Method Article
In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.
Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.
الظهارة المعوية هي واحدة من أنسجة الجسم المتكاثرة بسرعة أكبر، الأمر الذي تسبب بها لجذب اهتمام واسع من البحوث على الخلايا السرطانية والجذعية. في عام 2009 تم نشر تقنية لتوليد الثقافات طويلة الأمد من الخبايا المعوية صغيرة في matrigel، والحفاظ على الأبعاد هيكل 1 3. هذه الهياكل، وصف organoids الأمعاء، يمكن تربيتها باستخدام تقنيات القياسية، مع توضيح تستكمل المتوسطة مع عدد من عوامل النمو محددة، بما في ذلك BMP-يشير مسار المانع رأس (نوج)، وWNT-يشير محسن مسار rspondin 1 (Rspo1) و عامل نمو البشرة (EGF) وجد كل لتعزيز انتشار الأمعاء 2-4.
Organoids تجاوز خطوط الخلايا السرطانية التقليدية في الجوانب التي هم غير المتحول، حافظوا على التسلسل الهرمي الخلايا الجذعية، وعرض الاستقطاب الخلوي سليمة ومعرض التمايز في جميع الأنساب الخلية وجدت في كثافة العمليات الصغيرة الوليدةظهارة estinal. لأنها يمكن transduced للقيام الجينات المحورة أو تدخل RNA يبني 5، وأنها تستخدم لدراسة عناصر وراثية محددة، تفوق التجارب باستخدام الفئران المعدلة وراثيا في جوانب التكلفة والسرعة. التعبير المعدلة وراثيا في organoids يمكن القيام بها باستخدام إما فيروسات أو الفئران ناقلات lentiviral 6،7. بسبب القيود المفروضة على الفيروسات القهقرية الفئران، قادرة على transducing الخلايا الإنقسامية حصرا 8، هو أكثر كثيرا ما تستخدم تنبيغ lentiviral للخلايا التي يصعب أن تصيب، مثل organoids.
transduced فيروسي والتعبير عن ثابت organoids المعدلة وراثيا يمكن أن تستخدم للعديد من التحليلات المصب، بما في ذلك RNA الكمي التحليلات والمناعية. أخذت معا، وتطورت ثقافة organoids من الخلايا الظهارية في الأمعاء الأولية في تقنية الروتينية التي هي سهلة لتنفيذ دون متطلبات مختبر معينة، وأصبحت المعيار رواية في مالثقافة ليرة لبنانية في البحث على ظهارة الأمعاء.
تقنيات تنبيغ الفيروسية وتحليل المصب لاحق في organoids هي شاقة لأداء وللمساعدة تجارب عضي ولدت لنا هذا البروتوكول الفيديو، والتي تبين طرق lentiviral تنبيغ organoids مثقف. وتبين لنا بالإضافة إلى ذلك كيف يصح تجهيز organoids يمكن زيادة الغلة، وبالتالي تعزيز أداء تحليل المصب باستخدام تقنيات RNA أو المناعية. في البروتوكول، واستخدمت organoids التي هي مستمدة من الخبايا المعوية الصغيرة حصرا، على الرغم من أن التقنيات الموضحة يمكن تطبيقها على organoids القولون أيضا.
1. إعداد Polyethylenimine (PEI) كما ترنسفكأيشن الكاشف
2. إنتاج Lentiviral الجسيمات
اليوم 1:
يوم 2:
اليوم 4:
يوم 5:
3. Lentiviral تنبيغ من Organoids
اليوم 0:
يوم 2:
يوم 5:
يوم 7:
4. عضي إعداد RNA لالكمي RT-PCR أو ميكروأري
5. معالجة Organoids لتضمين البارافين والمناعية
تنبيغ lentiviral عضوي الشكل
تقنية التنبيغ عضوي الشكل باستخدام الجزيئات lentiviral تعتمد على المعالجة الصحيحة للorganoids قبل وأثناء التنبيغ. كانت Organoids (الشكل 3A) مثقف وأنها تعطلت في أقبية واحدة (الشكل 3B). كما ذكرت سابقا، أصبحت هذه الأقبية واحدة، عندما مثقف في وجود المانع GSK3 Chir99021 أقبية الكيسي 9 (الشكل 3C). وفي وقت لاحق تم trypsinized organoids للسماح للاختراق من جزيئات الفيروس إلى الخلايا واحد. عندما transducing الخلايا مع جزيئات lentiviral، عدد من الطرق يجوز محاكمة لتعزيز فعالية التنبيغ مثل spinoculation أو الحضانة لفترات طويلة. وقد استخدم عالية عيار PGK-EGFP الفيروسة البطيئة لتمكين التصور من فعالية التنبيغ بواسطة المجهر الفلورسنت. كانت فعالية تنبيغ organoids مع هذا البلازميد عالية واقتربت 100٪ (شملت رقمالبريد 4E، F). تحسين فعالية استخدام spinoculation (الشكل 4A، B) أو الحضانة لفترات طويلة مع جزيئات lentiviral (الشكل 4C، D) لم بالتالي لا تسفر عن قيمة إضافية.
استخراج الحمض النووي الريبي
كانت تزرع organoids المقبل لاستخراج الحمض النووي الريبي. تم حصاد organoids كامل نمت التي تعرضت لأشعة جاما أو المعاملة التحكم لتظهر انخفاض سلامة الحمض النووي الريبي (الشكل 5). على التشعيع مع 6 غراي، RNA هو المتدهورة ومقارنة للسيطرة على organoids المعالجة، يتم تقليل عدد سلامة الحمض النووي الريبي (رين).
المناعية على البارافين جزءا لا يتجزأ من organoids
بعد احتضان organoids لمدة 2 ساعة في الثقافة المتوسطة تستكمل مع BrdU، كانت ثابتة organoids في الفورمالين ومعالجتها لالمناعية (الشكل 6). باستخدام الماوس مكافحة BrdU، يمكن ملاحظة خلايا التكاثري في سرداب-SEGMالوالدان من organoids وليس في حجرة متباينة.
الشكل 1:. تخطيطي للإنتاج الفيروسة البطيئة لالتنبيغ عضوي الشكل كما هو مكتوب في البروتوكول جزء 2، في هذا التخطيطي، وتتمثل الخطوات الأكثر أهمية من إنتاج فيروس مع أرقام خطوة البروتوكول وتوقيت.
الشكل 2: رسم تخطيطي للتنبيغ lentiviral من organoids كما هو مكتوب في البروتوكول جزء 3، في هذا التخطيطي، وتتمثل الخطوات الأكثر أهمية من التنبيغ عضوي الشكل مع أرقام خطوة البروتوكول وتوقيت.
الشكل 3: Organoids قبل وأثناء ترانيتم تقسيم sduction. organoids المتزايد عادة (A) إلى تزايد كثافة organoids صغير (B) التي تصبح الكيسي بعد الحضانة مع Chir99021 لعدد من الأيام (C). على تفكك هذه organoids باستخدام التربسين، وخلايا واحدة وكتل صغيرة من الخلايا تبقى (D) التي تم transduced في وقت لاحق. مقياس شريط 100 ميكرون.
. الشكل 4: تنبيغ من organoids باستخدام ناقلات التعبير lentiviral الصور Brightfield (A، C، E، G) والصور الفلورسنت (B، D، F، H) من organoids التي تم transfected مع إما PGK-EGFP الفيروسة البطيئة (A - F) أو السيطرة الفيروسة البطيئة (G، H). EGFP التعبير في organoids بعد lentiviral التنبيغ باستخدام كل spinoculation وحضانة طويلة (A، B)، spinoculation فقط (C، D) أو أي خطوات إضافية لزيادة فعالية التنبيغ (E، F)، مقارنة للسيطرة على ناقلات transduced organoids، التي لا التعبير عن EGFP (G، H). لاحظ أن استخدام PGK-EGFP lentiviral بناء، لا يتم زيادة كبيرة فعالية التنبيغ خطوات إضافية. مقياس شريط 100 ميكرون.
الشكل 5: نتيجة التمثيلية للمحضرات RNA من organoids على bioanalyzer ملاحظة ترسيم قوي من العصابات تمثل سلامة الحمض النووي الريبي عالية في الممرات 2-4 وتشويه حول العصابات على الممرات 5-7 تمثل سلامة سجل RNA. عدد سلامة الحمض النووي الريبي (رين) من العصابات 2-4 هو 8.7، 9.2 و 9 على التوالي، في حين رانه RIN العصابات 5-7 هو 6.4، 6.6 و 5.5.
الشكل 6: تحليل المناعى من الفورمالين الثابتة البارافين جزءا لا يتجزأ من organoids الفورمالين البارافين الثابتة جزءا لا يتجزأ من 4 ميكرون قسم من organoids مثقف في وجود BrdU لمدة ساعتين وثابتة في وقت لاحق. اتسخت القسم مع الأجسام المضادة لمكافحة BrdU. مقياس شريط 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
وسط قاعدي | الإضافات | |
خط الخلية مستنبت | DMEM | 10٪ FCS |
1٪ البنسلين / الستربتومايسين | ||
2 مم جليليutamine | ||
عضوي الشكل مستنبت | المتقدم DMEM F12 | HEPES |
1٪ البنسلين / الستربتومايسين | ||
1X glutamax | ||
1٪ N2 ملحق | ||
2٪ B27 الملحق | ||
125 نانومتر ن-أسيتيل سيستين | ||
الماوس EGF (50 نانوغرام / مل) | ||
10٪ نوج-FC المتوسطة مكيفة (ما يعادل 100 نانوغرام / مل) | ||
10٪ Rspo1-FC المتوسطة مكيفة (ما يعادل 500 نانوغرام / مل) |
الجدول 1: الثقافة المتوسطة التكوين.
يصف بروتوكول الفيديو الحالي تنبيغ lentiviral من organoids من ظهارة الأمعاء الأولية وتحليل المصب من هذه organoids باستخدام تقنيات RNA الكمية والمناعية.
وغالبا ما يقوم التنبيغ Lentiviral في الخلايا الملتصقة أو العائمة في لوحات الثقافة. منذ هيكل ثلاثي الأبعاد من organoids يجعل من الصعب اختراق من قبل الجسيمات الفيروسية، ويتم استخدام عدد من الأساليب لزيادة الفعالية. المعالجة المسبقة لorganoids باستخدام Chir99021 يزيد انتشار وبالتالي جدوى بعد التنبيغ. فمن المهم للحفاظ على مجموعات زنزانة صغيرة بعد trypsinization، منذ الخلايا واحد قد انخفضت البقاء على قيد الحياة. وعلى النقيض من transductions الفيروسية باستخدام الارتجاعي الفئران، transductions lentiviral هي أكثر كفاءة وعادة لا تتطلب spinoculation، وهي تقنية معروفة لفعالية الزيادات التنبيغ في خلايا ES 10. عند استخدام الفيروسات القهقرية الفئران أو WHأون عوائد تنبيغ lentiviral فعالية منخفضة، ويمكن اختياريا أن تستخدم spinoculation لزيادة معدل التنبيغ. نحن لا تقييم بانتظام عيار الفيروس، حيث أن جميع الفيروس المتوفر من جولة واحدة من الإنتاج لتنبيغ organoids المستمدة من الحد الأقصى اثنين 0.95 سم 2 الآبار كانت تستخدم. وبالإضافة إلى ذلك، استخدم عموما اختيار المضادات الحيوية لإزالة الخلايا غير transduced. ومع ذلك تقييم عيار الفيروسية قد تكون ذات قيمة عند مواجهة مشاكل مع فعالية التنبيغ.
مطابقة لخلايا ملتصقة، لا يمكن للمستوى اختيار المضادات الحيوية يزيد من عدد من التكامل الفيروسية وبالتالي التعبير عن التحوير. استخدام بوروميسين رفيع المستوى (10 ميكروغرام / مل) للحصول على التعبير المعدلة وراثيا عالية وضربة قاضية فعالة، ولكن عندما علامات organoids معرض سمية، ويمكن استخدام مستويات أقل (الحد الأدنى 1 ميكروغرام / مل). وبالإضافة إلى ذلك، والمضادات الحيوية اختيار بديلة يمكن أن تستخدم أو قد تكون حذفت الاختيار، على الرغم من أن التنبيغ من المرجحأن تكون ناقصة وهذا قد لا يؤدي إلى التعبير مستقرة طويلة الأجل. وعلاوة على ذلك، منذ التكامل lentiviral في الجينوم هو غير متجانس في جميع أنحاء السكان من الخلايا، تعبير عن التحوير يمكن إخضاع إلى التغييرات بعد زراعة الخلايا لفترة طويلة من الوقت. قد يؤدي هذا الضغط الانتقائي من قبل تعبير عن التحوير. على الرغم من أن اختيار المضادات الحيوية تحد هذه التغييرات، فإنها قد لا تزال قائمة، وخاصة في حالة التعبير التأسيسي من الجينات المحورة. ويمكن التغلب على هذا العيب عن طريق الاستنساخ خلية واحدة من organoids، ولكن هذا الأسلوب هو مضيعة للوقت. التنبيغ Lentiviral يمكن القيام بها مع مجموعة واسعة من البلازميدات التي تؤدي إلى إما التعبير مستقر أو محرض من الجينات المحورة. عادة ما يتم التعبير عن هذه الجينات المحورة من المروجين في كل مكان، مثل CMV أو المروج PGK ويمكن أن يؤدي في التعبير خارق للطبيعة. وعلى غرار overexpression المعدلة وراثيا في خطوط الخلايا السرطانية أو الحيوانات نموذج، هناك ما يبرر الحذر تفسير النتائج جيئة وذهابام overexpression.
للتجارب التي تتطلب RNA، وانخفاض عدد خلايا قابلة للحياة نمت عادة في واحدة 0.95 سم 2 جيدا (مساحة قياسية من 48 أيضا) على النقيض من الخلايا الملتصقة التي يمكن بسهولة أن تزرع في قوارير كبيرة هو عامل يحد من معدل للجودة وعدد وافر من تحليل المصب. نجد أن عادة، بئر واحد من ما يقرب من 50 كامل نمت عائدات organoids بين 0.4 ميكروغرام و 1 ميكروغرام الحمض النووي الريبي مجموع، ويجري كافية لالكمي RT-PCR RNA وميكروأري دون مزيد من التضخيم. يمكن علاجية معينة أو تغيرات جينية تقلل من المحتوى RNA ولكن إلى حد كبير. الخطوة الأولى لزيادة إجمالي RNA يتم تجميع الآبار متعددة.
لتضمين البارافين من organoids، فمن الأهمية بمكان للحصول على مواد كافية من أجل رؤية organoids أثناء العملية. إضافة كميات ضئيلة من يوزين لorganoids ثابتة تسمح التصور من خلال organoids كلهالعملية، ولكن لا يلزم لتضمين العادي ويمكن حذف عندما تتدخل هذه الخطوة مع مزيد من التحليل. عادة، والأشرطة-تضمين البارافين بها ثقوب فيها للسماح تدفق تثبيتي، وعملية حلول للالأنسجة في الكاسيت.
التنبيغ عضوي الشكل Lentiviral والتحضير للتقنيات القياسية المصب يزيد الإمكانات العلمية لهذه الثقافات ويرفع مستوى في الثقافة الخلية لتقنيات ثلاثية الأبعاد من ظهارة الأمعاء الأولية. مجموعة من التجارب المصب التي يتعين القيام بها ولكن لا تقتصر على التقنيات الموضحة في البروتوكول الحالي ويمكن أن تشمل جميع التقنيات التي تجرى على خطوط الخلايا أو الفئران، ونظرا لكمية المواد الخلوية الناتجة عن ثقافة غير كافية. في البحث عن عناصر محددة الوراثية وظيفتها في ظهارة الأمعاء، وتقنيات إعادة التركيب مثلي في الحيوانات نموذج، وأبرزها الفئران، يبقى معيار الذهب. ثقافات organoids تفعللا يحتوي على الوسيطة أو المتخصصة المناعية الخلايا وأقبية مثقف تتوسع من أي وقت مضى، المتناقضة الوضع وجدت في الجسم الحي. ومع ذلك، فقد أثارت هذه الثقافات نوعية في المختبر النتائج بشكل كبير ومع مراعاة تقنيات المصب لا تعد ولا تحصى التي يمكن القيام بها، والثقافة عضي لها وسوف يعزز إلى حد كبير البحوث على ظهارة الأمعاء.
The authors have nothing to disclose.
J. Heijmans is supported by a stipendium from the Dutch cancer foundation (KFW). G.R. van den Brink is supported by funding from the European Research Council under the European Community’s Seventh Framework Program (FP7/2007-2013)/European Research Council grant agreement number 241344 and by a VIDI grant from the Netherlands Organization for Scientific Research (GvdB).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Polyethylene imine | Polysciences | 23966-2 | |
DMEM medium | Lonza | BE12-614F | |
Fetal calf serum | Lonza | DE14-801F | |
Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
matrigel | BD | BD 356231 | |
Advanced DMEM-F12 | Gibco | 12634-010 | |
N2 | Invitrogen | 17502-048 | |
B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
N-acetyl cysteine | Sigma | A9165-1G | |
mouse Egf | Invitrogen | PMG8045 | |
Hepes 1 M | Invitrogen | 15630-056 | |
glutamax 100x | Invitrogen | 35050-038 | |
Chir 99021 | Axon | 1386 | |
Y27632 | Sigma | Y0503-5MG | |
polybrene | Sigma | 107689 | |
nicotinamide | Sigma | N0636 | |
Trypsin | Lonza | BE02-007E | |
puromycin | Sigma | P 7255 | |
Rneasy mini kit | Qiagen | 74106 | |
β-mercaptoethanol | Merck | 8,057,400,250 | |
Ovation Pico WTA system | NuGen | 3300-12 | |
paraformaldehyde | Sigma | 252549-1L | |
glass vial conical 12 mm x 75 mm 5 ml | VWR | LSUKM12 | |
Eosin Yellowish | VWR | 1,159,350,025 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved