Method Article
* These authors contributed equally
وطبق تحليل الشبكة لتقييم ارتباط مختلف المجتمعات الميكروبية الإيكولوجية، مثل التربة والمياه ورهيزوسفير. يقدم هنا بروتوكول حول كيفية استخدام خوارزمية WGCNA لتحليل شبكات التواجد المشترك المختلفة التي قد تحدث في المجتمعات الميكروبية بسبب بيئات بيئية مختلفة.
يلعب ميكروبيوم الجذر دورا هاما في نمو النبات والتكيف البيئي. تحليل الشبكة هو أداة هامة لدراسة المجتمعات المحلية، والتي يمكن أن تستكشف بشكل فعال العلاقة التفاعل أو نموذج الحدوث المشترك للأنواع الميكروبية المختلفة في بيئات مختلفة. الغرض من هذه المخطوطة هو تقديم تفاصيل حول كيفية استخدام خوارزمية شبكة الارتباط المرجحة لتحليل شبكات التواجد المشترك المختلفة التي قد تحدث في المجتمعات الميكروبية بسبب بيئات بيئية مختلفة. يتم إجراء جميع التحليلات الخاصة بالتجربة في حزمة WGCNA. WGCNA هو حزمة R لتحليل شبكة الارتباط المرجح. وكانت البيانات التجريبية المستخدمة لإثبات هذه الأساليب هي بيانات مجتمعية ميكروبية من قاعدة بيانات المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الأحيائية لثلاثة منافذ لنظام جذور الأرز (أوريزا ساتيفا). استخدمنا خوارزمية شبكة الارتباط المرجحة لبناء شبكات وفرة مشتركة من المجتمع الميكروبي في كل من المنافذ الثلاثة. ثم تم تحديد شبكات الوفرة المشتركة التفاضلية بين التربة المحيطية والرهيزوبلان ورهيزوسفير. وبالإضافة إلى ذلك، تم الحصول على الأجناس الأساسية في الشبكة من خلال حزمة "WGCNA"، التي تلعب دورا هاما منظما في وظائف الشبكة. تمكن هذه الأساليب الباحثين من تحليل استجابة الشبكة الميكروبية للاضطرابات البيئية والتحقق من نظريات الاستجابة الإيكولوجية الميكروبية المختلفة. وتبين نتائج هذه الأساليب أن الشبكات الميكروبية التفاضلية الهامة التي تم تحديدها في التربة الاندوسفيرية ورهيزوبلان ورهيزوسفير للأرز.
أبحاث الميكروبيوم لها آثار هامة على فهم والتلاعب في عمليات النظام الإيكولوجي1،2. وترابط التجمعات الميكروبية من خلال التفاعل بين الشبكات الإيكولوجية، التي يمكن أن تؤثر خصائصها على استجابة الكائنات الحية الدقيقة للتغيرات البيئية3و4. وعلاوة على ذلك، تؤثر خصائص هذه الشبكات على استقرار المجتمعات الميكروبية، وترتبط ارتباطا وثيقا بوظيفة التربة5. وقد تم الآن تحليل شبكة الارتباط الجيني المرجح على نطاق واسع للبحث في العلاقة بين الجينات والمجتمعات الميكروبية6. وقد ركزت الدراسات السابقة أساسا على الارتباطات بين شبكات الجينات المختلفة أو السكان والعالم الخارجي7. ومع ذلك، لم يتم التحقيق في الاختلافات في شبكات الارتباط التي شكلتها المجموعات الميكروبية في ظل ظروف بيئية مختلفة. الغرض من البحث المقدم في هذه الورقة هو تقديم رؤى وتفاصيل حول التنفيذ السريع لوغاريتم WGCNA لبناء شبكة مشتركة من عينات الميكروبيوم التي تم جمعها في ظل ظروف بيئية مختلفة. وبناء على نتائج التحليل، قمنا بتقييم تكوين السكان واختلافاتهم وناقشنا العلاقة بين المجموعات الميكروبية المختلفة. تم تطبيق التدفق الأساسي التالي من خوارزمية شبكة الارتباطالمرجحة 8. أولا، يجب إنشاء مصفوفة تشابه عن طريق حساب معامل ارتباط Pearson بين ملفات تعريف التعبير وحدات التصنيف التشغيلية (OTU). ثم، تم اعتماد معلمات وظائف التجاور (السلطة أو وظائف التجاور sigmoid) مع معيار طوبولوجيا خالية من النطاق، تم تحويل مصفوفة التشابه إلى مصفوفة التجاور، وكل شبكة مشتركة بين حدوث تتوافق مع مصفوفة التجاور. استخدمنا متوسط التجميع الهرمي للربط إلى جانب الاختلاف القائم على TOM لتجميع OTUs مع ملامح تعبير متماسكة في وحدات. علاوة على ذلك، قمنا بحساب العلاقة بين الإحصاءات المحافظة ووحدات تحليل المعلمات ذات الصلة، وأخيرا تحديد وحدة الإرسال الكبرى المحورية في الوحدة النمطية. وهذه الأساليب مناسبة بشكل خاص لتحليل الاختلافات في هياكل الشبكات بين مختلف المجموعات الميكروبية في ظل ظروف بيئية متباينة. في هذه المخطوطة، قمنا بوصف طريقة تطوير شبكة التعبير المشترك بالتفصيل، وتحليل الانحرافات بين الوحدات، وقدمنا لمحة عامة موجزة عن الخطوات في الإجراء المطبق للحصول على الأنواع الأساسية في شبكات الوحدات المختلفة.
1. تنزيل البيانات
2. تحديد قيمة الطاقة الأمثل
ملاحظة: تحتوي حزمة WGCNA على كافة المعلمات الوظيفية التالية. WGCNA هو حزمة R لتحليل شبكة الارتباط المرجح. تشير خطوط الأوامر الرئيسية إلى الملحق S1.
3. بناء شبكة التعبير المشترك وتحديد وحدة
ملاحظة: استنادا إلى قيمة الطاقة المحسوبة أعلاه، يتم إنشاء شبكة التواجد المشترك. تشير خطوط الأوامر الرئيسية إلى الملحق S2.
4. مقارنة الوحدة
ملاحظة: يمكن استخدام هذه الطريقة لمقارنة وحدات الشبكة لمجتمعين ميكروبيين إيكولوجيين. في هذه المقالة، قارن الاختلافات بين وحدات الشبكة الميكروبية بين الغلاف المحيطين ورهيزوبلان، والغلاف المحيطي ورهيزوسفير، ورهيزوبلان.
5. تحليل وحدة الشبكة التفاضلية الميكروبية
تم تحميل النتائج التمثيلية في هذه المقالة من 2014 كاليفورنيا Abaker الأرز الجذر الميكروبيوم البيانات في قاعدة بيانات NCBI (PRJNA386367)9. وتشمل البيانات عينات الميكروبيوم من نباتات الأرز التي تزرع لمدة 14 أسبوعا في حقل أرز مغمور بالمياه. استخدمنا خوارزمية WGCNA لتحديد قيمة الطاقة التي تلبي الشبكات الثلاث التي كانت قريبة من الشبكة الخالية من النطاق(الشكل 1)وطورنا ثلاث شبكات تعبير مشترك(الشكل 2). وفي المحيطي، تم تحديد شبكة التعبير المشترك الميكروبية للتربة، وهي رهيزوبلان، ورهيزوسفير، 23 و22 و21 وحدة على التوالي. وتشير هذه النتائج إلى أن أعداد شبكات التفاعل الميكروبية في المنافذ الثلاثة كانت متساوية أساسا.
كما قارنا الاختلافات في وحدات الشبكة الميكروبية داخل التربة الاندوسفيرية والرهيزوبلان والرهيزوسفير. تم الحصول على نتائج اختبار الحفظ التالية لوحدات مجموعات المنافذ الثلاث. وتوجد ثلاث وحدات غير محفوظة للغاية بين تربة الرهيزوسفير ورهيزوبلان(الشكل 3أ، الجدول 1). بالإضافة إلى ذلك، كانت هناك تسع وحدات غير محفوظة للغاية بين تربة رهيزوسفير والغلاف المحيطي(الشكل 3ب، الجدول 2)وست وحدات غير محفوظة للغاية بين الرهيزوبلان والغلاف المحيطي(الشكل 3c، الجدول 3). وعلاوة على ذلك، تم العثور على وحدات غير محفوظة للغاية بين المنافذ الثلاثة، مما يشير إلى وجود اختلافات كبيرة في تكوين الكائنات الحية الدقيقة بين المنافذ الثلاثة. ويتضح في الشكل 4نتائج تحليل ارتباط عضوية الوحدة النمطية للوحدات غير المحافظة التي تم الحصول عليها. من هذا الرقم ، وحدة مختلفة إلى حد كبير مع أقل ارتباط بين كل مكانين واضح بين المنافذ الثلاثة ، والتي تمثل الفرق الأكثر أهمية بينهما.
في شبكة الفرق بين رهيزوسفير ورهيزوبلان(الشكل 5أ)،كان الفيلوم المهيمن هو Proteobacteria (72.97٪). في شبكة الفرق بين الرهيزوسفير والغلاف المحيطي(الشكل 5ب)،كانت الفيلا المهيمنة هي بروتيوباكتيريا (66.36٪)، أكتينوبكتيريا (10.1٪)، والبكتيريا (10.9٪). في شبكة الفرق بين الرهيزوبلان والغلاف الداخلي(الشكل 5c)،كانت الفيلا المهيمنة هي Proteobacteria (41.41٪)، والبكتيريا (10.10٪)، Firmicutes (12.12٪)، وفيروكوميكروبيا.
ثلاثة أجناس أساسية (الشكل 5a)، بما في ذلك رودوباكتر ونوفوسفينغونيوم، ستة أجناس أساسية (الشكل 5ب) ، بما في ذلك Blvii28 وDechloromonas، وخمسة أجناس أساسية (الشكل 5c) ، بما في ذلك Cellvibrio و Geobacter، مارست وظائف تنظيمية هامة في شبكات الحدوث المشترك التفاضلية الثلاث. وكان لجميع الأجناس الأساسية، باستثناء ديكلوروموناس،تأثير على شبكة واحدة فقط، مما يشير إلى توافر اختلافات كبيرة في الوفرة النسبية للتجمعات والأنواع الميكروبية بين المنافذ الثلاثة لجذور الأرز، مما أثر بشكل خطير على وفرة وتنوع المجتمعات الميكروبية الجذرية القائمة.
جنس الأساسية Azospirillum, موجودة في شبكة الفرق بين رهيزوسفير والغلاف المحيط من الأرز, شارك في تثبيت النيتروجين وتعزيز نمو النبات10. بالإضافة إلى ذلك، قد يكون جنس Geobacter، الذي تم إثراءه بشكل كبير في شبكة فرق الهيزوبلان-إندوسفير، العامل الرئيسي الذي يحفز على الحد من أكاسيد Fe و Mn غير القابلة للذوبان في العديد من التربة والرواسب11. وتتفاعل هذه الكائنات الدقيقة مع مجموعة من المجتمعات الميكروبية في منافذ الجذر وتشارك بنشاط في تنظيم الشبكات الميكروبية، وهو ما قد يكون بالغ الأهمية لنمو جذور الأرز وتطويرها.
الشكل 1. تقييم الطاقة في مجموعات البيانات. (أ) تقييم β القدرة في مجموعة بيانات ES؛ (ب) تقييم β القدرة في مجموعة بيانات جمهورية ر.م. (ج) تقييم β الطاقة في مجموعة بيانات RP، وتوزيع المؤشر R2 الخالي من المقاييس (يسار)، وتوزيع متوسط الاتصال (يمين) على طول مؤشرات القوة الناعمة المختلفة. تم تحقيق قيمة أفضل قوة عندما اتجه R2 إلى التشبع ولم يكن أقل من 0.8. وكان لا بد من تعيين شبكات التعبير المشترك الثلاث إلى نفس قيمة الطاقة لضمان قابليتها للمقارنة. (RS: تربة الرهيزوسفير، RP: رهيزوبلان، وES: الغلاف المحيطي). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. dendrogram وحدة الوحدة التي تم الحصول عليها عن طريق التجمع الهرمي الربط المتوسط. (أ)وحدة مكافحة الإرهاب dendrogram من شبكة ES؛ (ب) وحدة مكافحة الإرهاب من شبكة RS؛ (ج) وحدة مكافحة الإرهاب من شبكة RP. يشير صف الألوان أسفل مخطط الألوان إلى تعيين الوحدة النمطية الذي تحدده خوارزمية قطع الشجرة الديناميكية. (RS: تربة الرهيزوسفير، RP: رهيزوبلان، وES: الغلاف المحيطي) يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. نتائج اختبار الحفظ. (أ) تستند نتائج التحليل إلى تخصيص وحدة شبكة التعبير المشترك RS كمجموعة مرجعية ونتائج تخصيص وحدة شبكة التعبير المشترك RP كمجموعة اختبار؛ (ب) تستند نتائج التحليل إلى تخصيص وحدة شبكة التعبير المشترك ES كمجموعة مرجعية ونتائج تخصيص وحدة شبكة التعبير المشترك RS كمجموعة اختبار؛ (ج) تستند نتائج التحليل إلى تخصيص وحدة شبكة التعبير المشترك ES كمجموعة مرجعية ونتائج تخصيص وحدة شبكة التعبير المشترك RP كمجموعة اختبار. Z_summary > 10 يشير إلى أن وحدتين يتم الحفاظ عليها بشكل كبير، في حين أن Z_summary < 2 يشير إلى وحدات غير محفوظة. medianRank يعبر عن الحفاظ النسبي للوحدة تقييمها حسب الترتيب. تشير القيم المتوسطة الأعلى إلى الوحدات النمطية غير المحفوظة. (RS: تربة الرهيزوسفير، RP: رهيزوبلان، وES: الغلاف المحيطي) يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. تحليل الارتباط لعضوية الوحدة النمطية. (أ) ارتباط الوحدة النمطية لقيمة kME بين شبكة RS وRP؛ (ب) ارتباط الوحدة النمطية لقيمة kME بين RS وRP؛ (ج) ارتباط الوحدة لقيمة ال kME بين شبكة RP وES (RS: تربة الرهيزوسفير، RP: رهيزوبلان، ES: الغلاف المحيطي، وKME: عضوية الوحدة). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5. شبكة مشتركة من الميكروبات التفاضلية في جذر الأرز. (أ)شبكة مشتركة من مجموعات الميكروبات التفاضلية في RS-RP؛ (ب) المشاركة في حدوث شبكة من التجمعات الميكروبية التفاضلية في ES-RS؛ (ج) شبكة مشتركة من التجمعات الميكروبية التفاضلية في ES-RP. تم إجراء التحليل باستخدام برنامج Cytoscape. تمثل ألوان مختلفة بوابات مختلفة في الشكل. (RS: تربة رهيزوسفير، RP: رهيزوبلان، وES: الغلاف المحيطي). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الوحده النمطيه | متوسط ترتيب | زوماري | الوحده النمطيه | متوسط ترتيب | زوماري |
غرينيلو | 2 | 14 | أصفر | 13 | 5.2 |
وردي | 2 | 17 | رمادي60 | 14 | 3.1 |
منتصف الليل الأزرق | 3 | 10 | رويال بلو | 15 | 2.1 |
أسمر | 4 | 18 | أسود | 16 | 2.7 |
لايتسيان | 6 | 8.5 | تان | 17 | 3.2 |
بنفسجي | 7 | 10 | سلمون | 18 | 1.3 |
أزرق | 7 | 22 | الارجواني | 18 | 2.2 |
أخضر | 8 | 12 | مظلمة | 20 | -0.24 |
سيان | 10 | 4.8 | ذهب | 20 | 14 |
لايتغرين | 11 | 5.1 | داركغرين | 22 | -1.1 |
لايتيلو | 12 | 5.3 | رمادي | 22 | 0.21 |
أحمر | 12 | 6.1 |
الجدول 1 - الجداول نتيجة Zsummary و المتوسطمتوسط بين التربة رهيزوسفير ورهيزوبلان.
الوحده النمطيه | متوسط ترتيب | زوماري | الوحده النمطيه | متوسط ترتيب | زوماري |
سلمون | 1 | 19 | لايتسيان | 13 | 1.1 |
أسود | 3 | 5.3 | أحمر | 15 | 0.95 |
أصفر | 4 | 5.8 | منتصف الليل الأزرق | 15 | -0.0016 |
لايتغرين | 5 | 0.27 | رويال بلو | 16 | 0.83 |
غرينيلو | 7 | 3 | الارجواني | 16 | 0.52 |
الظلام | 7 | 1.2 | داركغرين | 17 | 0.16 |
رمادي60 | 9 | 1.1 | تان | 18 | 0.64 |
أزرق | 10 | 3.9 | لايتيلو | 19 | 0.52 |
بنفسجي | 10 | 2.3 | مظلمة | 19 | -0.18 |
أسمر | 12 | 2.3 | وردي | 19 | -0.71 |
سيان | 12 | 0.78 | ذهب | 21 | 11 |
أخضر | 13 | 1.7 |
الجدول 2 - الأرباح نتيجة Zsummary و المتوسطابين بين التربة والغلاف المحيطي rhizosphere.
الوحده النمطيه | متوسط ترتيب | زوماري | الوحده النمطيه | متوسط ترتيب | زوماري |
أسود | 1 | 15 | الظلام | 13 | 1.7 |
سلمون | 2 | 27 | منتصف الليل الأزرق | 13 | 1.6 |
أصفر | 3 | 13 | لايتغرين | 13 | 0.64 |
سيان | 4 | 5.4 | داركغرين | 14 | 1.5 |
أزرق | 8 | 3.9 | مظلمة | 16 | 1.5 |
لايتسيان | 9 | 2.6 | بنفسجي | 17 | 2.3 |
وردي | 10 | 3.6 | غرينيلو | 18 | 0.8 |
رويال بلو | 10 | 1.5 | لايتيلو | 18 | 0.42 |
أسمر | 12 | 2.9 | الارجواني | 19 | 0.2 |
أخضر | 12 | 1.9 | ذهب | 21 | 18 |
أحمر | 12 | 1.9 | رمادي60 | 21 | -0.21 |
تان | 13 | 2.5 |
الجدول 3 - الأرباح نتيجة Zsummary و المتوسطمتوسط بين رهيزوبلان والغلاف المحيطي.
الملحق S1: الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الملحق S2: الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الملحق S3: الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الملحق S4: الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
وقد استخدمت شبكات الارتباط بشكل متزايد في تطبيقات المعلوماتية الحيوية. WGCNA هو أسلوب بيولوجيا النظم للتحليل الوصفي للعلاقات بين العناصر المختلفة للنظام البيولوجي12. تم استخدام حزمة برامج R في العمل في وقت سابق على WGCNA13،14،15. وتشمل الحزمة وظائف لبناء الشبكة ، والكشف عن وحدة ، وحسابات الخصائص الطوبولوجية ، ومحاكاة البيانات ، والتصور ، والقدرة على التفاعل مع البرامج الخارجية. وقد تم استخدام WGCNA على نطاق واسع لتحليل بيانات التعبير الجيني من سرطان الدماغ16، دورة خلايا الخميرة17، علم الوراثة الماوس18،19، أنسجة الدماغ الرئيسيات20،21، مرض السكري22، والنباتات23. يجب أن يتضمن استخدام تحليل شبكة الارتباط الجيني المرجح لإنشاء الشبكة عينة 8 على الأقل. ركزنا في هذه المقالة على شبكات التعبير المشترك الجيني التي تصف التفاعلات بين المجموعات الميكروبية في بيئات مختلفة. حصلنا على شبكات تفاضلية بين المجموعات الميكروبية في بيئات متباينة وحددنا الأنواع الرئيسية في كل شبكة. وقد استخدمت على نطاق واسع فكرة أن الأنواع الرئيسية مهمة للمجتمع في بحوث شبكة الغذاء24. بعض الأنواع في مجتمع ميكروبي معقد يمكن أن تكون ضرورية للحفاظ على استقرار ووظائف المجتمع، مثل البكتيريا في النباتات المعوية25. ويمكن تبسيط تحليل المجتمعات الميكروبية إلى حد كبير من خلال استهداف أنواع محددة ذات أهمية محتملة.
تسلط النتائج التمثيلية لدينا الضوء على الاختلافات في المجتمعات الميكروبية ، والتي يمكن تحديدها باستخدام الطريقة المذكورة أعلاه. هنا، تعرضت الكائنات الحية الدقيقة في منافذ مختلفة من نظام جذور الأرز إلى WGCNA. وتم تحديد الفرق بين المنافذ الثلاثة باستخدام تحليلات المحافظة وعضوية الوحدة النمطية. حددنا الأنواع الرئيسية في وحدات الفرق وحصلنا على معلومات عن الاختلافات في تكوين المجتمعات الميكروبية في المنافذ الثلاثة. وفي الوقت نفسه، كشفت شبكة الحدوث المشترك عن وجود تفاعل كبير بين الكائنات الحية الدقيقة المتغيرة في جذور الأرز. تقدم النتائج التي توصلنا إليها أدلة مباشرة على أهمية وجدوى WGCNA في تقييم الاختلافات المجتمعية الميكروبية في بيئات مختلفة.
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
تم دعم تطوير هذه المخطوطة بأموال من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية التابعة لمشروع مركز أبحاث العلوم في حكومة إقليم الصين-قويتشو (U1812401)، ومشروع أبحاث الدكتوراه في جامعة قويتشو العادية (GZNUD[20). 17]1)، مشروع دعم العلوم والتكنولوجيا في مقاطعة قويتشو (QKHZC[2021]YB459) ومشروع العلوم والتكنولوجيا في قوييانغ([2019]2-8).
ويود المؤلفون أن يشكروا إدواردز ج. أ. وآخرين على توفير بيانات ميكروبيوم الأرز في قواعد البيانات العامة والدعم المقدم من TopEdit (www.topeditsci.com) على مساعدته اللغوية أثناء إعداد هذه المخطوطة.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
R | The University of Auckland | version 4.0.2 | R is a free software environment for statistical computing and graphics. It compiles and runs on a wide variety of UNIX platforms, Windows and MacOS. |
RStdio | JJ Allaire | version 1.4.1103 | The RStudio IDE is a set of integrated tools designed to help you be more productive with R and Python. |
Cytoscape | version 3.7.1 | Cytoscape is an open source software platform for visualizing complex networks and integrating these with any type of attribute data. | |
NCBI database | The National Center for Biotechnology Information advances science and health by providing access to biomedical and genomic information. |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved