [أرقام المنح IN211117 و IN213314] والمجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا (CONACyT) [رقم المنحة 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia] الممنوحة ل JC-M. حصل JC M-L على زمالة ما بعد الدكتوراه من المجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887). يقدر المؤلفون مساعدة Lic. لوسيا بريتو من معهد التحقيقات الطبية الحيوية، UNAM في إعداد مراجع هذه المخطوطة.