Method Article
هذا البروتوكول يوضح الفئران العزلة جزيرة والبذر على سقالة ديسيلولاريزد. تم زرع الجزر التي تدعم سقالة في لوحة الدهون البربخ من ستريبتوزوتوسين (ستز) التي يسببها الفئران السكري. نجت الجزر في موقع الزرع وعكست حالة فرط سكر الدم.
وقد ثبت سريريا زرع جزيرة لتكون فعالة في علاج مرض السكري من النوع 1. ومع ذلك، فإن استراتيجية زرع داخل الكبد الحالية قد تتسبب في ردود فعل الدم كلها حادة ويؤدي إلى سوء إنغرافتمنت جزيرة. هنا، ونحن الإبلاغ عن بروتوكول قوي لزرع الجزر في موقع زرع خارج الكبد - لوحة الدهون البربخ (إف) - في نموذج الفأر السكري. تم وصف بروتوكول لعزل وتنقية الجزر في الغلة العالية من الفئران C57BL / 6J، وكذلك طريقة زرع يؤديها البذر الجزر على سقالة ديسيلولاريزد (دسس) وزرعها في موقع إف في الفئران C57BL / 6J سينجينيك المقدمة السكري بواسطة ستريبتوزوتوسين. الكسب غير المشروع دسس يحتوي على 500 الجزر عكس حالة فرط سكر الدم في غضون 10 يوما، في حين أن الجزر الحرة دون دسس المطلوبة 30 يوما على الأقل. تم الحفاظ على نقص سكر الدم لمدة تصل إلى 3 أشهر حتى تم الكشف عن الكسب غير المشروع. في الختام، دسس تعزيز إنغرافتمنت من الجزر في tموقع خارج الكبد من إف، والتي يمكن بسهولة استرجاعها ويمكن أن توفر منصة استنساخه ومفيدة للتحقيق في المواد سقالة، فضلا عن غيرها من المعلمات زرع المطلوبة ل إنغرافتمنت جزيرة ناجحة.
داء السكري من النوع 1 (T1D) هو اضطراب الغدد الصماء المناعي الذاتي الذي يتم طرد خلايا الجزيرة من الجهاز المناعي، مما يجعل المرضى يعتمدون على حقن الأنسولين الخارجي لحياتهم كلها. ويمثل بروتوكول ادمونتون معلما بارزا في الدراسات السريرية لزرع الجزر. تم غرس الجزر من خلال الوريد البابي وزرعها في موقع داخل الكبد 1 . ومع ذلك، اثنين من العقبات الرئيسية - مصادر غير كافية من الجزر المانحة والجزيرة إنغرافتمنت الفقراء - منع نجاح واسع من زرع جزيرة 2 . عادة، الجزر تحتاج إلى جمعها من ثلاثة المانحين الجاد لعكس حالة فرط سكر الدم من مريض واحد. وهذا يرجع إلى انخفاض العائد من إجراءات العزلة جزيرة وفقدان جزيرة بعد زرع. على وجه الخصوص، على الرغم من أن ما بعد الزرع الجزر استحم في الدم الغنية بالأكسجين، والاتصال المباشر مع الدم في كثير من الأحيان أثارت لحظة اللثة بوساطة الدم(إبير)، والتي يمكن أن تسبب فقدان حاد في الجزر. على المدى الطويل، ويعتقد أن الخسارة التدريجية للجزر في المرضى تمثل انخفاض معدلات داء السكري في المجموعات السريرية، والتي يمكن أن تصل إلى 90٪ في السنة الأولى وانخفضت إلى 30٪ و 10٪ بنسبة 2 و 5 سنوات بعد الزرع، على التوالي 3 .
كان زرع جزيرة في مواقع خارج الكبد استراتيجية جذابة للحد من اتصال مباشر من الجزر مع الدم في حين حصر عمليات زرع إلى مواقع أكثر تحديدا مقارنة مع التسريب داخل الكبد. وقد أجريت دراسات في كبسولة الكلى والعين والعضلات، وسادات الدهون، والمساحات تحت الجلد على مدى السنوات الماضية، والتي تبين أن الجزر في هذه المواقع هي قادرة على البقاء على قيد الحياة وظيفة لاستعادة نورموجليسيميا 4 . وبالإضافة إلى ذلك، الجزر في هذه المواقع يمكن استرجاعها، مما يجعل من الممكن خزعة أو حتى لمزيد من إجراءات الاستبدال. خارج الكبد sوبالتالي فإنه يدل على إمكانات كبيرة للزرع السريري 5 .
وقد تم التحقيق بشكل مكثف السقالات القائمة على المواد البيولوجية لزرع الخلايا وهندسة الأنسجة. وعادة ما تحتوي السقالات ثلاثية الأبعاد (3D) على هياكل مسامية ويمكن أن تستخدم كقوالب خلوية لتوليد الهيكل المكاني / تنظيم الخلايا أو كخزانات لتوفير الإطلاق الخاضع للرقابة للإشارات النشطة بيولوجيا. كما تم ملفقة السقالات من المواد البوليمرية، مثل بولي (جليكوليد L- لاكتيد) 6 ، بولي (ديميثيلزيلوكسان) 7 ، والبولي بالحرارة (يوريتان) 8 ، لزرع الجزر في إف. بالمقارنة مع زرع الجزر مباشرة، تم العثور على استخدام السقالات للحد من فقدان جزيرة عن طريق منع تسرب الجزر في تجويف داخل الصفاق 9 ، 10 ، وتوفير الحماية الميكانيكية ومودوواللاتينغ رد فعل التهابات المحلي. وبالتالي يمكن تطوير السقالات لتعزيز جزيرة إنغرافتمنت في مواقع زرع 7 .
في هذه الدراسة، ونحن نعتزم إظهار نموذج زرع جزيرة في إف، التي أجريت في نماذج الفئران باستخدام دسس. وقد جذبت السقالات المستمدة من المصفوفات خارج الخلية اهتماما كبيرا في السنوات الأخيرة بسبب التوافق مع متفوقة والهياكل التي يسهل اختراقها أكثر طبيعية مقارنة مع المنتجات الاصطناعية. هنا، نحن تصف بروتوكول عزل قوي للحصول على الجزر البنكرياس في عوائد عالية من الفئران C57BL / 6J. ثم تم فرز دسس معالجتها من التامور البقري مع الجزر، وتم زرع الطعوم إلى إف في نماذج السكري متجانسة. تم تحقيق نقص السكر في الدم في الفئران في غضون 10 أيام، وتم الحفاظ عليه لمدة تصل إلى 100 يوما، حتى إزالة الطعوم.
تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل جامعة بكين المؤسسية رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام (إاكوك، إاكوك رقم سو-لوي-1).
1. عزل العزلة
الشكل 1: صور تظهر قنية القناة الصفراوية ونضح البنكرياس مع حلول كولاجيناز. ( A1 ) سحب الاثني عشر حتى القناة الصفراوية مشدود. (أمبولة: المثلث، منطقة حليبي على سطح الاثني عشر؛ القناة الصفراوية: هيكل حليبي تشبه الحبل على السطح). ( B1 ) إدراج الإبرة في القناة الصفراوية من أمبولة. ( C1 ) تضخيم البنكرياس مع حقن الانزيم. ( A2، B2، C2 ) صور الكرتون للإجراءات المعروضة في A1، B1، و C1، على التوالي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
س: المحافظة على together.within الصفحات = "1">
الشكل 2: استكشاف الأخطاء وإصلاحها للقنية. ( A1 ) طرف إبرة إدراجها في التجويف من القناة الصفراوية. ( A2 ) القناة مليئة حلول الانزيم. ( B1 ) إبرة إدراجها في تجويف القناة الصفراوية، والقناة مليئة صبغة زرقاء. ( B2 ) بسبب القنية غير مناسب، والإبرة تحت القناة الصفراوية، وفقط كبسولة تضخم لوحظ بعد الاستغناء عن صبغة زرقاء. ( C1 ) ويدل على قنية ناجحة من انتفاخ البنكرياس. ( C2 ) بسبب لقط غير لائقة، صبغة زرقاء يدخل الاثني عشر ويسبب انتفاخ. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
2. جزيرة الثقافة على سقالة
ملاحظة: دسس لديه مسامية من حوالي 79٪، وسمك حوالي 0.6 ملم، وحجم المسام تتراوح بين 12 و 300 ميكرون.
3. زرع الجزر في موقع إف
لدينا طريقة لقط، يؤديها باستخدام المشبك مرقئ المجهري، هو واضح وتوفير الوقت مقارنة مع تقنية ربط خياطة. استغرق الأمر حوالي 4 ساعات لعزل وتنقية حوالي 1200 جزيرة من 6 الفئران. وكان الجزر المعزولة حديثا عادة محيط الخام تحت المجهر الضوئي ( الشكل 3A ). وبمجرد أن الجزر تعافى من عملية العزل، فإنها تبدو مشرقة وضيقة وحصلت على سطح أملس. ومع ذلك، فإن العزلة المجهدة لا تزال تحفز موت الخلايا، مما أدى إلى التخلي عن الخلايا من أسطح جزيرة، والجزر غير صحية في كثير من الأحيان تحتوي على جوهر نخرية مظلمة ( الشكل 3B ). قمنا بقياس أقطار 945 الجزر من 5 الفئران. وكان متوسط حساب جزيرة الجزيرة 130.42 ± 41.75 ميكرون ( الشكل 3C ).
لتجنب المستلم المناعي الرفض، أجرينا زرع سينجينيك في الفئران C57BL / 6J. عادة، تم زرع 500 جزيرة محملة دسس إلى موقع إف وعكس ارتفاع السكر في الدم في غضون 10 يوما، مقارنة مع 30 يوما لوحظ في مجموعة جزيرة الحرة. تم الحفاظ على سكر الدم لمدة 100 يوم، حتى استرجاع الطعوم ( الشكل 3D ). تم توزيع الجزر المحملة بالتساوي على دسس وتغطيها إف. ويمكن أيضا أن دسس جزيرة محملة يمكن التعامل معها بسهولة باستخدام ملقط ( الشكل 3E و 3 F ). وأظهرت الدراسة النسيجية أن الجزر موزعة بالتساوي تم إعادة توعيتها وتحيط بها الأنسجة إف و دسس بعد زرع لمدة 60 يوما ( الشكل 3G ). و إمونوستينينغ من الأنسولين أكد أيضا إنغرافتمنت ناجحة من الجزر ( الشكل 3H ).
زفيجيمغ "سرك =" / فيليز / ftp_upload / 54995 / 54995fig3.jpg "/>
الشكل 3: زرع الجزر التي تدعم سقالة إلى موقع إف. ( A ) صورة ممثلة من الجزر الطازجة معزولة عن الفئران. ( ب ) الجزر المستزرعة لمدة 12 ساعة، مع الخلايا الميتة تسير قبالة سطح جزيرة. إنزيت: الجزر غير الصحية لها نواة مظلمة، نخرية. ( C ) توزيع حجم 945 الجزر من 5 الفئران. ( د ) غير الصيام مستوى السكر في الدم من الفئران السكري زرعها مع الجزر المدعومة دسس والجزر الحرة. يشير السهم الأسود إلى أن الكسب غير المشروع تم استرجاعه في هذه المرحلة الزمنية. ( E ) صورة تبين نقل السقالة محملة جزيرة على سطح النسيج إف انتشار. ( F ) المرحلة التمثيلية صورة النقيض من دسس جزيرة محملة. أقحم: صورة بصرية من دسس، الذي عقده ملقط. ( G ) ممثل النسيجي H & E صورة للالجزر المزروعة، وتحيط بها دسس و إف، بعد 60 يوما. ( H ) إمونوستينينغ من الجزر التي تدعمها دسس، إكسلانتيد بعد 60 يوما. الحانات مقياس = 150 ميكرون (A، B)، 100 ميكرون (F)، 500 ميكرون (G)، و 25 ميكرون (H). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
البنكرياس نضح والهضم الوقت هما البارامترات الرئيسية التي تؤثر على العائد جزيرة والجودة. ذكرت موسكالوسكي أولا استخدام خليط كولاجيناز الخام لهضم المفروم غينيا بنكرياس خنزير 11 . لاسي وآخرون. وذكرت حقن الانزيمات في نظام القناة لإرضاء البنكرياس، مما أدى إلى زيادة كبيرة في العائد جزيرة 12 . نضح الأقنية من الانزيم يسمح للتعرض القصوى من مساحة سطح البنكرياس إلى الانزيم، مما أدى إلى هضم أكثر تجانسا وإطلاق أكبر من الجزر سليمة بالمقارنة مع هضم البنكرياس المفروم 13 . في تجربتنا، والقنية الناجحة للقناة الصفراوية ونضح من البنكرياس كله كانت الشروط المسبقة لعائدات جزيرة عالية. وذلك لأن ذيل البنكرياس (الفص الطحال) يحتوي في الواقع على معظم الجزر مقارنة مع نسيج البنكرياس بالقرب من الاثنى عشر. هناك طريقتان لقنية القناة الصفراوية التي تم الإبلاغ عنها في الأدب: ط) إدراج الإبرة بالقرب من موقع الكبد في حين عرقلة دخول الانزيم في الاثني عشر 13 و 14 و 2) إدراج الإبرة على مقربة من الاثني عشر في حين عرقلة دخول الانزيم في الكبد 15 . هنا، اعتمدنا هذه التقنية الأخيرة، والتي لا تتطلب الانحناء إبرة أو إعادة تمرير الماوس. يمكن للباحث المدربين تدريبا جيدا أداء قنية من 10 الفئران في غضون 40 دقيقة عند اتباع بروتوكول لدينا. وقت الهضم للبنكرياس يختلف مع عمر وأنواع الفئران. والبنكرياس المفرط في الهضم ينتج الجزر الصغيرة والبنكرياس المهضوم هاسينار له خلايا متصلة بالجزر. ولذلك فمن المهم لتحسين وقت الهضم للحصول على عوائد عالية من الجزر السليمة.
ستز هو مركب مضاد حيوي الذي يدمر على وجه التحديد خلايا بيتا ويحفز مرض السكري في الفئران في غضون 3 أيامسس = "كريف"> 16. تختلف الجرعات مع سلالة الماوس محددة والعمر، وينبغي أن تحدد من قبل التجارب السابقة. على حد علمنا، الفئران C57BL / 6J تتطلب جرعة أقل من ستز من البلب / C الفئران. جرعة زائدة من ستز سوف يسبب ارتفاع السكر في الدم الشديد ويؤدي إلى وفاة الحيوانات في غضون أسبوع، في حين أن جرعة ستز غير كافية يقلل من معدل الإصابة بالسكري.
إفس هي الأوعية الدموية للغاية الأنسجة ويمكن الوصول إليها بسهولة لعملية جراحية من خلال الإجراءات التدخلية الحد الأدنى. زرع الجزر إلى إف عموما أكثر سهولة وأكثر أمانا بالمقارنة مع كبسولة الكلى، وآخر موقع شائع عادة لزرع جزيرة في نماذج الماوس. على وجه الخصوص، والكلى هو جهاز أساسي وحساسة للتعامل معها. زرع الجزر قد تفشل أو الحيوانات قد لا البقاء على قيد الحياة في الجراحة 4 . و إفس في الفئران هي أيضا مماثلة لحقيبة الثرب في البشر. دراسة زرع في إف لا يمكن أن تسهل فقط لدينافهم بيئة الأنسجة المسبقة لبقاء جزيرة / وظيفة، ولكن أيضا وضع الأساس لتطوير إجراءات زرع السريرية 17 .
وقد اشتقت دسس المستخدمة في هذه الدراسة من التامور البقري وكان أساسا من الكولاجين. المواد ديسلولاريزد قد لا تظهر المناعية ويمكن أن تحفز فقط الاستجابات الالتهابية خفيفة في الجسم الحي 18 . عندما كانت البذور المصنفة داخل مسام دسس، قدمت سقالة الحماية الميكانيكية ومنع الجزر من التكتل معا، والتي يمكن أن تؤدي إلى نخر الجزر. يمكن التعامل مع سقالة دسس التي تحتوي على الجزر مباشرة باستخدام ملقط، مما يسمح لنقل سهل للزرع. تضمين السقالات داخل إف أيضا خفض تسرب الجزر في البريتوني، على عكس الجزر الحرة زرعها دون سقالة 8 . لذلك، يوفر دسس ديستينكر مزايا لزرع الجزر.
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
المؤلفين أود أن أشكر وي تشانغ من غوانهاو التكنولوجيا الحيوية لتوفير السقالات ديسلولاريزد. نشكر شياو هونغ بنغ للمناقشات مفيدة. وقد دعم هذا البحث ماليا من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (مشروع رقم 31322021).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dissecting scissor | Ningbo Medical | ||
Forceps | Ningbo Medical | ||
0.5 mm diameter wire mesh | Ningbo Medical | ||
70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
Artery hemostatic clamp | Ningbo Medical | ||
Microscopic hemostatic clamp | Ningbo Medical | ||
Hemostatic forceps | Ningbo Medical | ||
Absorbable 6-0 PGLA sutures | JINHUAN | With needle | |
Wound clip | Ningbo Medical | ||
Cotton swab | Ningbo Medical | ||
Gauze | Ningbo Medical | ||
Sterile drapes | Ningbo Medical | ||
10mL syringe | JINGHUAN | ||
1 mL syringe | JINGHUAN | ||
27G intravenous needle | JINGHUAN | 0.45x15 RWSB | |
1.5 mL Eppendorf tube | Axygen | ||
15mL conical tube | Corning | 430791 | |
50mL conical tube | Corning | 430829 | |
35mm Non-treated Peri-dishes | Corning | 430588 | |
Transwell | Corning | 3422 | |
0.22 μm filter | Pall | PN4612 | |
10 mL serological pipet | Corning | 4488 | |
Pipet filler S1 | Thermo Scientific | 9501 | |
Pipette (2-20μL) | Axygen | AP-20 | AXYPETTM |
Dissecting microscope | Olympus | SZ61 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Hank’s balanced salt solution | Gibco | C14175500CP | |
Collagenase P | Roche | COLLP-RO | |
Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
RPMI 1640 | Gibco | 11879-20 | |
FBS | Gibco | 16000-044 | |
D-glucose | Gibco | A24940-01 | |
Glucose meter | Roche | ACCU-CHEK | |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Streptozotocin | Sigma | V900890 | VetecTM |
Chloral hydrate | J&K | C0073 | |
Sodium citrate | Sigma | 71497 | |
Citric acid | Sigma | C2404 | |
Iodophors | Ningbo Medical | ||
C57BL/6J, 10-12 weeks old | VitalRiver | Beijing, China | |
Decellularized scaffold | Guanhao Biotec | 131102 | Guangzhou, China |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved