Method Article
يوفر توليد فيروسات الروتا المؤتلفة من الحمض النووي البلازمي أداة أساسية لدراسة تكرار فيروس الروتا ومسببات الأمراض ، وتطوير ناقلات التعبير عن فيروس الروتا واللقاحات. هنا، نحن نصف نهج علم الوراثة العكسي المبسط لتوليد فيروسات الروتا المؤتلفة، بما في ذلك سلالات تعبر عن بروتينات مراسل الفلورسنت.
فيروسات الروتا هي مجموعة كبيرة ومتطورة من فيروسات الحمض النووي الريبي المجزأة المزدوجة التي تسبب التهاب المعدة والأمعاء الحاد في صغار العديد من الأنواع المضيفة للثدييات والطيور، بما في ذلك البشر. ومع ظهور أنظمة الوراثة العكسية لفيروس الروتا مؤخراً، أصبح من الممكن استخدام الطفرات الموجهة لاستكشاف بيولوجيا فيروس الروتا، وتعديل لقاحات فيروس الروتا الموجودة وتحسينها، وتطوير ناقلات اللقاحات متعددة الأهداف لفيروس الروتا. في هذا التقرير، نحن نصف نظام علم الوراثة العكسي المبسط الذي يسمح بالتعافي الفعال والموثوق به من فيروسات الروتا المؤتلفة. ويستند النظام على التطفل المشترك من ناقلات النسخ T7 التعبير عن كامل طول rotavirus (+) RNAs وناقل CMV ترميز إنزيم غطاء الحمض النووي الريبي في خلايا BHK إنتاج اسيشن ايمرياز T7 الحمض النووي الريبي (BHK-T7). يتم تضخيم فيروسات الروتا المؤتلفة من خلال الإشراف على خلايا BHK-T7 المصابة عبرها مع خلايا MA104 ، وهو خط خلية الكلى القرد الذي هو متساهل للغاية لنمو الفيروس. في هذا التقرير، نحن أيضا ً نصف نهج لتوليد فيروسات الروتا المؤتلفة التي تعبر عن بروتين مراسل فلوري منفصل من خلال إدخال عنصر إيقاف إعادة التشغيل الترجمي 2A في الجزء 7 من الجينوم (NSP3). هذا النهج يتجنب حذف أو تعديل أي من إطارات القراءة المفتوحة الفيروسية، مما يسمح لإنتاج فيروسات الروتا المؤتلفة التي تحتفظ بالبروتينات الفيروسية تعمل بكامل طاقتها مع التعبير عن بروتين الفلورسنت.
فيروسات الروتا هي الأسباب الرئيسية لالتهاب المعدة والأمعاء الحاد في الرضع والأطفال الصغار ، وكذلك الشباب من العديد من الثدييات الأخرى والطيورالأنواع 1. كأعضاء في عائلة Reoviridae، الفيروسات الدوارة لديها تجزئة الحمض النووي الريبي المزدوج تقطعت بهم السبل (dsRNA) الجينوم. وترد شرائح الجينوم داخل فيرجيون icosahedral غير مغلفة تشكلت من ثلاث طبقات متحدة المركز من البروتين2. واستناداً إلى التسلسل والتحليل الجيني لأجزاء الجينوم، تم تحديد تسعة أنواع من فيروس الروتا (A-D, F−J)3. تلك السلالات التي تتألف من أنواع فيروس الروتا A هي المسؤولة عن الغالبية العظمى من الأمراض البشرية4. ويرتبط إدخال لقاحات فيروس الروتا في برامج تحصين الأطفال ابتداء من العقد الماضي بتخفيضات كبيرة في وفيات واعتلال فيروس الروتا. وعلى وجه الخصوص، انخفض عدد وفيات الأطفال المرتبطة بفيروس الروتا من حوالي 528,000 في عام 2000 إلى 128,500 في عام 20164,5. يتم صياغة لقاحات فيروس الروتا من سلالات حية مخففة من الفيروس، مع إعطاء 2 إلى 3 جرعات للأطفال بحلول 6 أشهر من العمر. قد يؤدي العدد الكبير من سلالات فيروس الروتا المتنوعة وراثيًا المتداولة في البشر وأنواع الثدييات الأخرى ، إلى جانب قدرتها على التطور السريع من خلال الطفرات وإعادة الفرز ، إلى تغييرات مضادة للجينات في أنواع فيروسات الروتا التي تصيب الأطفال6و7و8. وقد تقوض هذه التغييرات فعالية اللقاحات الموجودة، مما يتطلب استبدالها أو تعديلها.
ولم يتحقق سوى مؤخرا ً 9 تطوير نظم علم الوراثة العكسية القائمة على البلازميد9بالكامل التي تمكن من التلاعب بأي من شرائح جينوم فيروس الروتا 11. ومع توافر هذه النظم، أصبح من الممكن كشف التفاصيل الجزيئية لتكرار فيروس الروتا ومسبباته، وتطوير أساليب فحص عالية الإنتاجية محسنة لمركبات مكافحة فيروس الروتا، وإنشاء فئات جديدة يمكن أن تكون أكثر فعالية من لقاحات فيروس الروتا. أثناء تكرار فيروس الروتا، توج الفيروسية (+) RNAs ليس فقط دليل توليف البروتينات الفيروسية، ولكن أيضا بمثابة قوالب لتركيب شرائح الجينوم dsRNA ذرية10،11. تعتمد جميع أنظمة الوراثة العكسية للفيروس الروتا الموصوفة حتى الآن على نقل ناقلات النسخ T7 إلى خطوط خلايا الثدييات كمصدر لـ cDNA المشتقة (+) RNAs المستخدمة في استعادة الفيروسات المؤتلفة9،12،13. داخل ناقلات النسخ ، يتم وضع الأقراص الفيروسية الكاملة الطول بين مروج T7 المنبع وفيروس دلتا التهاب الكبد المصب (HDV) ribozyme بحيث يتم تصنيعها من قبل البوليميراز T7 RNA التي تحتوي على أصلية 5 ' و 3'-termini(الشكل 1A). في الجيل الأول من نظام علم الوراثة العكسي ، تم إجراء الفيروسات المؤتلفة عن طريق نقل خلايا الكلى الطفل الهامستر التعبير عن T7 RNA polymerase (BHK-T7) مع 11 T7 (pT7) ناقلات النسخ ، كل توليف توجيه فريدة من نوعها (+) الجيش الملكي النيبالي من سلالة الفيروس SA11 simian، وثلاثة CMV المروج محرك التعبير plasmids، واحد ترميز بروتين انصهار reovirus الطيور p10FAST ووحدتين فرعيتين ترميز من فيروس vaccinia D1R-D12L توج إنزيم معقدة9. تم تضخيم الفيروسات SA11 المؤتلفة المتولدة في خلايا BHK-T7 المصابة المنقولة من خلال الإشراف على خلايا MA104 ، وهو خط خلية متساهل لنمو فيروس الروتا. وقد وصفت نسخة معدلة من الجيل الأول من نظام علم الوراثة العكسية التي لم تعد تستخدم دعم plasmids12. بدلا من ذلك، يولد النظام المعدل بنجاح فيروسات روتا المؤتلفة ببساطة عن طريق نقل خلايا BHK-T7 مع ناقلات النسخ SA11 T7 11، مع التحذير من أن ناقلات للمصنع الفيروسي (viroplasm) كتل البناء (البروتينات غير الهيكلية NSP2 و NSP5) تضاف عند مستويات 3 أضعاف أعلى من ناقلات أخرى14،15. كما تم تطوير نسخ معدلة من نظام علم الوراثة العكسي التي تدعم الانتعاش من سلالات KU وOdelia البشرية من فيروس الروتا16,17. الجينوم الفيروس الروتا قابلة بشكل ملحوظ للتلاعب عن طريق علم الوراثة العكسي، مع الفيروسات المؤتلفة ولدت حتى الآن مع الطفرات التي أدخلت في VP418،NSP19،NSP219،NSP320،,21،وNSP522،,23. من بين الفيروسات الأكثر فائدة التي تم إنشاؤها حتى الآن هي تلك التي تم هندستها للتعبير عن البروتينات مراسل الفلورسنت (FPs)9،12،21،24،25.
في هذا المنشور، ونحن نقدم بروتوكول لنظام علم الوراثة العكسي التي نستخدمها في مختبرنا لتوليد سلالات المؤتلفة من فيروس الروتا SA11. السمة الرئيسية لبروتوكولنا هي التطفل المشترك لخلايا BHK-T7 مع ناقلات النسخ pT7 11 (المعدلة لتشمل مستويات 3x من pT7/NSP2SA11 و pT7/NSP5SA11 vectors) وناقل تعبير CMV ترميز فيروس حمى الخنازير الأفريقية (ASFV) NP868R توج الإنزيم21 (الشكل 2). في أيدينا، وجود البلازميد NP868R يؤدي إلى إنتاج أعلى titers من الفيروسات المؤتلفة من قبل خلايا BHK-T7 المصابة. في هذا المنشور، ونحن نقدم أيضا بروتوكول لتعديل pT7/NSP3SA11 plasmid بحيث يمكن إنشاء الفيروسات المؤتلفة التي تعبر ليس فقط عن الجزء 7 البروتين المنتج NSP3 ولكن أيضا FP منفصلة. ويتم تحقيق ذلك عن طريق إعادة هندسة إطار القراءة المفتوحة NSP3 (ORF) في pT7/NSP3SA11 plasmid لاحتواء عنصر إيقاف إعادة التشغيل التحويلي 2A المصب متبوعاً بـ FP ORF(الشكل 1B)24،26. من خلال هذا النهج، قمنا بتوليد فيروسات روتا المؤتلفة التي تعبر عن مختلف FPs: UnaG (الأخضر)، mKate (أحمر بعيد)، mRuby (الأحمر)، TagBFP (الأزرق)، CFP (سماوي)، وYFP (أصفر)24،27،28. يتم إجراء هذه الفيروسات الروتا التعبير ية FP دون حذف ORF NSP3 ، وبالتالي تسفر عن الفيروسات التي من المتوقع أن ترميز مجموعة كاملة من البروتينات الفيروسية العاملة.
1. إعداد وسائل الإعلام وصيانة ثقافة الخلايا
2- إعداد بلازميد
3- توليد فيروس مؤتلف
ملاحظة: يجب التعامل مع أبحاث فيروس الروتا البشري والحيواني، بما في ذلك توليد وتوصيف سلالات فيروس الروتا المؤتلف، في ظل ظروف المستوى 2 للسلامة البيولوجية (BSL-2) وستتطلب موافقة مسبقة من اللجنة المؤسسية للسلامة البيولوجية (IBC). يتم وصف الظروف المختبرية المناسبة BSL-2 في السلامة البيولوجية في المختبرات الميكروبيولوجية والطبية الحيوية (BMBL) التي تنتجها مراكز مكافحة الأمراض والوقاية منها (CDC)30.
4. عزل البلاك من الفيروسات المؤتلفة
5. جل electrophoresis من dsRNA الفيروسية
6. استعادة وتسلسل dsRNA الفيروسية
7. تحليل البلوت المناعي للبروتينات الفيروسية
8. تصوير الخلايا الحية للخلايا المصابة بالفيروسات المعبرة عن FP
بروتوكول علم الوراثة العكسي الموصوف في هذه المقالة ينتقل من خلال خطوات متميزة متعددة: (1) التطفل المشترك لخلايا BHK-T7 مع ناقلات النسخ pT7 فيروس روتا وpCMV/NP868R التعبير plasmid، (2) الإشراف على الخلايا BHK-T7 المصابة بخلايا MA104 ، (3) تضخيم الفيروسات المؤتلفة الموجودة في خلايا BHK-T7/MA104 التي تسيل باستخدام خلايا MA104 ، و (4) عزل البلاك للفيروس المؤتلف باستخدام خلايا MA104(الشكل 2). في أيدينا، البروتوكول هو كفاءة، مما أسفر عن titers من الفيروس SA11 المؤتلف ة البرية (rSA11/wt) في BHK-T7/MA104 خلية lysates من ~ 104 PFU/mL وفي تضخيم MA104 خلية lysates من > 1 × 107 PFU/ مل. SA11 الفيروسات المؤتلفة التي تولدها الوراثة العكسية باستخدام pT7/NSP3SA11plasmids المعدلة التي تعبر عن FPs (على سبيل المثال، rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG) تنمو إلى titers التي هي ~ 4 أضعاف أقل من rSA11/wt.
بعد بروتوكول علم الوراثة العكسي ، قمنا بإنشاء فيروسات SA11 المؤتلفة التي تم التعرف عليها بسهولة من خلال مسح البلاك على خلايا MA104 ، مما يسمح بعزل البلاك(الشكل 3D). تم اختيار الفيروسات في اللويحات مع أنبوب نقل قابل للتصرف طويل المدى وتضخيمه على خلايا MA104. تم استخراج جينوم dsRNA من rSA11/wt وrSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG فيروسات مع guanidinium thiocyanate ، وحلها عن طريق electrophoresis على هلام البولي اكريلاميد 10 ٪ ، والكشف عنها عن طريق تلطيخ مع بروميد الإيثهيديوم(الشكل 3A). كما هو متوقع ، الجزء 7 (NSP3) dsRNA من rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG هاجر أبطأ بكثير من rSA11/wt(الشكل 3A)بسبب وجود تسلسلات 2A-3xFL-UnaG. الجزء 7 (NSP3) dsRNA من rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG كان هلام تنقية، وتحويلها إلى شكل cDNA بواسطة RT-PCR، وتسلسل لتأكيد الدقة.
للتحقق من التعبير عن بروتين الفلورسنت UnaG، أصيبت خلايا MA104 في لوحات 6-well مع 3 PFU لكل خلية من rSA11/wt و rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG. في 8 ساعة بعد الإصابة، تم استبدال الثقافة المتوسطة في لوحات مع 0.5 مل من DMEM مع الفلور اتّصل الخلفية منخفضة لكل بئر وألواح احتضنت لمدة 30 دقيقة إضافية في 37 درجة مئوية في حاضنة CO2. بعد ذلك، تم فحص اللوحات للتعبير عن UnaG باستخدام صور الخلايا الحية. وأظهر التحليل أن rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG أنتجت الفلورسال الأخضر، والتحقق من وظائف الجين UnaG في الفيروس المؤتلف(الشكل 3B). وعلى النقيض من ذلك، لم يتم الكشف عن الفلورسينس الأخضر في الخلايا المصابة بـ rSA11/wt. لمعالجة ما إذا كان عنصر 2A في الجزء المعدل 7 من rSA11/NSP3-2AxFL-UnaG يعزز التعبير عن بروتينين منفصلين (NSP3-2A و 3xFL-UnaG)، أصيبت خلايا MA104 بـ rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG وrSA11/wt. تم إعداد الخلايا من الخلايا التي تم حصادها في 8 h بعدان آخر، وحلها عن طريق الكهربية هلام، ولطخت على مرشحات النيتروسيلولوز. تم بحث البوات مع الأجسام المضادة محددة لVP6 روتا فيروس وNSP3، وعلامة FLAG. وأظهر التحليل أن NSP3-2A و 3xFL-UnaG تم التعبير عنها كبروتينات منفصلة في الخلايا المصابة بـ rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG ، مما يشير إلى أن عنصر 2A كان وظيفيًا(الشكل 3C). الخلايا المصابة rSA11/wt لم تعبر عن البروتين المعترف بها من قبل الأجسام المضادة للراية. البروتين NSP3 موجودة في rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG الخلايا المصابة بالأجسام المضادة المضادة NSP3 هاجر أبطأ قليلاً من NSP3 الموجودة في الخلايا المصابة rSA11/wt بسبب وجود بقايا بقايا 2A في C-terminus من NSP3.
الشكل 1: فيروس روتا عكسي علم الوراثة البلازميدات. (أ)يتم وضع cDNAs كامل الطول من 11 SA11 شرائح الجينوم الفيروس الروتافي داخل pT7 plasmids، وليغا المنبع مع المروج لبولميراز T7 RNA والمصب مع ريبوزييم HDV. في وجود T7 RNA polymerase, وrotavirus pT7 plasmids إنتاج كامل طول SA11 (+) RNAs مع أصيلة 5 ' و 3' termini. (ب)التخطيطات من (+) الحمض النووي الريبي ومنتجات البروتين التي أدلى بها pT7/NSP3-2A-3xFL-UnaG plasmid. التخطيطي يتضمن تسلسل CDNA NSP3، وتسلسل لschovirus porcine 2A مثل (2A) عنصر، 3x العلم (فلوريدا) العلامة، والبروتين الفلورسنت الأخضر UnaG. تتم الإشارة إلى موضع موقع إيقاف إعادة التشغيل المترجم 2A بسهم أحمر. بسبب نشاط عنصر 2A ، تنتج ترجمة الحمض النووي الريبي بروتينين. يحتوي الجزء NSP3 على بقايا عنصر 2A ويتم دمج جزء UnaG إلى علامة 3x FLAG. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: نظام الوراثة العكسي لفيروس الروتا. يتم نقل أجهزة أحادية BHK-T7 بـ 11 pT7 plasmids ، يعبر كل منها عن SA11 (+) RNA ، ومتجه pCMV يعبر عن فيروس حمى الخنازير الأفريقي (ASFV) NP868R وتوج إنزيم (pCMV/NP868R). في 3 أيام بعد العدوى (d.p.i.) ، يتم الإشراف على خلايا BHK-T7 مع خلايا MA104. في 7 أيام بعد العدوى، يتم تضخيم فيروسات الروتا المؤتلفة في الخلايا BHK-T7/MA104 عن طريق المرور على خلايا MA104، ثم معزولة عن طريق تنقية البلاك. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: خصائص السلالات المؤتلفة rSA11/wt وrSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG. (أ)لمحات Electrophoretic من شرائح الجينوم dsRNA من البلاك معزولة سلالات rSA11. يتم ترقيم شرائح الجينوم الإحدى عشرة ويشار إلى التحول في موضع الجزء 7 (NSP3) بخط أحمر. (ب)الفلورسينس المكتشفة في خلايا MA104 المصابة rSA11 في 8 ساعة بعد الإصابة باستخدام صور حية للخلايا (التكبير 20x) المنصوص عليها على قناة الكشف الخضراء. مقياس شريط = 100 ميكرون.(C)تحليل Immunoblot من البروتينات الموجودة في 8 ساعة بعد العدوى في خلايا MA104 المصابة سلالات rSA11 باستخدام غينيا خنزير المضادة VP6 والمضادة NSP3 antisera والفأر المضادة أحادية النسيلة. (D)اللويحات التي تنتجها rSA11/wt على خلايا MA104 في 3 أيام بعد العدوى والكشف عنها من قبل تلطيخ أحمر محايد. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
في مختبرنا، ونحن نعتمد بشكل روتيني على بروتوكول علم الوراثة العكسي الموصوف هنا لإنتاج فيروسات روتا SA11 المؤتلفة. مع هذا النهج ، والأفراد مع خبرة ضئيلة في تقنيات البيولوجيا الجزيئية أو العمل مع الفيروسات الروتا استرداد الفيروسات المؤتلفة حتى في محاولتهم الأولى. لقد قمنا بتوليد ما يقرب من 100 فيروس مؤتلف بعد هذا البروتوكول، بما في ذلك الفيروسات ذات الجينوم التي تمت إعادة هندستها للتعبير عن البروتينات الأجنبية (على سبيل المثال، FPs) التي تحتوي على إضافات التسلسل، والحذف، والطفرات النقطية.
تنطبق الشروط وأوقات الحضانة الواردة في هذا البروتوكول على تعافي سلالات متزايدة من الفيروسات المؤتلفة. وينبغي النظر في التعديلات إذا كانت محاولة استرداد فيروسات SA11 التي، بسبب التعديل الوراثي، قد يتوقع أن تنمو بشكل سيئ. على وجه الخصوص، لأن titer من هذه الفيروسات في الخلايا BHK-T7/MA014 قد تكون منخفضة، ونحن عادة ضعف كمية lysate المستخدمة كتلقيح في خطوات التضخيم اللاحقة. وعلاوة على ذلك، في خطوة التضخيم، قد تتطلب الفيروسات الضعيفة النمو أوقات حضانة أطول قبل الوصول إلى مستويات CPE كافية لحصاد الخلايا. في الواقع، مع مثل هذه الفيروسات، قد نسمح للعدوى بالمضي قدماً لمدة 10-14 يوماً، أو حتى لفترة أطول، قبل حصاد الخلايا. وأخيراً، من المرجح أن تولد الفيروسات الضعيفة النمو لويحات صغيرة بطيئة النمو على خلايا MA104. وبالتالي، لعزل البلاك هذه الفيروسات، قد يكون من الضروري السماح لللويحات بالتطور حتى 6-10 أيام بعد العدوى قبل تلطيخ الخلايا باللون الأحمر المحايد والتقاط اللويحات.
في تجربتنا، العامل الوحيد الأكثر أهمية في الانتعاش الموثوق به من فيروس الروتا المؤتلف هو استخدام الخلايا BHK-T7 صحية ومصانة بشكل جيد. في مختبرنا، نقوم بمرور خلايا BHK-T7 بشكل روتيني 2x في الأسبوع بنفس التخفيف باستخدام متوسط مكمل ليس فقط مع 10٪ FBS، ولكن أيضًا مع NEAA و TPB ومستويات عالية من الجلوكوز (GMEM المتوسط الكامل). المكملات الإضافية مساعدة BHK-T7 الخلايا الاحتفاظ قابلة للحياة الموسعة بعد التطفل البلازميد, عامل من المرجح أن تكون حاسمة لاسترداد الفيروسات المؤتلفة متحولة النمو سيئة النمو. نحن تكملة المتوسطة كل ممر آخر مع G418, مضاد حيوي الذي يختار لصيانة التعبير T7 البوليمرplasmid. وينبغي أن تكون ظروف المرور بحيث لا يسمح أبدا خلايا BHK-T7 لتنمو الماضي التقاء, الظروف التي تؤدي بسرعة إلى انخفاض قدرة الخلية على البقاء. بالنسبة لنا، فإن خلايا BHK-T7 التي تم السماح لها بالإفراط في النمو تؤدي أداءً ضعيفًا في بروتوكول علم الوراثة العكسي، حتى لو تم تمرير الخلايا لاحقًا بشكل مناسب عدة مرات. بدلاً من محاولة إعادة تأهيل خلايا BHK-T7 المتضخمة ، نقوم بإعادة تشغيل النسب بخلايا مخزنة سابقًا في النيتروجين السائل.
يمكن أن يكون تلوث الميكوبلازما لخلايا BHK-T7 و MA104 عاملاً رئيسياً في فشل نظام علم الوراثة العكسي لفيروس الروتا لتوليد فيروس مؤتلف. في مختبرنا، نستخدم مجموعة الكشف عن الميكوبلازما المستندة إلى PCR(جدول المواد)للتحقق من تلوث خطوط الخلايا، وعند اكتشافها، غالبًا ما يرتبط ذلك بخلايا BHK-T7. لم نحاول علاج خطوط الخلايا من تلويث الميكوبلازما ، بدلا من ذلك إعادة إنشاء الخطوط مع الممرات الخالية من الميكوبلازما في وقت سابق المخزنة في النيتروجين السائل. قبل البدء في خطوط الخلايا الجديدة، ونحن تجاهل جميع المكملات الغذائية المتوسطة والمتوسطة المستخدمة سابقا وإزالة التلوث تماما حاضنات، خزانات السلامة البيولوجية، وحمامات المياه، ومقاعد المختبر، والأنابيب. كما نستخدم مجموعات الكشف عن الميكوبلازما للتحقق من مخزون الفيروسات المؤتلفة للتلوث. بسبب مقاومة جزيئات فيروس الروتا لتسخ بواسطة المذيبات العضوية، مثل Vertrel VF32،فمن الممكن لتحرير مخزونات الفيروسات من تلويث الميكوبلازما، مما ينفي الحاجة إلى تجديد الفيروسات المؤتلفة عن طريق علم الوراثة العكسي. من المهم التأكيد على أنه يجب فحص خطوط الخلايا وتحضيرات الفيروسات التي يتم تلقيها إلى المختبر بحثًا عن تلوث الميكوبلازما قبل الاستخدام الروتيني.
على الرغم من أن اليوم في وبعد يوم، ونحن نستخدم نفس البروتوكول لتوليد الفيروسات المؤتلفة، ونحن نعلم أنه يمكن إجراء بعض التعديلات التي لن تحول دون استعادة الفيروس. على سبيل المثال، '1' لا يلزم التطفل المشترك لـ pCMV/NSP868R توج-إنزيم البلازميد مع ناقلات SA11 pT7 لاسترداد الفيروسات المؤتلفة. في حين أن إضافة البلازميد الغطاء ينتج أعلى titers الفيروس في الخلايا BHK-T7/MA104 الخلايا المنقولة، تمكنا من استعادة العديد من الفيروسات، بما في ذلك تلك التي تعبر عن FPs، دون ذلك. ومع ذلك، فقد خلصنا إلى أن التعبير عن إنزيم التوج بواسطة pCMV/NP868R قد يساهم بشكل كبير في استعادة الفيروسات الأقل ملاءمة. '2' لقد وجدنا أنه يمكن توليد فيروسات مؤتلفة حتى لو تم تخفيض كمية كاشف التطفل(جدول المواد)المستخدم في بروتوكول علم الوراثة العكسي بمقدار النصف، وهو تعديل يمكن أن يقلل بشكل كبير من النفقات. '3' وبالمثل، قررنا أنه يمكن استخدام الوسائط الكاملة M199 بدلا من المتوسط الكامل DMEM. '4' وأخيراً، لا يوجد شرط محدد فيما يتعلق بنوع العمود الفقري للمتجه الذي يجب استخدامه في إنتاج ناقلات النسخ SA11 T7. طالما أن cDNA الفيروسية في plasmid محاطة بمروج T7 المنبع وribozyme HDV المصب وT7 المنهي ، يمكن توقع البلازميد لدعم استعادة الفيروس المؤتلف. وتجدر الإشارة إلى أن ناقلات pGEM-و pBluescript وpUC المستندة إلى pUC قد استخدمت بنجاح في نظام علم الوراثة العكسي.
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة المنح R03 AI131072 وR21 AI144881، جامعة انديانا تمويل بدء التشغيل، ولورانس M. بلات الوقف. نشكر أعضاء مختبر روتاهوسير، أولريش ديسيلبرغر، وغيدو بابا على مساهماتهم واقتراحاتهم العديدة في تطوير بروتوكول علم الوراثة العكسي.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Baby Hamster Kidney - T7 RdRP (BHK-T7) Cells | Contact: ubuchholz@niaid.nih.gov | ||
Bio-Rad 8-16% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Bio-Rad | 45608105 | |
Cellometer AutoT4 viable cell counter | Nexcelom | ||
ChemiDoc MP Gel Imaging System | Bio-Rad | ||
Chloroform | MP | 194002 | |
Clarity Western Enhanced Chemiluminescence (ECL) Substrate | Bio-Rad | 170-5060 | |
Competent E.coli DH5alpha Bacteria | Lucigen | 60602-2 | |
Complete Protease Inhibitor | Pierce | A32965 | |
Disposable Transfer Pipettes, Ultrafine Extended Tips | MTC Bio | P4113-11 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Lonza | 12-604F | |
Eagle's Minimal Essential Medium, 2x (2xEMEM) | Quality Biological | 115-073-101 | |
Ethanol, Absolute (200 proof) | Fisher Bioreagents | BP2818-500 | |
Ethidium Bromide Solution (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Corning | 35-011-CV | |
Flag M2 Antibody, Mouse Monoclonal | Sigma-Aldrich | F1804 | |
GenEluate HP Plasmid Midiprep Kit | Sigma | NA0200-1KT | |
Geneticin (G-418) | Invitrogen | 10131-027 | |
Gibco FluroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM with low background fluorescence |
Glasgow Minimal Essential Medium (GMEM) | Gibco | 11710-035 | |
Goat Anti-Rabbit IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7074S | |
Guinea Pig Anti-NSP3 Antiserum | Patton lab | lot 55068 | |
Guinea Pig Anti-VP6 Antierum | Patton lab | lot 53963 | |
Horse Anti-Guinea Pig IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | KPL | 5220-0366 | |
Horse Anti-Mouse IgG, Horseradish eroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7076S | |
iNtRON Biotechnology e-Myco Mycoplasma PCR Detection Kit | JH Science | 25235 | |
Isopropyl alcohol | Macron | 3032-02 | |
L-glutamine Solution (100x) | Gibco | 25030-081 | |
Luria Agar Powder (Miller's LB Agar) | RPI research products | L24020-2000.0 | |
Medium 199 (M199) Culture Medium | Hyclone | Sh30253.01 | |
Minimal Essential Medium -Eagle Joklik's Forumation (SMEM) | Lonza | 04-719Q | |
Monkey Kidney (MA104) Cells | ATCC | ATCC CRL-2378.1 | |
NanoDrop One Spectrophotometer | ThermoScientific | ||
Neutral Red Solution (0.33%) | Sigma-Aldrich | N2889-100ml | |
Non-Essential Amino Acid Solution (100x) | Gibco | 11140-050 | |
Novex 10% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Invitrogen | XP00102BOX | |
Nuclease-Free Molecular Biology Grade Water | Invitrogen | 10977-015 | |
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit | Takara | 740609.25 | |
Opti-MEM Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 | |
Pellet pestle (RNase-free, disposable) | Fisher | 12-141-368 | |
Penicillin-Streptomycin Solution, (100x penn-strep) | Corning | 30-002-Cl | |
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x | Fisher Bioreagents | BP399-20 | |
Porcine Trypsin, Type IX-S | Sigma-Aldrich | T0303 | |
PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1223 | |
Qiagen Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12162 | |
Qiagen Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
SA11 pT7 Transcription Vectors | Addgene | 89162-89172 | |
SA11 pT7/NSP3 Transcription Vectors Expressing Fluorescent Proteins | Contact: jtpatton@iu.edu | ||
SeaKem LE Agarose | Lonza | 50000 | For gel electrophoresis |
SeaPlaque agarose | Lonza | 50100 | For plaque assay |
Superscript III One-Step RT-PCR kit | Invitrogen | 12574-035 | |
Trans-Blot Turbo Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad | 170-4270 | |
Trans-Llot Turbo Transfer System | Bio-Rad | ||
TransIT-LTI Transfection Reagent | Mirus | MIR2306 | |
Tris-Glycine-SDS Gel Running Buffer (10x) | Bio-Rad | 161-0772 | |
Triton X 100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
Trizol RNA Extraction Reagent | Ambion | 15596026 | |
Trypan blue | Corning | 25-900-CI | |
Trypsin (0.05%)-EDTA (0.1%) Cell Dissociation Solution | Quality Biological | 118-087-721 | |
Tryptose Phosphate Broth | Gibco | 18050-039 | |
Tween-20 | VWR | 0777-1L | |
Vertrel VF solvent | Zoro | G0707178 | |
Zoe Fluorescent Live Cell Imager | Bio-Rad |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved