اختيار ابتمر الحمض النووي ملزم إستر حامض فثاليك وتوصيف وتطبيق أبتاسينسور الكهروكيميائية

ويرد وضع بروتوكول للتحديد في المختبر وتوصيف الابتامرات الحمض النووي ملزم إستر حامض فثاليك الخاصة بالمجموعة. ويرد أيضا تطبيق ابتمر المحدد في أبتاسينسور الكهروكيميائية.

حمض فثاليك أرون استرات (آيس) من المجموعات الرئيسية للملوثات العضوية الثابتة. الكشف عن مجموعة محددة من آيس المطلوب هو درجة عالية نظراً لتزايد سريع للمتجانسات. الابتامرات الحمض النووي قد طبقت متزايدة كعناصر الاعتراف على منصات بيوسينسور، ولكن الابتامرات تحديد اتجاه أهداف جزيء صغير جداً مسعور، مثل آيس، نادراً ما يقال. هذا العمل وصف أسلوب المستندة إلى حبة مصممة لتحديد الابتامرات الحمض النووي الخاصة بالمجموعة لايس. المجموعة الأمينية فونكتيوناليزيد والفثالات الفثالات (دبة-NH₂) المستهدف مرساة توليفها ومعطلة في الخرز [اغروس] تنشيط الإيبوكسي، مما يتيح عرض مجموعة إستر الافثاليك في سطح المصفوفة التثبيت، و ولذلك اختيار الاضبارات الخاصة بالمجموعة. حددنا الثوابت تفارق المرشحين ابتمر بتفاعل سلسلة البلمرة الكمية مقترنة بالفصل المغناطيسي. الوشائج النسبية والانتقائية في الابتامرات لايس أخرى تحددها الاختبارات التنافسية، حيث كان يحدها المرشحين ابتمر مسبقاً إلى دبة-NH₂ تعلق الخرز المغناطيسي وصدر للمادة طافية على الحضانة مع آيس تم اختبارها أو مواد أخرى التدخل المحتملة. تم تطبيق التحليل التنافسي لأنها تتيح مقارنة السطحية تقارب بين آيس أن كان لا من المجموعات الوظيفية للتثبيت السطحي. أخيرا، أظهرت تلفيق أبتاسينسور الكهروكيميائية وتستخدم للكشف عن bis(2-ethylhexyl) فتالات أولتراسينسيتيفي وانتقائية. يوفر هذا البروتوكول رؤى لاكتشاف ابتمر الجزيئات الصغيرة الأخرى مسعور.

جنبا إلى جنب مع التنمية الاقتصادية السريعة، وتسريع التصنيع والبناء الحضري والتلوث البيئي أكثر حدة من أي وقت مضى. وتشمل الملوثات البيئية النموذجية أيونات المعادن الثقيلة والسموم والمضادات الحيوية، ومبيدات الآفات، واختلال الغدد الصماء والملوثات العضوية الثابتة (POPs). أيونات المعادن والسموم، وإلى جانب الملوثات الأخرى جزيئات صغيرة جداً التي غالباً ما تتألف من مجموعة متنوعة من متجانسات. على سبيل المثال، تتضمن الملوثات العضوية الثابتة الأكثر سمية ثنائي الفينيل متعدد الكلور (PCBs)، والهيدروكربونات العطرية (العطرية)، ثنائيات الفينيل متعدد الكلور الاثير ثنائي الفينيل، وثنائي بنزو-فالديوكسينات (PCDDs)، ديبينزوفوران متعدد الكلور (PCDFs)، والافثاليك استرات حمض (آيس)^1،2، التي تتكون من العديد من متجانسات كافة. وقد أجريت الكشف عن جزيء صغير أساسا بالأساليب المستندة إلى الطيف اللوني/الجماهيري نظراً لتنوعها من التطبيقات^3،4،،من⁵⁶. المكتشفة في الموقع، كانت الأساليب المستندة إلى جسم مؤخرا نمواً^7،،من⁸⁹. ومع ذلك، نظراً لهذه الأساليب محددة للغاية لمتجانسات معينة، يجب إجراء اختبارات متعددة. ما أخطر أن المتجانسات الرواية التي تنمو بسرعة أنه لا يمكن إنشاء تلك الأجسام المضادة في الوقت المناسب. ولذلك، وضع أجهزة الاستشعار الخاصة بفريق لرصد المستويات الإجمالية لجميع المتجانسات في اختبار واحد قد توفر مقياس لا تقدر بثمن لتقييم حالة التلوث البيئي.

في الآونة الأخيرة، الابتامرات الحمض النووي طبقت على نطاق واسع كعناصر الاعتراف في مختلف المنابر بيوسينسينج بسبب قدرتها على الاعتراف بطائفة واسعة من الأهداف، من الأيونات والجزيئات الصغيرة للبروتينات والخلايا^{10،11 ،12}. يتم تحديد الابتامرات من خلال أسلوب في المختبر يسمى التطور المنهجي من يغاندس بتخصيب الأسية (سيليكس)^13،14. ويبدأ سيليكس المكتبة اليغنوكليوتيد عشوائي جديلة واحدة الاصطناعية، والذي يحتوي على حوالي 10¹⁴-10¹⁵ تسلسل. حجم المكتبة عشوائي يضمن تنوع هياكل مرشح الجيش الملكي النيبالي أو الحمض النووي. عملية سيليكس نموذجي يتكون من جولات متعددة لتخصيب اليورانيوم حتى هو إثراء المكتبة في تسلسل مع تقارب عالية وخصوصية إلى الهدف. ثم يتم تعيين تسلسل تجمع التخصيب النهائي، وثوابت التفكك (ك_د) وانتقائية ضد إمكانية التدخل المواد تتحدد بواسطة تقنيات مختلفة مثل تصفية ملزمة، تقارب اللوني، السطحية صدى مأكل مثل الطحين (موارد البرنامج الخاصة)، إلخ. ¹⁵

نظراً لقابلية الذوبان في الماء سيئة للغاية وعدم وجود المجموعات الوظيفية لتجميد السطحية، التحديد ابتمر من الملوثات العضوية الثابتة من الصعب نظرياً. وقد تقدما ملحوظا سيليكس الإسراع باكتشاف الابتامرات. ومع ذلك، اختيار مجموعة محددة الابتامرات للملوثات العضوية الثابتة لم قد يبلغ بعد. حتى الآن، كانت فقط الدنا ثنائي الفينيل متعدد الكلور-ربط الابتامرات مع خصوصية عالية لمتجانسات معينة حددت¹⁶. آيس تستخدم أساسا في مواد البولي فينيل كلوريد، تغيير البولي فينيل كلوريد من بلاستيك الصلب البلاستيك مرنة، وبالتالي بوصفها الملدنات. بعض آيس قد حددت كعوامل اختلال الغدد الصماء، ويمكن أن تسبب ضررا خطيرا للكبد ووظائف الكلي، تقليل حركية الحيوانات المنوية الذكور، وقد تسفر عن مورفولوجيا الحيوانات المنوية غير طبيعي وسرطان الخصية¹⁷. وأبلغ مجمع-وﻻ الابتامرات PAE الملزمة الخاصة بالمجموعة.

والهدف من هذا العمل تقديم بروتوكول ممثل لاختيار مجموعة محددة الحمض النووي الابتامرات إلى جزيئات صغيرة جداً مسعور مثل آيس، مجموعة تمثيلية من الملوثات العضوية الثابتة. ونحن أيضا بيان تطبيق ابتمر المحددة للكشف عن التلوث البيئي. يوفر هذا البروتوكول توجيهات ورؤى لاكتشاف ابتمر الجزيئات الصغيرة الأخرى مسعور.

1-المكتبة والتصميم التمهيدي والتوليف

1. تصميم المكتبة الأولى والإشعال.
   مكتبة (تجمع₀): 5 '-تكككاكجكاتكتككاكاتك-N40-ككتتكتجتككتككجتكاك-3'
   إلى الأمام التمهيدي (FP):-تكككاكجكاتكتككاكاتك 5 '-3'
   فوسفوريلاتيد عكس التمهيدي (ص. ب.₄-RP): 5 'بو₄-جتجاكجاجاكاجااج-3'
2. توليف تجمع₀، وتنظيم الأسرة، وبو₄-البرنامج العادي باستخدام فوسفوراميديتي القياسية الكيمياء^18،،من¹⁹²⁰، وتنقية جميع السلطات الوطنية المعينة واسطة قياسية عالية الأداء اللوني السائل ([هبلك])²¹.
3. إعادة تشكيل تجمع₀، وتنظيم الأسرة، وبو₄-RP في الصف خالية من نوكلياسي الماء في 100 ميكرومتر، اليكووت، وتخزينها في-20 أو-80 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنة واحدة.
   ملاحظة: يقترح بشدة تخزين تجمع₀، وتنظيم الأسرة، وبو₄-RP في 10-20 ميليلتر مختبرين لتجنب التلوث المتبادل ممكن.

2-توليف هدف الربط والتثبيت، على تنشيط الإيبوكسي حبة [اغروس]

1. توليف فثالات والفثالات المجموعة الأمينية فونكتيوناليزيد (دبة-NH₂) كهدف الربط.
   ملاحظة: قد وصف تفاصيل التجريبية في التوليف وتوصيف دبة-NH₂ في الأدب²².
2. إعداد نقطة ارتساء الحلول المستهدفة المخزون في وسيلة مناسبة للذوبان المستهدفة. لهذه الدراسة، وإعداد حل الأسهم 100 مم دبة-NH₂ في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) وتخزين الحل في 4 أو-20 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنة واحدة.
3. شل دبة-NH₂ على [اغروس] تنشيط الإيبوكسي الخرز وفقا لبروتوكول تم تعديل من الشركة المصنعة.
   1. تزن بمسحوق تجميد المجفف 0.1 غ من حبات [اغروس] تنشيط الإيبوكسي وتعليقه في الماء المقطر. أغسل متوسطة لمدة 1 ساعة باستخدام 20 مل المقطر ماء أضيف في مختبرين عدة. غسل المتوسطة مع 0.2 م Na₂CO₃ (الرقم الهيدروجيني 12).
      ملاحظة: المتوسط تتضخم فورا بعد إضافة الماء في ذلك.
   2. حل دبة-NH₂ (46.7 ملغ، 0.15 ميللي مول) في المخزن المؤقت لاقتران ميليلتر 500 (0.2 م Na₂CO₃ المخزن المؤقت).
   3. مزيج من اقتران الحل المتضمن يجند مع المتوسط. استخدام شاكر 5 لفة في الدقيقة ل 48 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
   4. تكرار غسل المنتج ثلاث مرات، التتابع باستخدام 0.1 م خلات المخزن المؤقت (0.5 م NaCl، الأس الهيدروجيني 4.5) وكربونات 0.2 م المخزن المؤقت (0.5 م NaCl، الأس الهيدروجيني 12) في كل دورة غسيل. أغسل وتعليق المنتج في المياه لجعل وحدة التخزين النهائي من 500 ميليلتر.
   5. تخزين المنتج في 4 درجات مئوية قبل الاستخدام.
   6. تأكيد نجاح التثبيت الهدف من تحليل عنصري.

3-سيليكس

1. إعداد 500 مل من المخزن المؤقت ملزم PAE في المياه النقية فائقة أو المياه خالية من نوكلاس الصف مع 20 مم Tris· HCl، 100 ملم كلوريد الصوديوم و مجكل 2 مم₂، 5 ملم بوكل، كاكل 1 مم₂، 1% بوليوكسيثي لين مونولوراتي سوربيتان (20) وعامل نشط غير الأيونية سطح 0.03 في المائة (الرقم الهيدروجيني 7.9). تصفية المخزن المؤقت من خلال عامل تصفية النيتروسليلوز 0.22 ميكرومتر عقيمة وتخزينها عند درجة حرارة أعلى من 20 درجة مئوية لمدة أشهر.
   ملاحظة: من المهم للحفاظ على حالة جيدة تشتت آيس في المخزن المؤقت لربط ملحق العنوان الفعلي. أنواع متعددة من التوتر السطحي هناك حاجة لتعزيز قابلية الذوبان لايس في المحلول. ومع ذلك، ينبغي إبقاء العدد من التوتر السطحي للحد أدنى لتجنب تشكيل المذيلات السطح التي سوف تغلف جزيئات PAE. عامل نشط السطحية عدم الأيونية، من السهل أن يعجل في درجات حرارة أقل من 20 درجة مئوية، وذلك يجب تخزين المخزن المؤقت عند درجة حرارة أعلى من 20 درجة مئوية.
2. تمييع 10 ميليلتر من 100 ميكرومتر تجمع₀(نمول ~1.0 لتسلسل^{15 14}-10 10) في ميليلتر 490 PAE ملزمة المخزن المؤقت. الحرارة مختبرين₀ مسبح (5 × 100 ميليلتر) في أنابيب رقيقة الجدار أجهزة الطرد المركزي في مجموعة حمام المياه عند 95 درجة مئوية للحد الأدنى 10 مكان الأنابيب على الجليد لمدة 5 دقائق وبعد ذلك احتضان هذه الأنابيب لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (~ 25 درجة مئوية في هذا العمل).
3. الجولة الأولى من التحديد: الحضانة لتجمع₀ و₂DBP−NH −coated المتوسطة.
   1. غسل 200 ميليلتر من DBP−NH₂−coated متوسطة ثلاث مرات مع 500 ميليلتر من المخزن المؤقت ملزم PAE. DBP−NH ميكس₂المتوسطة −coated مع تجمع₀ واحتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة ح 1 تحت الهز الخفيف.
   2. منفصلة المتوسطة −coated₂DBP−NH ملزمة مع الابتامرات من السلطات الوطنية المعينة غير منضم بأنبوب أولترافيلتريشن أوسينجان أولترافيلتريشن مع وقف جزيئية كاتشين 100. تغسل في المتوسط ثلاث مرات مع 500 ميليلتر PAE ملزمة المخزن المؤقت والطرد المركزي في ز × 9,168 لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
4. الجولة الأولى من التحديد: شطف ابتمر من DBP−NH₂−coated متوسطة.
   1. إضافة 50 ميليلتر من المخزن المؤقت ملزم PAE لغسلها المتوسطة وحرارة الخليط عند 90 درجة مئوية لمدة دقيقة 9 تحت تهز.
   2. جمع المادة طافية التي تحتوي على DNAs التيد أولترافيلتريشن. كرر هذه العملية شطف ثلاث مرات لاسترداد أكثر من ملزمة المعينة.
5. الجولة الأولى من التحديد: بكر
   1. نطاق صغير بكر
      1. أداء نطاق صغير بكر²³ (4 × 20 ميليلتر مختبرين) استخدام ~ 15-30 دورات. إعداد رد فعل بكر²⁴ كما يلي: 6.5 ميليلتر من المياه خالية من رناسي، ميليلتر 1 من كل 10 ميكرون التمهيدي (FP، ص₄-RP، نمول 0.01 كل) 1.5 ميليلتر التيد تجمع من القسم 3.4 (أو المياه خالية من رناسي كالمراقبة السلبية) وممزوجة مسبقاً 10 ميليلتر من رد الفعل الذي يحتوي على خليط بدء دنتبس، الساخنة بوليميريز، و 2 × [بكر] رد فعل المخزن المؤقت (tris· 20 مم HCl، 100 ملم بوكل، 3 مم مجكل₂، الرقم الهيدروجيني 8.3).
      2. تشغيل PCR استخدام cycler حرارية بالإعدادات التالية: 1 دورة 95 درجة مئوية، 1 دقيقة؛ 30 دورات من [95 درجة مئوية، 30 s; 56 درجة مئوية، 30 s; 72 درجة مئوية، 30 s]؛ 1 دورة 72 درجة مئوية، 2 دقيقة وعقد في 4 درجات مئوية. عندما يتم تشغيل الأداة ق^ال 20 من الخطوات تمديدها 15، 20، 25، ودورات 30، اضغط على مفتاح الإيقاف المؤقت، فتح الغطاء الصك وأخذ أنبوب واحد من ثم اضغط مفتاح وقفه مرة أخرى لاستئناف PCR.
      3. إعداد 12% التشويه والتحريف polyacrylamide هلام استشراد (صفحة)^25،26. مزيج 4.8 غم يوريا، 6 مل مياه النقية فائقة، 1 مل حمض تريس/بوريك × 10/الإيثيلين ديامينى tetraacetic حمض (TBE)، 3 مل اكريلاميد 40 ٪، 10 ميليلتر من تيتراميثيليثيلينيدياميني (تيميد)، و 100 ميليلتر 10% الأمونيوم فوق كبريتات (الجزائرية)، بهذا الترتيب. يقلب جيدا وانتظر ح 1.5-2 ضمان الهلام يتصلب تماما.
      4. تحليل نتائج دورة التحسين: الجمع بين 1 ميليلتر من كل منتج PCR مع 5 ميليلتر من الجيش الملكي النيبالي تحميل المخزن المؤقت (62.5 في المائة ميثلامين، والفورمالديهايد 0.4 متر، 1.25×3-(N-morpholino) بروبانسولفونيك المخزن المؤقت حامض، 0.02% زيلين نفط زايلين فرنك فرنسي، 0.02% بروموفينول الأزرق)، و 4 ميليلتر من المياه خالية من رناسي؛ تسخين المزيج في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، وتبرد بسرعة إلى 0 درجة مئوية على الجليد؛ احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة؛ تحميل 5 آبار منفصلة من 12% إلى التشويه والتحريف صفحة؛ تشغيل التفريد بنظام التفريد رأسي في 1 × TBE العازلة في 170 الخامس لمدة 45 دقيقة.
      5. بعد التفريد، وصمة عار الجل مع ميليلتر 3 1 × الحمض النووي جل وصمة عار في 30 مل من 1 × TBE العازلة لمدة 10 دقائق، وتأخذ صورة للهلام.
   2. الكبيرة مقياس PCR: حدد العدد المناسب من دورات لإنتاج شريط كثافة أعلى في علامة الحجم الصحيح دون الجانبية غير المرغوب فيها. تنفيذ نطاق واسع بكر (20 × 100 ميليلتر مختبرين) الاستفادة من الظروف والعدد المناسب من دورات مصممة في القسم 3.5.1.
      ملاحظة: المبلغ النهائي لمكتبة واحدة-الذين تقطعت بهم السبل التي يمكن الحصول عليها النسبي إلى الحجم الكلي لبكر، عدم التركيز القالب. نموذجياً, يحتاج تجمع واحد-الذين تقطعت بهم السبل للحصول على 1 نمول من مكتبة، 2 مل PCR. [بكر] حساسة للغاية والملوثة بسهولة من خارج السلطات الوطنية المعينة. وينبغي اتخاذ خطوات للحد من فرصة للتلوث، مثل ارتداء القفازات واستخدام تلميحات معقمة وعدم البصق في الأنابيب وعدم فتح غطاء أنبوب PCR قبل الطرد المركزي.
6. الجولة الأولى من التحديد: تنقية المنتج بكر بترسيب الإيثانول.
   1. ضم أنبوبين من مزيج PCR في أنبوب واحد (200 ميليلتر في كل). كرر هذه العملية لجميع الأنابيب.
   2. إضافة 15 ميليلتر من صوديوم اسيتات (3m, pH 5.2) الحل و 4 ميليلتر من الحمض النووي/رنا هطول الأمطار حاملة الحل وأوقات 2.5 حجم الإيثانول يبرد قبل في-20 درجة مئوية في كل أنبوب. الخلط بينهما بالتساوي.
      ملاحظة: يستخدم الناقل ترسيب الحمض النووي/الجيش الملكي النيبالي على نطاق واسع في الإيثانول الأمطار تجارب لتحسين نسبة الاسترداد من الحمض النووي/رنا تركيزات منخفضة بشكل ملحوظ. لا تتداخل مع تطبيقات المصب مثل PCR وتسلسلها.
   3. الطرد المركزي الخليط في 20,627 × ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية وعناية تجاهل المادة طافية وترك ترسبات بيضاء.
   4. إضافة 400 ميليلتر من 70% قبل التبريد الحل الإيثانول في-20 درجة مئوية في كل أنبوب يغسل هطول الأمطار. الطرد المركزي الخليط في 20,627 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وتجاهل المادة طافية بعناية وترك ترسبات بيضاء. كرر الخطوة يغسل مرتين أخريين.
   5. قم بفتح غطاء الأنبوبة؛ وخز الغشاء الختم؛ واسمحوا الإيثانول تطيير عند 40 درجة مئوية في كتلة التدفئة حتى يصبح ترسبات بيضاء شفافة. تخزين متسرعا في-20 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن تخزين المنتج بكر المنقي في-20 درجة مئوية.
7. الجولة الأولى من التحديد: واحد-الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي (الجيل تجمع المخصب₁) عن طريق إجراء رد فعل [ااكسونوكلس] λ لهضم حبلا عكس فوسفوريلاتيد.
   1. رد فعل [ااكسونوكلس] λ صغيرة الحجم
      1. إضافة 100 ميليلتر من المياه خالية من رناسي إلى أنبوب واحد يحتوي على المنتج بكر المنقي من المقطع 3.6. دوامة الأنبوب تماما حل متسرعا في الأنبوب.
      2. إعداد خمسة أنابيب الطرد المركزي، وإضافة 5 ميليلتر من الحل أعلاه، 11 ميليلتر من رناسي-المياه مجاناً، و 2 ميليلتر من المخزن المؤقت رد فعل × 10 (670 مم جليكاين-كوه، 25 مم مجكل₂ ، 0.1% (v/v) الأس الهيدروجيني X-100 تريتون 9.4) في كل أنبوب.
      3. إضافة 2 ميليلتر من الماء أو λ المخفف [ااكسونوكلس] محلول يحتوي على 2 يو و 5 ش 8 ش 10 ش λ [ااكسونوكلس] إلى هذه الأنابيب، على التوالي. مزيج الحل جيدا من قبل بيبيتينج برفق. يتم توفيرها جنبا إلى جنب مع اكسونوكليسيفروم λ × 10 رد فعل المخزن المؤقت الموفر.
      4. احتضان هذه الأنابيب لمدة 35 دقيقة على 37 درجة مئوية، 15 دقيقة في 80 درجة مئوية، وعقد في 4 درجات مئوية.
      5. إعداد الصفحة الأصلية 12%. مزيج 6 مل مياه النقية فائقة، 1 مل 10 × TBE، 3 مل من الاكريلاميد 40% و 10 ميليلتر من تيميد ميليلتر 100% 10 وكالة الأنباء الجزائرية، بهذا الترتيب. يقلب جيدا والانتظار لمدة 60-90 دقيقة لضمان الجل يتصلب تماما.
      6. تحليل النتائج من ردود الفعل من خلال الجمع بين 5 ميليلتر من كل رد فعل مع ميليلتر 1 تحميل صبغ و 4 ميليلتر من المياه خالية من رناسي، وتحميل هذه المخاليط إلى 5 آبار منفصلة من 12% أصلي صفحة (150 الخامس لمدة 45 دقيقة).
         ملاحظة: يمكن أيضا تحميل سلم الحمض النووي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل بي بي 20 في الجل، ولكن قد لا يكون ضروريا نظراً لإظهار النطاقات مميزة بكر المنتج والمكتبة الذين تقطعت بهم السبل الوحيدة التي تم إنشاؤها في الهلام.
         ملاحظة: قد رد فعل [ااكسونوكلس] λ انتقائية هيكلية ممتازة. يمكن هضمها المنتج بكر مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل (يسمى حبلا المضادة الشعور مع مجموعة فوسفات في نهاية 5 ') تماما في مكتبة واحدة-الذين تقطعت بهم السبل في حضور [ااكسونوكلس] λ في طائفة واسعة جداً من تركيز (الشكل 4). الحد الأدنى لمبلغ λ [ااكسونوكلس] التي يمكن أن تولد تماما دنا مفرد-الذين تقطعت بهم السبل في رد فعل [ااكسونوكلس] λ صغيرة الحجم يستخدم أيضا لرد فعل [ااكسونوكلس] λ واسعة النطاق. كما يمكن استخدام تركيز أعلى من λ [ااكسونوكلس]، حيث λ [ااكسونوكلس] يعمل جيدا في طائفة واسعة من تركيز دون أن تفقد في هيكل الانتقائية والمنتج العائد. تحول دون رد فعل [ااكسونوكلس] λ بتركيزات عالية من الملح. الهضم غير مكتملة من المنتج بكر يعني عادة وجود الكثير جداً من الملح في المنتج PCR. تنقية منتجات PCR بترسيب الإيثانول (قسم 3.6) عادة ما تكون متوافقة مع هذه الخطوة، بينما المنتج بكر المنقي بترسيب الايزوبروبانول في كثير من الأحيان يحتوي على الكثير من الملح.
   2. رد فعل [ااكسونوكلس] λ واسعة النطاق: اختيار الحد الأدنى لمبلغ λ [ااكسونوكلس] التي يمكن أن تولد تماما واحد-الذين تقطعت بهم السبل المعينة لرد فعل [ااكسونوكلس] λ واسعة النطاق. رد الفعل هو الارتقاء بالتناسب وفقا لهذا الشرط. فعلى سبيل المثال: إذا كان 2 يو هو الحد الأدنى من المطلوب [ااكسونوكلس] λ، مزيج ميليلتر 38 من المياه خالية من رناسي، 10 ميليلتر من 10 × المخزن المؤقت، 50 ميليلتر من الحمض النووي بركة₁ و 2 ميليلتر من 10 [ااكسونوكلس] λ U/ميليلتر.
8. الجولة الأولى من التحديد: تنقية حوض واحد-الذين تقطعت بهم السبل₁ بترسيب الإيثانول.
   1. اتبع الإرشادات التي تظهر الخطوة 3، 6.
   2. تحديد التركيز تنقيته تجمع₁ بامتصاص الأشعة فوق البنفسجية في 260 نيوتن متر.
   3. تشكيل تجمع 90% تنقية₁ في وحدة تخزين مناسبة PAE ملزمة المخزن المؤقت. إذا لم يكن هناك ما يكفي الحمض النووي التي تم الحصول عليها للجولة القادمة من التحديد، كرر المقاطع 3.5-3.8.2.
      ملاحظة: حجم المخزن المؤقت ملزم PAE عادة تختلف من 200 إلى 500 ميليلتر وفقا للكمية من مكتبة وتركيز النهائية المرجوة من مكتبة في الجولة القادمة من سيليكس.
9. الثانية والثالثة، والرابعة، والخامسة جولات سيليكس.
   1. السلوك الثاني والثالث والرابع، وجولات الخامسة من سيليكس بعد ذلك اتباع نفس الإجراءات المذكورة أعلاه (القسم 3.2-3.8)، إلا أنه تم إدخال المكتبة pmol ~ 300 زيادة صرامة الانتقاء.
   2. للتقليل من امتصاص غير محدد للسلطات الوطنية المعينة في المتوسط، احتضان حوض السباحة مع متوسط غير معدلة على شاكر دوارة لمدة 30 دقيقة في الثالثة والجولة الرابعة للتحديد قبل الحضانة مع المتوسطة −coated₂DBP−NH.
      ملاحظة: عملية سيليكس انتهت في الجولة الخامسة بسبب التشعب خطيرة بين السلطات الوطنية المعينة التي كشفت عنها كمية كبيرة من المنتجات عالية الوزن الجزيئي التي لم تهاجر إلى الهلام.

4-الفائق التسلسل

1. إعداد تجمع₄ من قسم 3.9.2 لتسلسل من [بكر] تضخيم مع الإشعال متوافقة.
   1. تصميم وتجميع مفهرس تمهيدي إلى الأمام مع 6 nt في النهاية 5 ' لتسهيل تحليل تسلسل.
      فهرسة التمهيدي إلى الأمام (FP-التسلسل):-أجتاكجاتكككاكجكاتكتككاكاتك 5 '-3'
   2. إعداد رد فعل 1,000 µLPCR كما يلي: ميليلتر 380 من المياه خالية من رناسي، 50 ميليلتر من كل التمهيدي 10 ميكرون (FP-التسلسل، ص₄-RP، نمول 0.5 كل)، 20 ميليلتر من تجمع التيد من قسم 3.9.2، و 500 ميليلتر من رد فعل مزيج يحتوي على دنتبس ممزوجة مسبقاً، وبدء الساخنة بوليميراز ، ورد فعل المخزن المؤقت PCR × 2. قاسمة هذا الخليط إلى 10 أنابيب PCR. استخدام نفس شروط بكر كما هو موضح في القسم 3.5.1.2.
2. تنقية المنتج PCR للوفاء بمتطلبات المرفق التسلسل. على سبيل المثال، استخدام أدوات استرداد صفحة-جل الحمض النووي وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
3. إرسال المنتج بكر المنقي (~ 2 ميكروغرام) إلى مرفق تسلسل ظروف الشحن المطلوبة مرفق التسلسل. على سبيل المثال، شحن المنتج بكر في أنبوب الطرد مركزي مع قبعات مختومة تماما مع حزم الجليد إلى مرفق التسلسل.
   ملاحظة: تلقي النتائج التي احتلت المرتبة في تسلسل وفقا لعدد النسخ لكل تسلسل لتقييم في إثراء مجموعة متسلسلة. التسلسل الأعلى الذي كان اسمه دبة-1 (-كتتكتجتككتككجتكاكاتكككاكجكاتكتككاكات 5 '-3'). وقيست تقارب والانتقائية ببروتوكول التالية (القسم 5 و 6). تطبيقه في بيو-استشعار الكهروكيميائية اتضح فيما بعد في القسم 7.

5- ك_د "عزم لتحديد ابتمر المرشحين" باستخدام PCR كمي Magnetic Bead-Based (قبكر)

1. توليف دبة-1-قبكر وكبسولة تفجير باستخدام الكيمياء فوسفوراميديتي القياسية وتنقية حسب معيار [هبلك].
   مرشح ابتمر (دبة-1-قبكر):-ككاكجكاتكتككاكاتاجاتاجتاجتجكاتكت أتاككاجكتاتكاتكتتكتجتككتككجتكاكاتك 5 '-3'
   إلى الأمام التمهيدي ل qPCR (FP-قبكر):-أتاككاجكتاتكات 5 '-3'
   عكس التمهيدي ل qPCR (RP-قبكر):-أجاتجكاكتاكتاتكت 5 '-3'
   ملاحظة: مناطق تسلسل اختبار التمهيدي مختلفة عن تلك التي تجمع₀ المستخدمة في القسم 3. والغرض من تغيير المناطق التمهيدي اختبار تقارب تسلسل الأساسية وحدها، باستثناء منطقتي التمهيدي.
2. شل دبة-NH₂ على الخرز المغناطيسي المغلفة بحمض الكربوكسيلية اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
   1. أغسل حبات مغناطيسية المغلفة بحمض الكربوكسيلية مرتين مع 25 مم 2-(ن-morpholino) اثانيسولفونيك حمض (MES) (pH 5.0)، باستخدام وحدة تخزين متساوية من حبات مغناطيسية (100 ميليلتر) بيبيتيد خارج القنينة، لمدة 10 دقيقة مع خلط جيدة (أكثر من النهاية أو ما شابه).
   2. فورا قبل الاستخدام، إعداد 50 ملغ/مل من 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) كاربودييميدي هيدروكلوريد (EDC) الحل مع مس (pH 5.0) الباردة 25 مم.
   3. فورا قبل الاستخدام، إعداد 50 ملغ/مل من محلول N-هيدروكسيسوكسينيميدي (NHS) مع مس (pH 5.0) الباردة 25 مم.
   4. مزيج 100 ميليلتر من حل المؤسسة و 100 ميليلتر من الحل الصحي مع الخرز غسلها واحتضان مدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع تناوب إمالة بطيئة.
   5. وضعت الأنبوب على مغناطيس لمدة 4 دقائق بعد الاحتضان وتجاهل المادة طافية، وتغسل حبات مرتين مع 100 ميليلتر من مس (pH 5.0) الباردة 25 مم.
   6. احتضان 6 ميليلتر من الحل الأسهم 100 مم دبة-NH₂ و 25 مم مس (pH 5.0، 290 ميليلتر) مع الخرز تنشيط إطار تناوب على الأقل 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أو ح 2 في 4 درجات مئوية، مع تناوب إمالة بطيء 5 لفة في الدقيقة.
   7. وضع الأنبوب على المغناطيس لمدة 4 دقائق بعد الاحتضان وتجاهل المادة طافية. تغسل حبات مغلفة 4 مرات وريسوسبيند الخرز مع 200 ميليلتر PAE ملزمة المخزن ومخزن في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
3. جمع منحنى المعايرة لتحديد ك_د.
   1. إعداد مجموعة من الحلول دبة-1 (500 ميليلتر) بتركيزات مختلفة في المخزن المؤقت لربط ملحق العنوان الفعلي من 01:00 م إلى 300 نانومتر.
   2. إضافة 10 ميليلتر من دبة-NH₂-المغلفة المغناطيسي الخرز كما هو موضح في قسم 5.2.7 لكل حل دبة-1. احتضانها ح 1 في درجة حرارة الغرفة بالتناوب.
   3. ضع الأنابيب في مغناطيس لدقيقة 4 وإزالة المادة طافية. أغسل حبات 4 مرات استخدام 200 ميليلتر من المخزن المؤقت ملزم PAE.
   4. إضافة 60 ميليلتر من المخزن المؤقت لربط ملحق العنوان الفعلي لكل أنبوبة. احتضان هذه الأنابيب عند 95 درجة مئوية عن 15 دقيقة جمع المادة طافية المحتوية على التيد دبة-1 من الفصل المغناطيسي. كرر هذه العملية شطف لاسترداد منضم أكثر دبة-1.
   5. تمييع الحل الوتي معززات وتأخذ 3 ميليلتر قبكر في الوقت الحقيقي. إعداد رد فعل قبكر على النحو التالي: 3 ميليلتر من المياه خالية من رناسي، ميليلتر 2 من كل 10 ميكرون التمهيدي (FP، ص₄-RP، نمول 0.01 كل) 3 ميليلتر من الوتيد وتضعف دبة-1 وممزوجة مسبقاً 10 ميليلتر من رد فعل مزيج يحتوي على دنتبس وبوليميراز x PCR 2 رد فعل المخزن المؤقت.
   6. تحديد أرقام دبة-1 في كل عينة عن طريق تشغيل قبكر باستخدام cycler حرارية مع الإعدادات التالية: 1 دورة 95 درجة مئوية، 30 ثانية؛ 30 دورات من [95 درجة مئوية، 30 s; 45 درجة مئوية، 30 s; 72 درجة مئوية، 30 s]؛ 1 دورة 72 درجة مئوية، 30 ثانية وعقد في 4 درجات مئوية.
   7. ارسم منحنى المعايرة وتحديد ك_د بغير الخطية ملائمة منحنى افتراض نسبة 1:1 ربط²⁷.

6-النسبي تقارب وخصوصية اختبار من الاختبارات التنافسية

1. إضافة 10 ميليلتر من دبة-NH₂-المغلفة الخرز المغناطيسي لحل دبة-1 (500 ميليلتر، 1 ميكرومتر). احتضانها ح 1 في درجة حرارة الغرفة بالتناوب. ضع الأنابيب في مغناطيس لدقيقة 4 وإزالة المادة طافية. أغسل حبات 4 مرات استخدام 200 ميليلتر من المخزن المؤقت ملزم PAE وريسوسبيند أنه في 10 ميليلتر من المخزن المؤقت ملزم PAE.
2. إضافة 10 ميليلتر من دبة-NH₂-منضم متوسطة المغلفة مع دبة-1 إلى 110 ميليلتر من كل 10 ميكرون اختبار العينة (دبة-NH₂، دبة، DEHP، بوتيل البنزيل phthalate(BBP) وأيونات المعادن الثقيلة، إلخ.) احتضان في درجة حرارة الغرفة حاء 1 جمع المادة طافية بالفصل المغناطيسي.
3. تمييع المادة طافية معززات وتأخذ 3 ميليلتر للقياس الكمي qPCR. إعداد رد فعل قبكر على النحو التالي: 3 ميليلتر من المياه خالية من رناسي، ميليلتر 2 من كل 10 ميكرون التمهيدي (FP، ص₄-RP، نمول 0.01 كل) 3 ميليلتر من التيد وتضعف دبة-1 وممزوجة مسبقاً 10 ميليلتر من رد فعل مزيج يحتوي على دنتبس وبوليميراز x PCR 2 رد فعل المخزن المؤقت.
4. تحديد أرقام دبة-1 في كل عينة عن طريق تشغيل قبكر باستخدام cycler حرارية مع الإعدادات التالية: 1 دورة 95 درجة مئوية، 30 ثانية؛ 30 دورات من [95 درجة مئوية، 30 s; 45 درجة مئوية، 30 s; 72 درجة مئوية، 30 s]؛ 1 دورة 72 درجة مئوية، 30 ثانية وعقد في 4 درجات مئوية.
5. حساب تقارب النسبي بقسمة عدد دبة-1 الصادرة عن العدد من دبة-1 أطلق سراحه من الخرز في المخزن المؤقت ملزم PAE من الخرز حضور العينة: تقارب النسبي = N_عينة/N_{المخزن المؤقت}.

7-تصنيع والقياسات الكهروكيميائية لأجهزة الاستشعار الكهروكيميائية DEHP

1. تجميع التسلسل الأساسي ثيولاتيد (HS-دبة-1) والتحقيق إرسال الإشارات (دبة-1-ج-إف سي) باستخدام الكيمياء فوسفوراميديتي القياسية وتنقية حسب معيار [هبلك].
   النظام المنسق-دبة-1:5 '--النظام المنسق-(الفصل₂)₆-كتتكتجتككتككجتكاكاتكككاكجكاتكتككاكات-3'
   دبة-1-ج-Fc: 5 '--جاتجتجاكجاجتتتتتتت--(الفصل₂)₆إف سي-3'
   ملاحظة: وصف التصميم العقلاني لمجسات استشعار في أعمالنا السابقة^18،ببوليكيشنز²².
2. إعادة تشكيل النظام المنسق-دبة-1 وأفرجا-1-ج-Fc في المياه خالية من نوكلاس الصف في 100 ميكرومتر، الكوة، وتخزينها في-20 أو-80 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنة واحدة.
3. البولندية مسرى الذهب بعناية على سطح مرآة تشبه مع 1 و 0.3 و 0.05 ميكرومتر Al₂O₃ مسحوق في ميكروكلوث لمدة 5 دقائق و sonicate أنه في الماء عالي النقاوة لمدة 5 دقائق لإزالة بقايا Al₂O₃. ثم قم بتنظيف مسرى التلميع الكهروكيميائية مع 35 بمسح فولتاميتري دوري متتالية (CV) من 0.4 إلى + 1.2 V (مقابل الزئبق Hg₂هكذا₄) في 0.5 م ح₂هكذا₄ في 100 mV/s.
4. إعداد خليط من 0.5 ميكرومتر HS-دبة-1 و 0.5 ميكرومتر دبة-1-ج-Fc في 100 ميليلتر 10 ملم الفوسفات مخزن يحتوي على كلوريد الصوديوم م 1، درجة الحموضة 7.4 (PBS). حرارة الخليط في أنبوب الطرد المركزي رقيقة الجدار في مجموعة حمام المياه عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، وبطء تبريد الخليط في درجة حرارة الغرفة.
5. أضف 1 ميليلتر تريس-(2-carboxyethyl)-الفوسفين هيدروكلوريد (تسيب، 10 مم، وحل الأسهم) إلى الخليط. الحفاظ على درجة حرارة الغرفة ح 1.
6. تزج مسرى تنظيف الذهب في الحل أعلاه ح 12، أو بين ليلة وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
7. شطف مسرى مع برنامج تلفزيوني وتزج مسرى في 1 مم [S (الفصل₂)₂(أوتش₂CH₂)₆أوتش₃]₂ (HS-على سبيل المثال₆-OMe) في برنامج تلفزيوني حاء 1 شطف مسرى دقيق باستخدام ملحق العنوان الفعلي ربط المخزن المؤقت وتزج مسرى في المخزن المؤقت لربط ملحق العنوان الفعلي.
8. أن تفحص خلفية مربع موجه فولتاميتري (SWV) في المخزن المؤقت ملزم PAE خالية من الهدف.
   1. تنظيف جميع المعدات التجريبية: الخلايا الكهرلية والذهب العامل القطب والقطب العداد البلاتين والقطب مرجع كالومل المشبعة (SCE).
   2. تنشيط البرامج المثبتة؛ تعيين معلمات التجريبية للقياسات SWV.
      ملاحظة: تم استخدام المعلمات التالية تجريبية لتجارب SWV: نطاق المحتملة: من-0.2 إلى 0.7 V؛ تعديل السعة: 25 أم؛ نبض العرض: 5 مللي ثانية؛ تفحص معدل: mV 50/ثانية؛ الخطوة المحتملة: 1 أم.
   3. الاتصال الذهب يعمل القطب، والقطب العداد البلاتين، ولجنة الخبراء الدائمة بوتينتيوستات، ووضع هذه الأقطاب الثلاثة في خلية كهروكيميائية تتضمن PAE ملزمة المخزن المؤقت.
   4. تشغيل القياس SWV.
      ملاحظة: مرة واحدة أن يبدأ قياس SWV، منحنى SWV سيتم عرضها على شاشة الكمبيوتر. يتم تكرار الفحص حتى يتم التفحص المستمر ويلاحظ أي تغييرات في ذروة الارتفاع أو الشكل.
9. تزج الكهربائي العامل في المخزن المؤقت ملزم PAE التي تحتوي على نسبة معينة من DEHP (مثلاً، 10:00 م) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. شطف مسرى دقيق باستخدام المخزن المؤقت ملزم PAE وتزج مسرى في المخزن المؤقت لربط ملحق العنوان الفعلي مع العداد الكهربائي ولجنة الخبراء الدائمة. جمع المنحنى SWV تحت نفس الشرط كما هو موضح في المقطع 7.8.
10. كرر الخطوة 7.9، إلا أن تركيز DEHP (مثلاً 100 م, 1 نانومتر، 10 نانومتر، 100 نانومتر، 1 ميكرومتر) زيدت تسلسلياً. رسم منحنى المعايرة.
11. اختبارات خصوصية: كرر الخطوات من 7.3-7.9، فيما عدا أنه يتم استبدال ربط PAE المخزن المؤقت الذي يحتوي على DEHP ملزم PAE المخزن المؤقت الذي يحتوي على مضمون التدخل المحتملة في تركيز المطلوب.

نحن تصميم وتوليفها فثالات والفثالات المجموعة الأمينية فونكتيوناليزيد (دبة-NH₂) كهدف الربط (الشكل 1F). ثم أجرينا التحديد ابتمر الحمض النووي لايس استخدام دبة-NH₂ كهدف الربط واتباع أسلوب المستندة إلى تجميد الهدف الكلاسيكي (الشكل 2). في كل جولة، أجرى بكر تجريبية باستخدام الصفحة التشويه والتحريف لتحسين عدد دورة بكر (الشكل 3). الصفحة التشويه والتحريف، بدلاً من الصفحة الأصلية، ويقترح بشدة لأن نحن والزملاء الآخرين وجدت أن المنتجات الثانوية يشتبه في الوزن الجزيئي عالية على المواد الهلامية الأصلية في إعداد دورة أعلى هي فعلا crosslinking المجمعات التي شكلتها تسلسل الحجم الصحيح. وهكذا، يمكن حقاً تعكس كثافة الفرقة الصفحة التشويه والتحريف كمية المنتج المناسب. جيل الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل واحد خطوة حاسمة أخرى، والعديد من الأساليب لهذه الخطوة قد تم الإبلاغ عن²⁸. طريقة الهضم [ااكسونوكلس] λ هي أرخص طريقة. يمكن التحقق من نجاح توليد الحمض النووي واحد-الذين تقطعت بهم السبل مريح بالصفحة الأصلية، حيث يتم عرض المنتج PCR كواحدة (الأولى عدة جولات من سيليكس) أو متعددة العصابات، بينما يظهر شريط واحد فقط بعد عملية الهضم (الشكل 4).

وأوقف سيليكس بعد الجولة الخامسة من التحديد بسبب كمية كبيرة من الحمض النووي المتراكمة في الجزء العلوي من الصفحة، حتى بعد العلاج تمسخ (حيث يتم تسخينها السلطات الوطنية المعينة في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في اليوريا 8.3 م × TBE – يحتوي على 2) ، الذي اقترح الخطيرة العابرة للربط بين السلطات الوطنية المعينة، وأشارت أيضا إلى أنه تم إثراء في التسلسل. لذلك، أرسل تجمع₄ لأن التسلسل الفائق. وأظهرت نتائج الفائق أن 100 الأعلى أكثر تكراراً متواليات كانت شديدة المحافظة وهم من أسرة واحدة. التسلسل الأعلى دبة-1 عرض انجذاب nanomolar (الشكل 5)، وخصوصية مجموعة جيدة لمتجانسات ملحق العنوان الفعلي (دبة، المنافع، DEHP) (الشكل 6) عن طريق فحوصات qPCR مريحة، كما هو موضح في قسم البروتوكول.

دبة-1 قد استخدمت لبناء حبلا من المستندة إلى النزوح من أبتاسينور الكهروكيميائية تبعاً لذلك لأننا سبق الإبلاغ عنها العمل²⁹. استشعار DEHP الاستجابة حس مرهف وانتقائية إلى DEHP (الشكل 7). الملوثات البيئية الشائعة مثل أيونات المعادن الثقيلة والمضادات الحيوية، والجزيئات الصغيرة ذات مجموعات وظيفية مماثلة أظهرت استجابة ضعيفة للغاية دبة-1.

الشكل 1: الهياكل الكيميائية لايس (أ)، (ب) المنافع، "افرجا" (ج)، (د) DEHP، (ه) 4-أوه-DEHP، (و) DBP−NH₂- وقد أعيد طبع هذا الرقم بإذن من Y. هان et al. ²² الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 2: الحمض النووي الخاصة بمجموعة إجراءات اختيار ابتمر لايس استخدام دبة-NH₂ كهدف ربط. وقد أعيد طبع هذا الرقم بإذن من Y. هان et al. ²² الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3: الممثل نتيجة PCR دورة الأمثل باستخدام صفحة التشويه والتحريف. من اليسار إلى اليمين، تمثل الحارات: bp 20 الحمض النووي سلم القياسية ودورات 15 (أي قالب الحمض النووي) ودورات 20 (أي قالب الحمض النووي)، 25 دورات (أي قالب الحمض النووي)، ودورات 30 (أي قالب الحمض النووي)، دورات 15، دورات 20، 25 دورات ودورات 30. ولوحظت الظروف المثلى في دورات 25، الفرقة منتج واحد فيها بكثافة عالية دون الجانبية غير المرغوب فيها، وعلاوة على ذلك، لوحظ لا الفرقة في عنصر التحكم فارغة المقابلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4: الاستفادة المثلى من λ [ااكسونوكلس] كرد فعل لهضم حبلا فوسفوريلاتيد استخدام الصفحة الأصلية- من اليسار إلى اليمين، تمثل الحارات: 20 معيار سلم الحمض النووي bp وسلبية (لا λ [ااكسونوكلس])، 2U، 5U، 8U، و 10U. ولوحظ الحد الأدنى من كمية الإنزيم في 2U، حيث يصبح المنتج بكر مزدوجة واحدة-الذين تقطعت بهم السبل المعينة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الرقم 5: قياسات تقارب دبة-1 بواسطة الاختبارات المستندة إلى قبكر- وحسبت الخطأ (الانحراف المعياري SD) ك_د لمن القياسات الثلاثة من نفس العينة. وقد أعيد طبع هذا الرقم بإذن من Y. هان et al. ²²

الشكل 6: قياسات تقارب نسبي دبة-1 الحرة دبة-NH₂ (10 ميكرومتر)، افرجا (10 ميكرومتر)، DEHP (10 ميكرومتر)، المنافع (10 ميكرومتر)، وخلات الإيثيل (10 ميكرون) وحمض البنزويك (10 ميكرون) وحمض فثاليك (10 ميكرون)، والأخرى عن طريق فحوصات المنافسة. الأخرى: خليط تدخلات المحتملة (الجلوكوز، كاناميسين، الأمبيسلّين والإيثانول) كلها في 10 ميكرون. وحسبت النسبة (تقارب النسبي) بقسمة عدد الابتامرات صدر من الخرز حضور العينة بعدد الابتامرات صدر من الخرز في المخزن المؤقت ملزم PAE. تمثل الأشرطة يعني ± التنمية المستدامة. الحزب الديمقراطي الصربي حسبت من القياسات الفردية الثلاث. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الرقم 7: biosensor DEHP الكهروكيميائية للكشف عن أولتراسينسيتيفي وأولتراسيليكتيفي من DEHP: إليه (A)، SWV المنحنيات (ب)، منحنى المعايرة (ج)، والاختبارات الانتقائية (د)- وحسبت الأخطاء (الحزب الديمقراطي الصربي) من القياسات الفردية الثلاث. وقد أعيد طبع هذا الرقم بإذن من Y. هان et al. ²² الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

فائدة المعلقة واحد من الابتامرات أن تحديدها من خلال الأسلوب في المختبر سيليكس، بينما الأجسام المضادة يتم إنشاؤها عن طريق إيمونوريكشنز في فيفو . ولذلك، يمكن تحديد الابتامرات مع الهدف المنشود خصوصية ظروف تجريبية مصممة تصميماً جيدا، بينما الأجسام المضادة تقتصر على الظروف الفسيولوجية.

لتسهيل فصل تسلسل منضم من تسلسل الحرة، سيليكس تعديل عدة ذكرت في الآونة الأخيرة، التفريد الشعرية³⁰، ميكروفلويديكس³¹والمغناطيسية/اﻷكريليك الخرز/الخرز [اغروس]¹⁴، إلخ، قد حلت محل المرشحات النيتروسليلوز أو أعمدة النسب لتحقيق الانفصال أكثر كفاءة. بين هذه التقنيات، الأساليب المستندة إلى حبة قد الأكثر استخدمت على نطاق واسع لاختيار ابتمر الأهداف جزيء صغير بسبب بسيط على المتابعة، وعملية سهلة، ويجري قابلة لتحليلات جزيء صغير.

هناك مجموعتان من الأساليب التي تستخدم عادة لاختيار الأهداف الصغيرة جزيء ابتمر: الهدف¹³ ومكتبة¹⁴ المستندة إلى تجميد الأساليب. في المجموعة السابقة من أساليب، هي معطلة الأهداف جزيء صغير في المرحلة الصلبة مثل الخرز المغناطيسي فونكتيوناليزيد أو الخرز [اغروس] عن طريق اقتران التساهمية ردود الفعل. المكتبات هي المحتضنة مع جزيء صغير المغلفة الخرز، وتتم إزالة تلك متواليات لا ربط أو ربط ضعيف إلى الهدف في المرحلة الصلبة ببساطة عن طريق القيام بالغسيل والطرد المركزي أو خطوات الفصل المغناطيسي. لاحقاً تسلسل منضم التيد وتضخيمه ببكر. الأهداف جزيء الصغيرة التي يجب أن يكون لديك واحد على الأقل من المجموعة الوظيفية المتاحة لرد فعل اقتران. للذين لا يملكون المجموعات الوظيفية المناسبة، قد المجموعة الوظيفية التي ستدرج في الهدف الأصلي من خلال التوليف العضوي. توليف للهدف مصممة بعناية يمكن أن تنطوي على خطوات متعددة، وفي بعض الأحيان هو تحد كبير، وكذلك. يمكن أن يؤثر التعديل الهيكلي الأهداف أيضا بشدة على مواقع الربط وتقارب مع بهم الابتامرات. لتجنب هذه المشاكل، تم تطوير الأساليب المستندة إلى تجميد مكتبة، حيث المكتبة هو تهجين مكملة التقاط الحمض النووي يسبر على الخرز المغناطيسية، وتسلسل الملزمة التي تقع قبالة الخرز عند الربط مع الأهداف. في هذه المجموعة من أساليب، الأهداف التي تتم إضافتها في المخزن المؤقت ملزم ولا المجموعات الوظيفية المطلوبة. آيس هي مشتقات إستر حامض الفثالات و PAE نموذجي يتكون من مجموعة إستر حامض فثالات وواحد أو اثنين من سلاسل الألكيل (الشكل 1A-د). وقد آيس لا المجموعات الوظيفية المتاحة لتجميد المرحلة الصلبة. وهكذا، الأساليب المستندة إلى تجميد مكتبة تبدو أكثر جاذبية لاختيار ابتمر آيس.

حالة تشتت التي تسيطر عليها جيدا أمر حاسم لضمان إثراء المكتبة عن طريق سيليكس المرجوة. ولكن آيس مسعور جداً وسهولة تشكيل المجاميع في المحاليل بتركيز أعلى من ميكرومتر عدة، حتى في وجود التوتر السطحي متعددة لتسهيل انتشارها. وبالتالي، حالة التشتت آيس من الصعب السيطرة، وأنه سيكون من الصعب تحديد الابتامرات التي تربط جزيئات PAE الفردية على وجه التحديد. لحل مشكلة الذوبان، تم اختيار أساليب التثبيت الهدف، بايس التي كانت معطلة على الخرز ماء عن طريق الترابط التساهمي. باستخدام هذه الاستراتيجية التثبيت، يجب أن تكون الأهداف المهيمن الحالي على سطح حبة في دولة جزيئية واحدة، بدلاً من المجاميع.

التصميم الهيكلي لهدف الربط أيضا حرجة للغاية لنجاح اختيار الابتامرات الخاصة بالمجموعة. هناك ثلاثة عوامل يجب أن تؤخذ للتصميم الهيكلي. العامل الأول هو أن غرض اختيار ابتمر. ونظرا للغرض من تحديد الابتامرات الخاصة بالمجموعة، من الضروري كشف الفريق المشترك لايس لربط ابتمر ومنع بقية الأجزاء من المشاركة في التوثيق ابتمر. وهكذا، ينبغي إدخال مجموعة وظيفية على المحطة الطرفية للسلسلة الجانبية. بداية، نحن المصممة فونكتيوناليزيد يا DEHP (4-OH−DEHP) (الشكل 1E) كهدف الربط والمعطل تداولها على الخرز المغناطيسي حمض الكربوكسيلية¹⁶. وهكذا تعرضت سلاسل الألكيل على السطح للمصفوفة. لقد حاولنا أن اختيار حبات مغناطيسية مع مجموعات الكربوكسيل المصفوفة الصلبة. لم يحدث تحسن واضح تقارب لوحظ بعد خمس جولات من التحديد، وامتصاص غير محدد المصفوفة العارية أبقى قوية.

ولذلك، صمم دبة-NH₂ في وقت لاحق استناداً إلى الأفكار التالية: (1) مجموعة فثالات أكثر احتمالاً للتعامل على وجه التحديد مع ابتمر عن طريق المكدس π-π والسندات الهيدروجين من سلسلة الألكيل؛ (2) دائرة الصحة الوطنية بوساطة كاربودييميدي رد فعل معتدل ولديه من كفاءة اقتران فعالة جداً، حيث قدم-NH₂ في نهاية سلسلة الألكيل من دبة؛ (3) فإنه من السهل أن تعمل مع الخرز المغناطيسي كقسم مرحلة صلبة، لكن قوي الامتزاز غير محدد من المكتبة. على الرغم من فقدان الخرز [اغروس] أثناء فصل أعلى من الخرز المغناطيسي، الامتزاز غير محدد من المكتبة أقل بكثير. وهكذا، افرجا-NH₂ كانت معطلة في الخرز [اغروس] تنشيط الإيبوكسي، وتعرضت المجموعة أسيديستير الافثاليك على سطح المصفوفة.

اختيار التحديد المخزن المؤقت الهامة، خاصة بالنسبة لأهداف جزيء صغير مع الذوبان المتنوعة. المخزن المؤقت ملزم يجب أن يكون أعدت بعناية تجنب تجميع وضمان حالة تشتت جيدة من الملوثات العضوية الثابتة أثناء عملية الاختيار والتوصيف ابتمر كله. في هذه الدراسة، وجدنا أن DEHP لا تذوب في المخازن العادية دون التوتر السطحي، عرض اثنين من طبقات متميزة. الطبقة يختفي عند إضافة للتوتر السطحي متعددة في كمية الأمثل. الحلول واضحة تحتاج إلى تخزينها في درجات حرارة أعلى من 20 درجة مئوية الحفاظ على مركزها. وترد التفاصيل في البروتوكول خطوة 3.1.

جيل الحمض النووي واحد-الذين تقطعت بهم السبل من منتجات PCR مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل خطوة حاسمة في عملية سيليكس. وقد وصف عدة أساليب مختلفة حاليا في الأدب^32،33، بما في ذلك الهضم [ااكسونوكلس] λ والفاصل المغناطيسي مع الخرز المغلفة streptavidin، بكر غير متماثل وحجم الفصل يشوه هلام اليوريا-polyacrylamide.

الأساليب المختلفة ونقاط القوة والضعف الخاصة بها. حاليا، هو الأسلوب الأكثر شيوعاً لتوليد ssDNA الفاصل المغناطيسي مع الخرز المغلفة ستريبتافيدين. المعلقة وميزة هذا الأسلوب هو عملها توفير الوقت وبسيطة. والعيب هو ارتفاع تكلفتها مقارنة بالأساليب الأخرى. وفي المقابل، الأسلوب القائم على الفصل بين الحجم، استخدام أجهزة الإشعال عكس مع الهيكل الجذعية – حلقة GC الغنية، واحدة من أرخص الطرق، بينما محصول واحد-الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي هو الأقل بين هذه الأساليب³². في هذا البروتوكول، وصفت لنا استخدام الهضم [ااكسونوكلس] λ لتوليد الحمض النووي واحد-الذين تقطعت بهم السبل، والذي أحد أساليب أرخص. وجدنا أن العائد من الحمض النووي واحد-الذين تقطعت بهم السبل يمكن مقارنتها بطريقتين لفصل المغناطيسية والخرز المغلفة ستريبتافيدين. وعلاوة على ذلك، نجد أن رد فعل [ااكسونوكلس] قد أعاقت بتركيزات عالية من الملح. الهضم غير مكتملة من المنتج بكر ذكرت في الأدبيات³³ على الأرجح سبب الكثير الملح الموجودة في المنتج PCR. وبالإضافة إلى ذلك، λ [ااكسونوكلس] نشطة للغاية وغير مكلفة (الشكل 4).

توصيف والتحقق من الابتامرات شاقة وتستغرق وقتاً طويلاً، ويجسد عقبة رئيسية في خط أنابيب اكتشاف ابتمر³³. معظم التقنيات هي الأساليب المراعية للكتلة التي تعمل جيدا للشركاء ملزمة ابتمر الأكبر (> 10,000 اتحاد المغرب العربي)، ولكن ليست حساسة بما فيه الكفاية لقياس التفاعلات مع أهداف الوزن الجزيئي المنخفض (< 1,000 اتحاد المغرب العربي)¹⁵. توصيف والتحقق من الابتامرات مسعور الجزيئات الصغيرة مثل آيس حتى أكثر صعوبة. على الذوبان في الماء الفقراء يؤدي تحتوي منحنى المعايرة، الذي يمنع ك_دللتصميم في الحل أو يشل الابتامرات على السطح. ولذلك، عقدنا العزم ق_د كمن الابتامرات المحددة حسب تسلسل إنتاجية عالية بشل دبة-NH₂ على الخرز المغناطيسي ماء لتجنب مشكلة القابلية للذوبان. الصلات النسبية والانتقائية في الابتامرات لايس الأخرى ثم تحددها الاختبارات التنافسية، حيث كان يحدها المرشحين ابتمر مسبقاً إلى دبة-NH₂ تعلق الخرز المغناطيسي وصدر للمادة طافية على الحضانة آيس تم اختبارها أو مواد أخرى يحتمل أن التدخل. تم تطبيق التحليل التنافسي لأنها تتيح مقارنة السطحية تقارب بين آيس أن كان لا من المجموعات الوظيفية للتثبيت السطحي. وباﻹضافة إلى ذلك، فحوصات الفلورسنت المغناطيسي على أساس حبة مناسبة لدراسة تقارب ابتمر جزيء صغير التفاعلات³⁴. ومع ذلك، وجدنا أن الخرز المغناطيسي تسبب أحياناً fluorescence تبريد لأسباب غير معروفة. وهكذا، استخدمت فحوصات qPCR لتقارب القياسات.

نصيحة تقنية حاسمة واحدة ل biosensor الكهروكيميائية الموصوفة في هذه الدراسة هو تخميل سطح القطب³⁵. نتيجة hydrophobicity عالية من DEHP، لديها ميل قوي لاستيعاب نونسبيسيفيكالي على مسرى الذهب، مما يؤدي إلى عدم الكشف عن. الأكثر شيوعاً تستخدم عامل التخميل السطحية، 6-ميركاتو-1-هيكسانول (صحة الأم والطفل)^36،37، ليست كافية لمنع امتصاص غير محدد DEHP، بينما نجد أن النظام المنسق (الفصل₂)-₂-[أوتش₂CH₂ ]₆-أوتش₃ كانت فعالة بشكل كاف لتمكين الكشف عن حساسية DEHP³⁸.

يصف هذا الإجراء على بروتوكول لتحديد الابتامرات الحمض النووي الخاصة بمجموعة من الجزيئات الصغيرة جداً مسعور وتطبيق ابتمر المحدد في biosensor الكهروكيميائية. البروتوكول يساعد بتحديد الجزيئات الصغيرة الأخرى مسعور ويقدم أفكاراً التنمية استشعار الجزيئات الصغيرة جداً مسعور كذلك. عملية اختيار ابتمر ينتمي إلى الفئة المستهدفة الأساليب المستندة إلى التثبيت. وتوجد أيضا القيود المفروضة على هذا النوع من الأسلوب لهذا البروتوكول، على سبيل المثال الحاجة إلى توليف معقدة لربط الأهداف والآثار المترتبة المرحلة الصلبة في ربط ابتمر. وتشمل مزايا جذابة من أجهزة الاستشعار الكهروكيميائية الموصوفة في هذا البروتوكول تصميم بسيط وحساسية عالية. العيب الرئيسي هو دقتها محدودة بسبب مداها الحيوي واسع للغاية. ولذلك، هذه الأجهزة الموضحة هنا أكثر ملاءمة لفحص الاختبارات، بدلاً من القياسات الكمية للأهداف.

الكتاب يعلن أي مصلحة مالية المتنافسة.

ونحن ممتنون للدعم المالي من "مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية" (21675112)، المشاريع الرئيسية لخطة لجنة التعليم ببكين (KZ201710028027) ويانجينغ الشباب الباحث البرنامج من رأس المال الطبيعي جامعة العلوم والتكنولوجيا.