العزلة، وتثبيت، وتصوير الفلورة الغدد الكظرية الماوس

هنا نقدم طريقة لعزل الغدد الكظرية من الفئران، وإصلاح الأنسجة، وقسم منهم، وأداء تلطيخ الفلورة.

تقنية راسخة للكشف عن المستضدات في الأنسجة مع عمل الأجسام المضادة مترافق fluorochrome الفلورة ولديها مجموعة واسعة من التطبيقات. الكشف عن المستضدات يسمح لتوصيف وتحديد العديد من أنواع الخلايا. تقع فوق الكليتين ومغلفة بطبقة من الخلايا الوسيطة، الغدة الكظرية جهاز الغدد الصماء تتألف من اثنين من أنسجة مختلفة مع مختلف الأصول الجنينية وميسونيفريك المتوسطة mesoderm-مشتقة الخارجي قشرة العصبية لب الداخلية المستمدة من كريست. تفرز قشرة الغدة الكظرية المنشطات (أي، مينيرالوكورتيكويدس، والكورتيزون، الهرمونات الجنسية)، في حين الكظر تنتج الكاتيشولامين (أي، الأدرينالين، نورادرينالين). أثناء إجراء البحوث الغدة الكظرية، من المهم أن تكون قادرة على التمييز بين خلايا فريدة من نوعها مع وظائف مختلفة. هنا نقدم بروتوكول وضعت في المختبر الذي يصف سلسلة من الخطوات المتسلسلة المطلوبة للحصول على تلطيخ الفلورة لوصف أنواع خلايا الغدة الكظرية. ونحن نركز أولاً على تشريح الغدد الكظرية الماوس، إزالة الدهون بيريادرينال متبوعاً بالتثبيت، وتجهيز وتضمين البارافين الأنسجة المجهرية. ثم يصف لنا تقطيع كتل الأنسجة مع مبضع دوارة. وأخيراً، نحن تفاصيل بروتوكول لتلطيخ إيمونوفلوريسسينت الغدد الكظرية التي قمنا بتطوير لتقليل جسم غير محددة ملزمة وأوتوفلوريسسينسي من أجل تحقيق إشارة أمثل.

إيمونوهيستوتشيميستري أسلوب للكشف عن مكونات النسيج باستخدام أجسام مضادة محددة من الجزيئات الخلوية وتقنيات المصبوغة اللاحقة للكشف عن الأجسام المضادة مترافق¹. يتطلب هذا الإجراء المناعي التثبيت المحددة وتجهيز الأنسجة التي تتحدد غالباً تجريبيا مستضد معين، استخدام أنسجة وجسم². تثبيت أمر حاسم للحفاظ على حالة الأنسجة وبالتالي الحفاظ على هياكل سوبسيلولار والخلوية سليمة وأنماط التعبير "الأصلي". كذلك تجهيز وتضمين إجراءات مطلوبة لإعداد الأنسجة لتمزيقها إلى شرائح رقيقة التي يتم استخدامها لدراسات نسيجية التي تنطوي على إيمونوهيستوتشيميستري.

يمكن إجراء إيمونوستاينينج مع الكشف اللونية أو الفلورسنت. كشف اللونية يتطلب استخدام إنزيم تحويل ركيزة القابلة لذوبان إلى منتج ملونة غير قابلة للذوبان. بينما يمكن مترافق هذا الإنزيم إلى جسم إذ تسلم المستضد (جسم الأولية)، هو أكثر في كثير من الأحيان مترافق بجسم الاعتراف بجسم الأولية (أي، جسم الثانوي). هذا الأسلوب حساسة للغاية؛ المنتج الملونة الناتجة عن رد فعل الانزيمية فوتوستابل ويتطلب إلا مجهر برايتفيلد للتصوير. ومع ذلك، إيمونوستينينج اللونية قد لا تكون مناسبة عندما تحاول أن تصور البروتينات هما ترجمة المشترك، نظراً للترسب لون واحد يمكن أن تخفي ترسب واحدة أخرى. في حالة الاشتراك تلطيخ، أثبت الفلورة لتكون أكثر فائدة. ويعزى ظهور الفلورة "ألبرت كونس" وزملائه، الذين وضعت نظاما لتحديد المستضدات الأنسجة مع الأجسام المضادة التي تحمل فلوريسسين وتصور لهم في الأنسجة مقطعة تحت الضوء فوق البنفسجي³. وتستند الأسفار الكشف عن جسم مترافق مع فلوروفوري التي تنبعث الضوء بعد الإثارة. لأن هناك عدة فلوروفوريس مع الانبعاثات عند أطوال موجية مختلفة (مع تداخل قليلاً أو لا)، طريقة الكشف عن هذا المثل الأعلى للدراسات الخاصة بالبروتينات متعددة.

الغدة الكظرية جهاز المزدوجة الموجودة فوق الكلي، وتتميز بعنصرين متميزين امبريولوجيكالي محاطة بكبسولة الوسيطة. قشرة الغدة الكظرية الخارجي، المستمدة من ميسوديرم المتوسطة ميسونيفريك، تفرز هرمونات الستيرويد بينما تنتج لب الداخلية، المستمدة من قمة العصبية، الكاتيشولامين بما فيها الأدرينالين ونورادرينالين والدوبامين. قشرة الغدة الكظرية ينقسم الأشيع ووظيفيا في ثلاث مناطق متحدة المركز، مع كل منطقة إفراز فئات مختلفة من هرمونات الستيرويد: الخارجي zona glomerulosa (زج) تنتج مينيرالوكورتيكويدس التي تنظم التوازن المنحل بالكهرباء و حجم داخل الأوعية؛ فاسسيكولاتا زونا الأوسط (zF)، مباشرة تحت زج، تفرز الكورتيزون التي تتوسط استجابة الإجهاد من خلال تعبئة مخازن الطاقة لزيادة جلوكوز البلازما؛ وقد زونا الداخلية (zR)، الذي يجمع الجنس السلائف الستيرويد (أي، وديهيدرو (داس))⁴.

يوجد بعض الاختلاف في تقسيم البطاني بين الأنواع: فعلى سبيل المثال، يفتقر موس موسكولوس zR. العاشر بعد الولادة الفريدة-منطقة موسكولوس م. من بقايا من قشرة الجنين تتميز بالخلايا الدهنية-الفقراء الصغيرة مع سيتوبلاسمس acidophilic⁵. س-المنطقة يختفي في سن البلوغ في الفئران الذكور وبعد الحمل الأول في الفئران الإناث، أو يتدهور تدريجيا في الإناث التي ولدت عدم^6،7. وعلاوة على ذلك، تورتوسيتي وسمك المعروضات زج علامة التباين بين الأنواع كما يفعل منظمة للخلايا الجذعية والسلف المحيطية في وزج المناطق المجاورة لها. الفئران، خلافا لسائر القوارض، لدى منطقة غير متمايزة مرئية (زو) بين زج و zF التي تعمل كمنطقة خلايا الجذعية و/أو منطقة عابرة تضخيم موروث. ما إذا كان زو فريدة من نوعها للفئران أو ببساطة أكثر بارزة نظمت مجموعة من الخلايا هو غير معروف^8،9.

تحتوي الخلايا للقشرة الكظرية قطرات الدهن التي تخزن استرات الكوليسترول التي تكون بمثابة مقدمة لجميع هرمونات الستيرويد^10،11.  ويعرف مصطلح "ستيرويدوجينيسيس" عملية إنتاج هرمونات الستيرويد من نسبة الكولسترول في الدم عن طريق سلسلة من التفاعلات الانزيمية التي تنطوي على نشاط عامل ستيرويدوجينيك 1 (SF1)، التعبير الذي علامة على إمكانات ستيرويدوجينيك. في الغدة الكظرية، التعبير Sf1 موجودة فقط في خلايا اللحاء¹². دراسة مثيرة لاهتمام وجدت التعبير عن البيوتين الذاتية في الخلايا البطاني مع احتمال ستيرويدوجينيك¹³. بينما يمكن أن يكون هذا سبب خلفية أعلى في أساليب المصبوغة البيوتين/المستندة إلى ستريبتافيدين، بسبب الكشف عن البيوتين الذاتية بجسم مترافق مع streptavidin، وهذه الخاصية يمكن استخدامها أيضا للتمييز في ستيرويدوجينيك خلايا من السكان الآخرين داخل الغدة الكظرية، أي، بطانية، والحافظة، وخلايا لب.

معصب من يتعاطف مع الخلايا العصبية بريجانجليونيك، الكظر تتسم بالخلايا باسوفيليك مع السيتوبلاسما حبيبية تتضمن أدرينالين وإفراز. خلايا لب تسمى "تشرومافين" بسبب ارتفاع محتوى الكاتيشولامين التي تشكل صبغة بني بعد أكسدة¹⁴. Hydroxylase التيروزين (TH) هو الإنزيم الذي يحفز الخطوة الحد من معدل في تركيب الكاتيشولامين، وفي الغدة الكظرية، وهو أعرب عن فقط في لب¹⁵.

نقدم هنا بروتوكولا لعزل الماوس الغدد الكظرية، تجهيزها للتضمين في البارافين وتمزيقها وأسلوب أداء الفلورة تلطيخ في الفروع الكظرية بغية التعرف على أنواع الخلايا التي تشكل قشرة الغدة الكظرية ولب. هذا البروتوكول معيار في المختبر إيمونوستينينج مع الأجسام المضادة متعددة تستخدم بشكل روتيني في بحوثنا.

وأجريت جميع الأساليب وفقا للبروتوكولات المعتمدة مؤسسياً تحت رعاية "اللجنة الجامعة" في استخدام ورعاية الحيوانات في جامعة ميشيغان.

1-التحضير لعملية جراحية

1. في اليوم السابق للجراحة، إعداد بارافورمالدهيد 4% (PFA)/الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). في حالة مختبرين المجمدة، انتقل إلى ذوبان الجليد واحدة وتخزينها في 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: 4% أن منهاج العمل ليست مستقرة لأكثر من 48 ساعة.
   تنبيه: منهاج عمل بيجين السامة وتجنب ملامسة الجلد والعيون، والتصرف في حاوية مناسبة.
2. في يوم الجراحة، إعداد الأدوات الجراحية تعقيم المقص والملقط مع 70% إيثانول (EtOH) والسماح لهم الجافة على منشفة ورقية.
3. مكان شغل لوحة 24-جيدا مع برنامج تلفزيوني 1 x (1 مل/بئر غير كافية) دلو الجليد.
   ملاحظة: سيتم الاحتفاظ الغدة الكظرية في هذا الطبق الثقافة المتعددة جيدا بعد الجراحة.

2-تشريح الغدة الكظرية

1. Euthanize الماوس بعد البروتوكولات القياسية المعتمدة "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك). مطلوب أسلوب ثانوي للقتل الرحيم لضمان الموت (على سبيل المثال قطع الرأس).
   1. للقتل الرحيم بجرعة إيسوفلوراني، ضع الماوس في غرفة مليئة بالابخرة isoflurane حتى توقف عن التنفس، ثم إزالة الماوس من الدائرة، وضع على سطح وأداء التفكك عنق الرحم.
      ملاحظة: معظم أساليب القتل الرحيم يسبب الضيق للحيوان وليست مناسبة للدراسات المتعلقة بالتوتر لأنها قد إضافة المتغير التباس من تنشيط محور الغدة النخامية-الغدة الكظرية وإطلاق الكاتيكولامينات النخاع. وفي هذه الحالة، يتم قطع الرأس الأسلوب المقترح لاعتماد.
2. وضع الماوس ضعيف، وتعقيم منطقة شق في البطن وسطوح السفوح مع 70% EtOH.
   ملاحظة: حين حلق الفراء ستزيد من العقم، لتطبيق معين هذا ليس ضروريا.
3. قطع الجلد في وسط البطن باستخدام مقص، فصل الجلد من الصفاق، ديسكين الماوس معسر الجلد حول القطع وسحب عليه في الاتجاهين المعاكس (والذيلية وروسترال). ثم قطع الصفاق حتى وصلت إلى مؤخرة الجناحين الأيمن والأيسر.
4. إزالة قطع الغدة الكظرية مورين حول الأنسجة الدهنية المحيطة به ووضعه في لوحة 24-مولتيويل مليئة ببرنامج تلفزيوني x 1، وأبقى على الجليد.

3-المناطق المحيطة بالمدن-الغدة الكظرية إزالة الدهون

1. تحت مجهر تشريح، ضع الغدة الكظرية على زجاج قاعدة أو طبق بيتري على لوحة المرحلة، ضع مصدر الضوء، حدد التكبير وضبط التركيز للحصول على رؤية واضحة للغدة الكظرية كامل.
   ملاحظة: يمكن أن تختلف عن التكبير استخدام التفضيلات الشخصية. التكبير تكبير الكلي من 30 X مع عدسة خطة 1 س، 3 س، والعدسة 10 X يسمح لتصور الغدة كاملة مع مجال رؤية جيدة.
2. بسرعة إزالة الأنسجة الدهنية المتاخمة مع اثنين 25 ز الإبر، وتجنب الجفاف الغدة الكظرية. إذا كان هذا يحدث قبل أن تتم إزالة جميع الدهون، تحرك الكظرية مرة أخرى إلى البئر الذي يحتوي على برنامج تلفزيوني x 1 لمدة 1 – 2 دقيقة، وثم المتابعة مع عملية إزالة الدهون.
3. أغسل x 2 ل 2 دقيقة في برنامج تلفزيوني 1 x.

4-الأنسجة المعالجة وتضمينها

1. إصلاح الأنسجة في 4% PFA/برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية على منصة هزاز ح 2.
2. إزالة 4% منهاج العمل، والمياه والصرف الصحي في الأنسجة مع برنامج تلفزيوني 1 x, x 3 ل 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
   تنبيه: منهاج عمل بيجين هو السامة ومن النفايات الخطرة؛ ينبغي التعامل معها بحذر تحت غطاء كيميائية والتخلص منها في حاوية نفايات الخطرة.
3. احتضان الغدة الكظرية في 50% EtOH في 4 درجات مئوية على منصة هزاز ح 2.
4. احتضان الغدة الكظرية في 70% EtOH في 4 درجات مئوية على منصة هزاز للحد ني ح 2.
   ملاحظة: إذا كان لا تسير مع الأنسجة المعالجة للتضمين، يمكن تخزين الغدة الكظرية في 70% EtOH في 4 درجات مئوية. تجنب تخزين طويل الأجل في 70% EtOH والشروع في معالجة الأنسجة أسرع غلة عينات ذات جودة أفضل.
5. إعداد الغدة الكظرية للأنسجة المعالجة بالتفاف في شاش وتضمينه في أنسجة التضمين كاسيت. ضع الكاسيت في جرة مليئة 70% EtOH ومخزن في 4 درجات مئوية حتى على استعداد للانتقال إلى المعالج الأنسجة. إدراج الكاسيت في النسيج المعالج المبرمجة كما ورد في الجدول 1 ، وتشغيل البرنامج.
6. تحويل الكاسيت إلى محطة تضمين مليئة البارافين ذاب في 65 درجة مئوية. إذا لم يتوفر محطة تبريد، ضع علبة تبريد باردة المجاورة له.
7. تسمية العفن تضمين وفتح الأنسجة التضمين كاسيت. استخدام زوج من الملقط، بسط الشاش ومكان الغدة الكظرية بلطف في الموضع المطلوب في المركز قاعدة في العفن التضمين. صب البرافين الذائب الغدة الكظرية. إذا لزم الأمر، عقد الغدة الكظرية مع الملقط لتأمين موقفه في العفن خلاف ذلك قد التحرك داخل القالب.
8. بلطف الانتقال العفن التضمين إلى علبة التبريد والانتظار حتى تصلب البارافين. بعد ذلك، لتسهيل تقطيع، تخزين قوالب التضمين في مكان بارد.

5-تقطيع مع مبضع دوارة

1. تحقق من أن مبضع نظيف قبل البدء، فرشاة بعيداً من جميع المخلفات المهملة البارافين، ضمان هو شحذ السكين (أو شفرة)، النفط الآلية الداخلية وسحب صاحب كتلة تماما إذا لزم الأمر.
2. تسمية مجموعة من الشرائح المجهر (إيجابيا اتهم أو المغلفة لمنع فقدان الأنسجة (انظر الجدول للمواد)) ووضع عليها في مجموعة شرائح الأكثر دفئا في 37 درجة مئوية، والاستغناء عن بعض المياه عالي النقاوة النوع يعقم 1 على رأس كل شريحة.
3. تعيين سمك الفرع 5 ميكرومتر.
4. إدراج شفرة مبضع في حامل بليد والسيطرة على زاوية النصل، وتأكد من أن الشفرة مكفول بقوة في الحامل والتحقق من إزالة كتلة البارافين وحامل كتلة.
5. إحضار صاحب كتلة لموقفه أعلى، وإذا كان ذلك ممكناً، قفل مقبض التشغيل وإزالة كتلة البارافين من العفن ووضعه داخل حامل كتلة تأمين ذلك بشدة مع المشبك. يجب أن تكون زاوية خط المنتصف للنصل مع السطح التي تواجه كتلة حوالي 20°. إذا لزم الأمر، تعديل كتلة البارافين.
   تنبيه: النصل حاد.
6. إذا كان مؤمناً، تطلق عجلة اليد وأقل كتلة البارافين حتى الوجه المستوى مع حافة النصل مبضع. قم بتدوير عجلة اليد مع إيقاع مطرد. أداء التشذيب الأولى لإزالة في البارافين وفضح الغدة الكظرية.
7. الاحتفاظ بتحويل عجلة اليد، والفرع حتى نهاية عام الغدة الكظرية. استخدام مجهر برايتفيلد أو تشريح للتحقق من وجود الأنسجة في الفروع. فصل الشريط من النصل ومع مساعدة زوج آخر من الملقط وضعه على الماء أرسى على الشريحة الزجاجية. قد يكون من المفيد وضع الشريط على سطح، وتمتد بعناية، وثم جبل على الشريحة.
8. واسمحوا الشرائح الجافة على صفيحة. ثم وضع لهم شقة في علبة شريحة وخبز في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها أو أطول إذا كانت المياه لا تزال موجودة. وبمجرد جفاف، تخزين الشرائح في مربع شريحة في درجة حرارة الغرفة.
9. التخلي عن جميع المعدات المستخدمة وتنظيف مبضع.

6-الفلورة

1. حدد الشرائح إيمونوستينينج ووضعها في حامل شريحة.
2. على لوحة الساخن، إحضار كوب مملوءة بسترات 0.01 متر في درجة الحموضة 2.0 ليغلي. حجم المخزن المؤقت الذي يعتمد على حجم الكأس ويجب أن يكون كافياً لتغطية الأقسام على الشرائح أثناء الغليان (بعض احتياجات التبخر أن تؤخذ في الاعتبار). تغطية الكأس برقائق الألومنيوم.
   ملاحظة: أساليب أخرى لاسترجاع مستضد المتاحة (انظر المناقشة).
3. ديبارافينيزي الشرائح الموجودة في العرض 100% زيلين نفط 2 x لمدة 5 دقائق. ترطيب الشرائح باستخدام السلسلة التالية: 100% EtOH 2 x لمدة 5 دقائق، 70% EtOH 2 x لمدة 5 دقائق، اكتب 1 الماء عالي النقاوة لمدة 5 دقائق.
   ملاحظة: بعد ديبارافينيزيشن، من المهم عدم السماح للفروع تجف: دائماً يجب أن تغطي أقسام الأنسجة مع حلول أو المخازن المؤقتة حتى نهاية الإجراء أو يمكن أن تتلف هيكل الأنسجة.
4. لاسترجاع مستضد، وضع الشرائح في حامل شريحة معدنية وأدخله في أخلطه مع الغليان سترات دون رقائق الألومنيوم. ندعه يغلي لمدة 10 دقائق.
5. إزالة الكأس من صفيحة وندعه يبرد لتأكد من أن الفروع الكظرية لا تزال تغطي مع المخزن المؤقت 20 دقيقة.
6. إعداد حل حظر. إذا كان استخدام تلطيخ المتاحة تجارياً كيت المستخدمة للحصول على نتائج الممثل (انظر الجدول للمواد)، في أنبوب إضافة 1.25 مل من برنامج تلفزيوني 1 x، 1 قطره (يعادل حوالي 45 ميليلتر) "كاشف حظر Ig الماوس"، و 5% من مصل الماعز العادي. تخزين حل حظر عند 4 درجة مئوية أو على الجليد أثناء العمل.
   ملاحظة: المصل المستخدم يعتمد على الأنواع المضيفة للجسم المضاد الثانوي. وقد استخدمت هنا الأجسام المضادة الثانوية التي أثيرت في الماعز. لأجسام أخرى، تركيزات مصل مختلفة قد تكون ضرورية. تجريبيا تحديد تركيز المصل الصحيح عن طريق اختبار تركيزات عدة.
7. نقل الشرائح إلى جرة كوبلين التي تحتوي على برنامج تلفزيوني 1 x واغسل 3 × 10 دقيقة كل في الروك مع هزاز لطيف.
8. إعداد دائرة هوميديفيد لتلطيخ.
9. تهز بلطف، إيقاف برنامج تلفزيوني من شريحة واحدة؛ مسح أسفل الشريحة مع مسح خالية من الوبر لإزالة برنامج تلفزيوني الزائدة.
10. باستخدام علامة خاصة للشرائح مع خصائص عمود المصباح، رسم دائرة المحيطة بكل مقطع الغدة الكظرية، التأكد من أن سطح الزجاج الجاف لتجنب نشر الحل الحبر للقسم. إذا لزم الأمر، بعناية يمسح الجافة على السطح. ضع الشريحة في قاعة هوميديفيد.
11. بسرعة، "الماصة؛" 50 ميليلتر (أو ما يكفي لتغطية الأقسام) لعرقلة الحل على كل قسم. احتضانها ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: حجب حجم الحل المطلوبة قد تختلف؛ من المهم أن المقاطع مغطاة جيدا بالحل.
12. إعداد الحل مادة من هذه المجموعة متوفرة تجارياً مع 7.5 مل من برنامج تلفزيوني 1 x، 600 ميليلتر من البروتين تركز الأسهم الحل و 5% مصل الماعز العادي (أو أي أخرى المصل وتركيز المستخدمة في حل حظر). تخزين مادة الحل عند 4 درجة مئوية أو على الجليد أثناء العمل.
13. إعداد الحلول الأولية جسم تمييع الأجسام المضادة الأولية بتركيزات مناسبة في حل مادة. لتلطيخ المشترك، إضافة قاسمة لكل جسم في أنبوب جديد، وتخلط برفق. وضع حلول الأجسام المضادة والأجسام المضادة على الجليد حتى جاهزة للاستخدام.
    ملاحظة: هنا استخدمنا جسم SF1 المضادة المثارة في أرنب وجسم ال المضادة المثارة في الماوس. لإعداد الجسم اتبع الحلول العامل وفقا لتوجيهات.
    1. حل العامل SF1، في أنبوب واحد، إضافة 1 ميليلتر من الأجسام المضادة-SF1 إلى 999 ميليلتر لحل مادة (تركيز النهائي 1.5 ميكروغرام/مل). لل حل عملي، في أنبوب، إضافة 1 جسم ال مكافحة ميليلتر في 499 ميليلتر لحل مادة (تركيز النهائية المقدرة من 2-6 ميكروغرام/مل).
    2. SF1 + ال جسم العامل ميكس، في أنبوب جديد، "الماصة؛" 250 ميليلتر من SF1 العامل الحل و 250 ميليلتر لل العامل الحل. المزيج بلطف بيبيتينج. تخزين على الجليد.
14. نقل الشرائح في جرة كوبلين التي تحتوي على برنامج تلفزيوني x 1 وتغسل x 3 لمدة 5 دقائق في الروك مع هزاز لطيف.
15. مكان الشرائح مرة أخرى إلى قاعة هوميديفيد بعد المسح قبالة فائض في برنامج تلفزيوني، ماصة SF1 + ال جسم العامل ميكس (أو حل جسم الأولية الأخرى) في كل مقطع، قم بإغلاق قاعة هوميديفيد وتركها بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
16. اليوم التالي، نقل الشرائح إلى كوبلين جرة تحتوي على 1 x PBS وتغسل x 3 لمدة 15 دقيقة على الروك مع هزاز لطيف.
17. بينما غسل الشرائح، إعداد الحل جسم الثانوي في مادة الحل باستخدام تركيز مناسب. إذا كان أداء المشترك تلطيخ، إضافة مبلغ مساو لكل حل جسم الثانوية في أنبوب جديد. المزيج بلطف بيبيتينج. تخزين على الجليد. حماية الأنابيب من الضوء وتخزينها على الجليد حتى جاهزة للاستخدام.
    ملاحظة: هنا، الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة هي 488 نانومتر الفلورسنت المسمى صبغ المضادة الماوس التي أثيرت في الماعز و 549 الفلورسنت المسمى صبغ المضادة أرنب المثارة في الماعز. أعد حل جسم الثانوية بإضافة 0.5 ميليلتر لكل جسم الثانوية في ميليلتر 799 من حل مادة (تركيزات نهائية من 1.2 ميكروغرام/مل).
18. ضع الشرائح مرة أخرى في قاعة هوميديفيد بعد إزالة الزائدة لبرنامج تلفزيوني، بسرعة "الماصة؛" الحل جسم الثانوي في الفروع الكظرية وإغلاق قاعة هوميديفيد وحماية من الضوء. احتضانها ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
19. يغسل الشرائح في جرة كوبلين مع برنامج تلفزيوني x 1 وتغسل x 3 لمدة 15 دقيقة على الروك مع هزاز لطيف، مع التأكد من حماية لهم من الضوء.
20. إعداد 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) الحل لتلطيخ النووية: 1 ميليلتر من DAPI (20 ملغ/مل) في 1 مل من س 1 برنامج تلفزيوني.
    ملاحظة: الأزرق-فلوري كونتيرستاين النووية يمكن أيضا أن يتحقق باستخدام صبغة هويشت.
21. "الماصة؛" محلول DAPI على الفروع الكظرية، وتغطية من الضوء واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 7 دقائق.
22. يغسل الشرائح في جرة كوبلين مع برنامج تلفزيوني x 1 وتغسل x 3 لمدة 5 دقائق في الروك مع هزاز لطيف مع حماية الشرائح من الضوء.
23. في منطقة محمية من الضوء المباشر، إلقاء زجاج الغطاء، ومن "الماصة؛" 60 ميليلتر أو حوالي 3 قطرات من عامل تركيب مناسب الفلورة على طول سطح الزجاج غطاء.
24. امسح برفق الجزء الخلفي من شريحة مع مسح خالية من الوبر، موقف الوجه للأسفل نحو الزجاج غطاء الشريحة وموازية لها، حيث تواجه أقسام الأنسجة الزجاج غطاء مع عامل المتزايدة على أنها. طفيفة اضغط الشريحة على زجاج الغطاء وتأكد من أن لا فقاعة هواء غير محاصرين بين الشريحة وزجاج الغطاء.
    1. إذا لزم الأمر، تطبيق مزيد من الضغط لإزالة فقاعات الهواء والزيادة في عامل المتصاعدة.
25. تقع أسفل الشريحة في حاوية الظلام وعلاج في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة (أو الوقت المحدد في ورقة المعلومات عامل التركيب المستخدمة) وثم الانتقال إلى التصوير.

7-التصوير

ملاحظة: مطلوب مجهر الأسفار متصل بكاميرا لكشف والتقاط fluorescence المنبعثة من الأنسجة بعد الإثارة عند أطوال موجية محددة. بينما الواضح، من المهم أن نتذكر أن تختار الثانوية مترافق مع فلوروتشروميس على جسم الإثارة التي وأطياف الانبعاثات متوافقة مع المعدات المتاحة. باختلاف إعدادات التصوير بالمجهر والبرمجيات المستخدمة لالتقاط الصور. وهناك بعض القواعد الأساسية التي يمكن تطبيقها لتصوير المقاطع الغدة الكظرية، مثل التأكد من أن وقت التعرض، الكاميرا الحصول على إعدادات، وكثافة مصدر الضوء هي تظل ثابتة.

1. قم بتشغيل الكاميرا ومصدر الضوء، وإطلاق برامج التصوير اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
   ملاحظة: يمكن أن تختلف عن ترتيب هذه الإجراءات والمعدات المستخدمة.
2. تأمين الشريحة على المسرح وفتح المصراع والتطلع إلى العدسات المجهر استخدام النووي قناة (DAPI) المصبوغة وتضخم منخفض (4 X) لتحديد الأنسجة على الشريحة: الفروع الكظرية صغيرة، وتصور ما قد يتطلب بعض الوقت.
3. قم بتغيير التركيز إلى تكبير أعلى (10 X)، وإغلاق المصراع.
   ملاحظة: من المهم تجنب المعرض طويلاً دون داع تحت الضوء الذي يمكن أن يسبب فوتوبليتشينج، مما أدى إلى فقدان الإشارة.
4. استخدام أوامر البرنامج، حدد الهدف (10 X) والقناة في استخدام (DAPI)، وضبط زمن التعرض (1 s، يمكن تعديلها إذا كان الإشارة قوية أو ضعيفة جداً). إذا كان متوفراً، تعيين binning للتصوير الحي (عدم اقتناء) التمكن من '2 × 2'، التحويل إلى 'متوسط'، قراءات السرعة إلى 20 ميجا هرتز '. إذا لم يعرض شريط مقياس البرمجيات المستخدمة في نهاية التصوير، حدد الخيار شريط مقياس من القائمة وموقف نقابة المحامين حيث المطلوب.
5. فتح المصراع وإعادة ضبط التركيز إذا لزم الأمر، وتبديل قنوات (فيتك، تريتك، DAPI). إذا لم الآلي المجهر، تأخذ صورة الغدة الكظرية في كل قناة دون الانتقال إلى المرحلة وتأكد من ضبط التحديد للقناة في استخدام. إغلاق مصراع بمجرد الانتهاء.
   ملاحظة: قم بتدوين الإعدادات المستخدمة في حالة البرنامج لا يحفظ تلقائياً لهم.
6. حفظ الصور.
   ملاحظة: الصور المدمجة يمكن غالباً إنشاء باستخدام البرمجيات في المجهر أو حزم البرامج محرر الرسومات الأخرى.
7. تكرار التصوير لمجالات أخرى من القسم و/أو مع تكبير أعلى.
   ملاحظة: 20 X تكبير غالباً ما يتطلب وقت تعرض أقصر (أي 800 مللي ثانية).
8. في نهاية التصوير، إغلاق جميع المعدات في الترتيب الصحيح.

ويمثل الشكل 1 تخطيطي بروتوكول كامل الموصوفة أعلاه. الغدد الكظرية يتم حصادها من الفئران وتتم إزالة الأنسجة الدهنية المجاورة تحت مجهر تشريح الغدة الكظرية ثم ثابتة في 4% منهاج عمل بيجين. بعد هذه الخطوة، معالجة الغدة الكظرية وجزءاً لا يتجزأ من البارافين، ومقطوع مع مبضع قطع الجهاز إلى شرائح رقيقة وتودع في شرائح المجهر. بعد تجفيف الأقسام، ينفذ الفلورة والأقسام يتم تصويرها في المجهر.

إزالة الدهون المجاورة (الشكل 2أ) مهم لتسهيل مواصلة تجهيز وتقطيع الغدد الكظرية. ويبين الشكل 2ب، حيث يمكن كشفها بسهولة الغدة الكظرية ولا الدهون الإضافية غير مرئية نجاح إزالة الأنسجة الدهنية المحيطة. أثناء هذه الخطوة من الأهمية بمكان، ومع ذلك، عدم السماح للغدة الكظرية الجافة بها أو هذا يمكن أن يضر بنية الأنسجة. جفاف التعرف عليها عند الغدة الكظرية يفترض مظهر متجعد (الشكل 2-ج). يمكن التغلب على هذه المشكلة بسهولة من ريهيدراتينج الكظرية في برنامج تلفزيوني x 1 قبل المتابعة مع إزالة الدهون.

النتائج النهائية التي تم الحصول عليها بعد هذا البروتوكول وترد في الشكل 3. وتوضح الصور الفلورة إيمونوستينينج الغدة الكظرية في تكبير مختلفة اثنين. أحمر تلطيخ النووية SF1 تسميات الخلايا البطاني، بينما تلطيخ الأخضر هيولى تسميات خلايا لب. كبسولة الخارجي يسمى تلطيخ النووية باللون الأزرق (DAPI) أنها ليست ستيرويدوجينيك (SF1-سلبية).

الشكل 1 : التمثيل التخطيطي للبروتوكول. بعد الحصاد في الغدد الكظرية، وإزالة الأنسجة الدهنية المتاخمة، يتم إصلاح الأنسجة في 4% منهاج عمل بيجين وتجهيزها لتضمين البارافين، ومقطوع. المقاطع ثم إيمونوستاينيد وتصويرها مجهر الأسفار. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 2 : إزالة الدهون في المناطق المحيطة بالمدن-الكظرية- (أ) الدهون المحيطة بإزالة الغدة الكظرية تحت مجهر تشريح. (ب) الغدة الكظرية بعد تنظيف. (ج) مثال لتجفيف الأنسجة والتي تتطلب ترطيب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3 : تصوير الفلورة الغدة الكظرية. مثال لتصوير الفلورة (في تكبير مختلفة) الغدة الكظرية ملطخة بعلامات قشرة الغدة الكظرية (SF1، تلطيخ النووية) ومن الكظر (TH، هيولى الخضراء). تتم تسمية نوى (DAPI) باللون الأزرق. جيم كبسولة؛ أول أكسيد الكربون: قشرة؛ م: لب. تغيير حجم أشرطة = 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- 

الجدول 1: برنامج المعالج الأنسجة.

ويصف هذا البروتوكول وسيلة لعزل الغدد الكظرية الماوس جنبا إلى جنب مع الإعداد وتلطيخ للغدة الكظرية مقطعة الماوس جزءا لا يتجزأ من البارافين.

بالمقارنة مع البروتوكولات الأخرى نحن اختبار، أثبت هذا البروتوكول الفلورة مناسبة لمعظم الأجسام المضادة المستخدمة في المختبر. ومع ذلك، في بعض الحالات قد يتطلب الأمر إجراء بعض التعديلات لتحسين نتائج المصبوغة. وهو متغير واحد يمكن بسهولة تعديل واختبارها مدة التثبيت. في المختبر، الحضانة في 4% منهاج العمل يمكن أن تختلف من ح 1 إلى ح 4، بينما في مختبرات أخرى هو تمديد وقت التثبيت إلى 12 – 24 ح¹⁶. في أيدينا، ومع ذلك، وقت تثبيت أطول أدت إلى زيادة الضوضاء ولم يكن الأمثل لأجسام عديدة تستخدم بشكل روتيني في ابحاثنا.

الرقم الهيدروجيني لاسترجاع مستضد يمكن أن تلعب أيضا دوراً في نجاح تلطيخ. استرجاع الحرارة المستحثة حانمه (هير) يمكن أن تتم من قبل استخدام الحلول المتاحة تجارياً مع pH تتراوح من الحمضية إلى القلوية، فضلا عن سائر المخازن المؤقتة جعلت داخلية مثل سترات (الرقم الهيدروجيني 6)، وحمض الإيثيلين (يدتا، ودرجة الحموضة 8) تريس يدتا (الرقم الهيدروجيني 9)، تريس (pH 10). كما يمكن علاج الانزيمية خياراً لفضح مستضد. حضانة الشرائح ديبارافينيزيد لفترة زمنية محدودة مع محلول يحتوي على تركيز مناسب لأنزيم (على سبيل المثال بروتيناز ك) يمكن أن تكون طريقة بديلة هير. من الضروري، مع ذلك، تيتراتي تركيز الإنزيم وتحديد فترة الحضانة المثالية، حيث الهضم المفرط يمكن أن تؤثر سلبا على نسيج¹⁷.

اختيار حجب المخزن المؤقت أيضا متغير آخر لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. وإلى جانب استخدام مصل الماعز العادي والمخزن المؤقت حظر المتاحة تجارياً المشار إليها في هذا البروتوكول (مناسب في هذه الحالة عند استخدام الماوس الأساسي الأجسام المضادة على أنسجة الماوس للحيلولة دون خلفية عالية بسبب الماوس الذاتية مفتش)، هناك الخيارات الإضافية المتوفرة مثل البروتين الحلول (ألبومين المصل البقري (BSA) أو الحليب الجاف) أو غيرها المخازن المؤقتة المتوفرة تجارياً. من المهم للتأكد من أن المخزن المؤقت الذي لا يحتوي على المواد التي يمكن أن تتداخل مع تلطيخ، مثل البيوتين عند استخدام بيوتين-ستريبتافيدين أساس الأسلوب.

الغدة الكظرية هي جهاز الغدد الصماء تتميز بالمحتوى الدهني المرتفع الذي كثيرا ما جعل immunostaining تحديا بسبب أوتوفلوريسسينسي العالية دهن. وعلاوة على ذلك، كورتيسيس الكظرية من الفئران والجرذان غنية في أوتوفلوريسسينت intracytoplasmic lipofuscin، مواد الحبيبية وغير متبلور مصطبغة التي تتراوح في اللون من اللون الأصفر إلى البنى. للتغلب على هذه المشكلة، يمكن أن يشفي مركبات مثل السودان الأسود ب (SBB) الأسفار التي تم إنشاؤها بواسطة ليبوفوسسينس¹⁸. هناك عامل آخر ينال من نتائج تلطيخ جيدة هو وجود خلايا الدم. الهيموغلوبين في الكريات الحمراء تمتص الضوء من الأطوال الموجية < 600 نانومتر ويمكن أن تتداخل مع فلوروتشروميس التي تمتد إلى أن الطول الموجي^19،20. بينما يمكن استخدام تقنيات التروية لمسح خلايا الدم من أنسجة الأوعية، كما يساعد استخدام كبريتات النحاس 10 ملم في درجة الحموضة 5 قبل تنفيذ كونتيرستاينينج النووية في قمع الأسفار غير المرغوب فيها²¹.

خطوة حاسمة في هذا البروتوكول هو تشريح الغدة الكظرية. الغدة الكظرية هي جهاز المكان الذي يمكن أن يكون صعباً لتحديد موقع في الموقع: في الفئران، الغدد الصغيرة وموقفهم متغير نوعا ما. وبخاصة في الحيوانات الأكبر سنا، محاطة الغدة الكظرية أيضا الأنسجة الدهنية التي يمكن أن تتداخل مع الكشف عن الغدد وما يترتب عليها من عزلتها، لهذا السبب من الأهمية بمكان أن يكون رؤية واضحة للمنطقة خلال هذه الخطوة من البروتوكول. إزالة لإزالة الدهون المحيطة-الكظرية خطوة حساسة. ينبغي إيلاء اهتمام خاص للغدة الكظرية أثناء فصل الدهون حتى لا يتعرض لتمزق الكبسولة. يجب أيضا أن الغدة تبقى رطبة مع برنامج تلفزيوني خلال الإجراء لتجنب تلف الأنسجة.

عند تقطيع، يمكن أن يكون تحديا عملية الكشف عن وجود جزء صغير من نسيج الغدة الكظرية في الأقسام بسبب نقص التصبغ الأنسجة بعد الخطوة المعالجة. مجهر مفيد جداً أثناء تقطيع للمميزين الأنسجة من الشمع.

إيمونوستينينج على أبواب جزءا لا يتجزأ من البارافين تقنية قيمة للبروتينات إيمونولابيلينج للفائدة مع الحفاظ على مورفولوجية النسيج. الطريقة المعروضة هنا يستند إلى الكشف عن الأسفار، وفي حين أنها وظيفية خاصة لدراسات استخدام الأجسام المضادة الأولية متعددة، إشارة fluorescence حساسة للضوء ويمكن خسرت بسهولة أو تضعف إذا لم يتم التعامل مع الشرائح بشكل صحيح (أي، إطالة التعرض للمجهر الخفيفة أو غير الضرورية من التعرض للضوء المحيط). وعلاوة على ذلك، يمكن أن نلاحظ انخفاض نوعية إشارة الأسفار نفسها على مر الزمن. يمكنك تجنب هذه المشكلة باستخدام الكشف اللونية، وهو فوتوستابل ويمكن تصور لسنوات عديدة. بيد أن هذا الأسلوب، يفتقر إلى مزايا الكشف عن الأسفار، مثل تصنيف أعلى من الدقة والعلامات المتزامنة من عدة بروتينات في دراسة واحدة.

تضمين البارافين طريقة ملائمة لمعالجة وتخزين عينات الأنسجة المتعددة. ومع ذلك، الأنسجة المعالجة البارافين التضمين نفسها ليست مناسبة لتصوير الصحفيين الفلورسنت وأعربت عن اندوجينوسلي في بعض الحيوانات المحورة وراثيا دون استخدام جسم محددة تستهدف المراسل. للواسمات طريقة لتفادي تدهور البروتين الفلورسنت وتسمح به التصور مباشرة تحت مجهر. تجنب استخدام جسم إضافي يمكن أن تمثل ميزة. من ناحية أخرى، نعد يمكن أيضا أن يكون الحد نظراً لأنه يؤثر على مورفولوجيا الأنسجة؛ كما أنه يتطلب معدات مختلفة لتمزيقها، ومن الممكن تخزين شرائح وكتل الأنسجة في الثلاجات فقط.

القيد الرئيسي واحد من تصوير أنسجة مقطعة هو القدرة على الحصول على صور للمكونات الهيكلية في عالية الدقة المكانية. وفي الواقع، تكوين الأنسجة، متغير رئيسي في تحديد نوعية التصوير نظراً لأنه يؤثر على اختراق الضوء ويمكن أن يؤدي إلى قرار الفقراء. الغدة الكظرية هي أنسجة غنية بالدهون التي تتسبب في ضوء التشتت²². في الدماغ، والذي لديه أيضا محتوى دهني المرتفع، وضعت تقنيات إزالة الأنسجة مثل الوضوح وباب، إيديسكو، و 3DISCO لتحسين التصور الأنسجة، والسماح لأفضل تصوير و 3D التعمير الأنسجة²³. هذه التقنيات هي تزويد الباحثين التصوير بيانات عالية الجودة، ويجري تكييف لمجموعة مختلفة من الأنسجة، وفي المستقبل، ونأمل أن تستخدم هذه الطرق لتصوير الغدة الكظرية كذلك.

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

ونشكر الدكتور محمد الزبير على اقتراحاته المفيدة والمساعدة التقنية في وضع هذا البروتوكول. كان يدعمها هذا العمل في المعهد الوطني لمرض السكري والجهاز الهضمي، وأمراض الكلي، "معاهد الصحة الوطنية لمنحه بحثية" 2R01-DK062027 (إلى G.D.H).