تحليل الإنتاجية العالية من الثدييات شمي المستقبلات: قياس مستقبلات التنشيط عبر luciferase المراسل آخر

حاسة الشم أنماط تنشيط مستقبلات ترميز الهوية رائحة، ولكن عدم وجود بيانات نشرت تحديد بروابط الرائحة لمستقبلات الشمية الثدييات يعيق تطوير نموذج شامل للرائحة الترميز. يصف هذا البروتوكول وسيلة لتسهيل التعرف الإنتاجية العالية من مستقبلات الشمية بروابط النوعي والكمي لتنشيط مستقبلات.

عطر خلق أنماط فريدة من نوعها وتداخل تنشيط مستقبلات حاسة الشم، والسماح لأسرة مكونة من حوالي 1،000 الفئران و 400 مستقبلات الإنسان للاعتراف الآلاف من عطر. وقد نشرت بروابط الرائحة لأقل من 6٪ من مستقبلات الإنسان ^1-11. ويرجع ذلك جزئيا إلى الصعوبات معربا عن ظيفيا هذه المستقبلات في أنظمة مغايرة هذا النقص في البيانات. هنا، نحن تصف طريقة للتعبير عن الأغلبية من عائلة مستقبلات الشمية في الخلايا Hana3A، تليها تقييم الإنتاجية العالية من تفعيل مستقبلات حاسة الشم باستخدام مقايسة luciferase المراسل الصحفي. هذا الاختبار يمكن استخدامها ل(1) لوحات شاشة عطر ضد مستقبلات الشمية لوحات؛ (2) تأكيد التفاعل الرائحة / مستقبلات عبر منحنيات الاستجابة للجرعة؛ و (3) مقارنة مستويات تنشيط مستقبلات بين المتغيرات مستقبلات. في نموذج البيانات لدينا، تم فحص 328 المستقبلات الشمية مقابل 26 عطر. كانت الرائحة أزواج / مستقبلات مع اختلاف درجات استجابة سلكتيد واختبارها في الاستجابة للجرعة. وتشير هذه البيانات إلى أن الشاشة هي وسيلة فعالة لإثراء للأزواج الرائحة / مستقبلات التي سيمر تجربة الاستجابة للجرعة، أي المستقبلات التي لديها استجابة حسنة النية إلى الرائحة. وبالتالي، فإن هذا الإنتاجية العالية luciferase الفحص هو وسيلة فعالة لتوصيف مستقبلات حاسة الشم وخطوة أساسية نحو نموذج من الترميز رائحة في نظام حاسة الشم لدى الثدييات.

نظام حاسة الشم لدى الثدييات لديه القدرة على الرد على عدد كبير من المحفزات معطر، مما يسمح للكشف والتمييز الآلاف من عطر. المستقبلات الشمية (نسب الأرجحية) هي أجهزة الاستشعار الجزيئية التي أعرب عنها الخلايا العصبية الحسية الشمية في الظهارة الشمية ^12. يحدث الاعتراف رائحة الثدييات من خلال تفعيل الفرق من نسب الأرجحية التي كتبها عطر، والأسرة الجين أو واسعة النطاق، مع ما يقرب من 1،000 الفئران و 400 مستقبلات الإنسان ^12-16. وقد أظهرت التحليلات الفنية السابقة من نسب الأرجحية في الخلايا العصبية الشمية في الخلايا والتي مغاير عطر مختلفة معترف بها من قبل فريدة من نوعها، ولكن تداخل الفرق من نسب الأرجحية ^10،17-20. مطابقة لنسب الأرجحية بروابط أمر بالغ الأهمية لفهم رمز الشم وضرورية لبناء نماذج قابلة للتطبيق من الشم. بسبب صعوبات التعبير عن نسب الأرجحية في أنظمة مغايرة فضلا عن عدد كبير من كل من عطر ونسب الأرجحية، كانت غائبة إلى حد كبير هذه البيانات من ودرع؛ في الواقع، فإن أقل من 6٪ من نسب الأرجحية البشرية لديها يجند نشرت ^1-11. يصف هذا البروتوكول استخدام مقايسة luciferase المراسل لوصف الرائحة / أو التفاعلات. هذا الاختبار يمكن توصيف الإنتاجية العالية من أملاح الإماهة الفموية، وهي مهمة ضرورية لفهم الرائحة / أو التفاعلات وكذلك تطوير نموذج للرائحة الترميز.

تواجه الدراسات الإنتاجية العالية من نسب الأرجحية ثلاثة تحديات رئيسية. أولا، تم الإبقاء على نسب الأرجحية التي أعرب عنها في الخلايا مغاير في ER وتدهورت في وقت لاحق في proteasome ^و21،22، ومنع نسب الأرجحية من التفاعل مع عطر في نظام مقايسة ^23-25. وقد وجهت هذه المشكلة عن طريق اكتشاف البروتينات التي تسهل التبعي مستقرة التعبير سطح الخلية من مجموعة واسعة من نسب الأرجحية ^19،26،27. مستقبلات نقل البروتينات 1 و 2 (RTP1 و2) تعزيز أو التعبير سطح الخلية وتفعيل ردا على التحفيز الرائحة ^19. على أساس هذا العمل، وكانت الخلايا HEK293Tتعديل للتعبير ثابت RTP1 طويلة (RTP1L) وRTP2، مستقبلات البروتين تعزيز التعبير 1، وG _αolf، مما أدى إلى خط الخلية Hana3A ^19،27. بالإضافة إلى ذلك، نوع 3 المسكارينية مستقبلات الأستيل كولين (M3-R) يتفاعل مع نسب الأرجحية على سطح الخلية ويعزز التنشيط استجابة لعطر ^26. شارك في ترنسفكأيشن لأو مع RTP1S وM3-R في Hana3A خلايا النتائج في التعبير قوية ومتسقة وظيفية من مجموعة واسعة من نسب الأرجحية على سطح الخلية ^27. الثانية، الثدييات أو ذخيرة كبيرة جدا. في البشر، على سبيل المثال، مرجع أو هو أمر من حجم أكثر عددا من مستقبلات ذخيرة الذوقية، و 2 أوامر من حجم أكثر عددا من مستقبلات بصرية ذخيرة. على الرغم من أن استنساخ واحد أو هو بروتوكول بسيط نسبيا، مطلوب جهد مقدما كبيرة لإنشاء مكتبة شاملة. الثالث، على الرغم من أننا نعرف أن في الرؤية، والطول الموجي يترجم إلى لون وفي وتيرة الاختبار يترجم إلى الملعب، ومن المفهوم تنظيم الروائح سيئة، مما يجعل من الصعب على الباحثين أن أقحم من عينة تمثيلية من عطر. على الرغم من إحراز بعض التقدم على هذه الجبهة ^10،28، وخريطة المشهد حاسة الشم لا تزال غير مكتملة. فحص عشرات الآلاف من الجزيئات ضد المئات من نسب الأرجحية هي مهمة شاقة؛ تتطلب شاشات عالية الإنتاجية في هذا المجال حملات محددة بعناية. التحديات الرئيسية المتبقية هي تلك الخدمات اللوجستية والتكلفة بدلا من المشاكل الملازمة لهذه التقنية. على الرغم من أن الفحص مغاير لم يستخدم على نطاق واسع لتحديد بروابط من قبل الجماعات الأكاديمية، وقد استخدمت شركة خاصة نفس الأسلوب لتحديد بروابط نسب الأرجحية ل100 الإنسان ^29. للأسف، لا تزال هذه البيانات الشخصية.

مقايسة luciferase المراسل الإنتاجية العالية المذكورة هنا لديها العديد من المزايا أكثر من الطرق البديلة المستخدمة لتقييم أو التنشيط. على الرغم من أن المسؤولةوقد تم قياس سيس من الخلايا العصبية الحسية الشمية الأم باستخدام الكهربية والتصوير الكالسيوم، وهذه التقنيات يجدون صعوبة في إغاظة وبصرف النظر الذي يؤدي إلى استجابة أو الخلايا العصبية بسبب عدم التداخل في خصائص استجابة الخلايا العصبية لحاسة الشم. على الرغم من أن يطرق-في GFP المسمى نوع مستقبلات ^30،31، وتقديم مستقبلات معينة عبر اتش لالفئران الخلايا العصبية الشمية ^32،33، أو أداء RT-PCR بعد التسجيلات ^17،24،33 يمكن ربط تسجيلات لأنواع مستقبلات واحدة، وهذه الأساليب هي منخفضة الإنتاجية وغير مناسبة للشاشات واسعة النطاق. أنظمة الفحص مغايرة هي أكثر استيعابا، وتوجد شكلين رئيسيين في الأدب: مسار للصحفيين المخيم واينوزيتول ثلاثي الفوسفات (IP3) للصحفيين المسار. على التحفيز رائحة، نسب الأرجحية تنشيط إشارة تتالي تنبيغ G _αolf أن النتائج في إنتاج دوري امبير (المخيم) ^12. من قبل المشترك transfecting على يراعة luciferase مراسل الجينات تحت سيطرة ميلانAMP عنصر الاستجابة (لجنة المساواة العرقية)، ويمكن قياس إنتاج luciferase المراسل بوصفها وظيفة من استجابة رائحة، مما يسمح لتقدير حجم أو التنشيط. أو التنشيط ويمكن أيضا أن تكون مرتبطة مسار IP3 قبل المشترك، معربا عن G-البروتينات مثل G _α15/16 أو _{G-α15 جبهة تحرير أورومو} الوهم ^24،25،34. اخترناه مقايسة المقدمة هنا على أساس ثلاثة عوامل هي: (1) شارك في التعبير عن RTP1 مع المستقبلات الشمية رو الموسومة يحسن التعبير عن مستقبلات الشمية على سطح الخلية ^19،27؛ (2) استخدام الجينات مراسل المخيم تستجيب يسمح لقياس أو التنشيط من خلال الكنسي الثاني مسار رسول؛ و (3) الفحص هو مناسبة تماما لشاشات عالية الإنتاجية.

هذا luciferase الفحص الإنتاجية العالية هي التي تنطبق على مجموعة متنوعة من دراسات قيمة في مجال الشم. أولا، عدد كبير من نسب الأرجحية يمكن فحص ضد الرائحة واحد من أجل تحديد نمط تنشيط مستقبلات ليرة سوريةالرائحة ecific. هذا النوع من الدراسة تحديد OR7D4 كما OR ​​المسؤولة عن الاستجابة لandrostenone الرائحة الستيرويد ^8. على العكس، واحدة أو يمكن فحص ضد فريق من عطر من أجل تحديد ملف استجابة مستقبلات ^10. عندما يتم تحديد مرشح حاسة الشم الرائحة / أو أزواج عبر هذه الشاشات، ويمكن التأكد من التفاعل عن طريق إجراء تجربة الاستجابة للجرعة دراسة استجابة أو لتركيزات متزايدة من الرائحة. يمكن منحنيات الاستجابة للجرعة أيضا تقييم مدى الاختلاف الجيني في أو يؤثر في استجابة الرائحة المختبر ^{8،9،11،35،} ويمكن تمديد هذه الدراسات إلى الاختلاف بين الأنواع أو، مما يسمح لفحص تطور مستقبلات عبر الأنواع والطفرات المسببة في تطور ^36،37، وأخيرا، وهذا الفحص يمكن استخدامها للكشف عن مضادات الرائحة التي هي قادرة على استعداء أو ردا على الرائحة خاص لزوج الرائحة / مستقبلات المعروفة ^38،39. باختصار، هذا عالية-الإنتاجية luciferase الفحص ينطبق على مجموعة من الدراسات التي تساعد تميز أو أنماط التنشيط وتوفير فهم أفضل للرائحة الترميز في نظام حاسة الشم.

1. ثقافة خلايا Hana3A

1. إعداد وسائل الاعلام من خلال استكمال M10 الأساسية الدنيا والمتوسطة (MEM) مع 10٪ (V / V) FBS.
2. صيانة الثقافة
   1. الحفاظ على خلايا في وسائل الإعلام M10. ملاحظة: ناقلات التعبير عن RTP1L، RTP2، REEP1، وG _αolf تمنح مقاومة بوروميسين إلى خلايا Hana3A، ولكن الحفاظ على الخلايا مع هذه المضادات الحيوية لا تؤثر تأثيرا كبيرا على نتائج الفحص.
   2. ثقافة فرعية بنسبة 01:08 في 10 سم الأطباق كل 2-3 أيام.
   3. احتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO _2.

2. الخلايا تصفيح لترنسفكأيشن

1. وسائل الإعلام نضح من 100٪ متموجة 10 سم طبق من الخلايا Hana3A.
2. غسل الخلايا بإضافة 10 مل PBS، يحوم الطبق، والشفط في برنامج تلفزيوني.
3. إضافة 3 مل من 0.05٪ التربسين / EDTA وانتظر الخلايا لفصل (حوالي 1 دقيقة).
4. تعطيل التربسين وذلك بإضافة 5 مل M10 وتفتيت كتل الخلية عن طريق الطحن تقريبا 10X و# 160؛ مع ماصة 10 مل. ماصة بعناية لتجنب إدخال فقاعات الهواء إلى وسائل الإعلام.
5. لكل لوحة 96 جيدا، ونقل 1 مل من الخلايا في أنبوب 15 مل المخروطية، أجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق، ونضح طاف دون الإخلال بيليه الخلية.
6. resuspend الخلايا في 6 مل M10 في 1 مل من الخلايا المنقولة في الخطوة 2.5.
7. ماصة 50 ميكرولتر من الخلايا إلى كل بئر من لوحة 96 جيدا واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO _2.

3. ترنسفكأيشن من المستقبلات الشمية

1. إعداد البلازميد الحمض النووي
   1. إعداد الحمض النووي البلازميد عبر بروتوكول خالية من الذيفان الداخلي. ملاحظة: إعداد مجموعات استخدام البلازميد الحمض النووي المعين "خالية من الذيفان الداخلي"، أو إضافة خطوة استخراج الفينول كلوروفورم إلى البلازميد الحمض النووي بروتوكول الإعداد.
   2. تمييع DNA إلى تركيز 100 نانوغرام / ميكرولتر في TE العازلة.
2. مراقبة الخلايا مطلي (الخطوة 2.7) لضمان confluency السليم للapproximately 30-50٪ لكل بئر والعودة إلى الحاضنة. ملاحظة: في حين أن هذا confluency ليس الأمثل للكاشف ترنسفكأيشن الدهون، وconfluency من 30-50٪ في هذه الخطوة هو الأمثل لقياس luciferase النشاط 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن.
3. إعداد ترنسفكأيشن ميكس
   1. ماصة RTP1S-PCI، M3-R-PCI، PCRE لوك، وpSV40-RL البلازميدات إلى MEM المتوسطة في وحدات التخزين بالتفصيل في الجدول 1 لجعل المزيج البلازميد (أحجام المبينة هي لكل لوحة 96 أيضا).

      مزيج البلازميد
      	لكل بئر	في لوحة 96 جيدا
      MEM	-	500 ميكرولتر
      RTP1S-PCI	5 نانوغرام	480 نانوغرام
      M3-R-PCI	2.5 نانوغرام	240 نانوغرام
      PCRE لوك	10 نانوغرام	960 نانوغرام
      pSV40-RL	5 نانوغرام	480 نانوغرام

      
      الجدول 1. مكونات المزيج البلازميد. لكل بشكل جيد وحدات التخزين في لوحة 96 جيدا من RTP1S-PCI، M3-R-PCI، PCRE لوك، وpSV40-RL، وMEM.
   2. لكل لوحة 96 جيدا، وتمييع 18 ميكرولتر كاشف ترنسفكأيشن الدهون في 450 ميكرولتر MEM المتوسطة.
   3. ماصة البلازميد مزيج (من الخطوة 3.3.1)، الموسومة مستقبلات الشمية في رودوبسين PCI البلازميد (رو-OR-PCI)، والدهون مزيج ترنسفكأيشن (من الخطوة 3.3.2) لجعل مجمع مفصلة في الجدول 2. مزيج الحل بواسطة سحن ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. وقف رد الفعل بإضافة M10 وفقا للجدول 2 ملاحظة: هذا هو رد فعل حساسة للوقت، وينبغي ألا يسمح له بالاستمرار لأكثر من 30 دقيقة. البئر الحساب + 10٪ المهم التأكد من حجم كاف لخطوات لاحقة.

      مجمع
      	لكل بئر	لكل بئر + 10٪
      مزيج البلازميد	4.2 ميكرولتر	4.58 ميكرولتر
      رو-OR-PCI	0.05 نانوغرام	0.06 نانوغرام
      مزيج ترنسفكأيشن الدهون	4.2 ميكرولتر	4.58 ميكرولتر
      M10	41.7 ميكرولتر	45.83 ميكرولتر

      
      الجدول 2. مكونات مجمع. لكل بشكل جيد ولكل بئر + 10٪ حجم المزيج البلازميد (الجدول 1)، الشم البلازميد مستقبلات (رو-OR-PCI)، ومزيج ترنسفكأيشن الدهون. يضاف M10 لإرواء رد فعل بعد الحضانة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

4. الاستفادة من وسائل الإعلام على لوحات الخلية.
5. ماصة 50 ميكرولتر من مجمع إلى كل بئر واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO _2.

4. رائحة تحفيز

1. مراقبة الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل لضمان confluency السليم لل50-80٪ لكل بئر والعودة إلى الحاضنة. ملاحظة: إذا الخلايا هي أقل من 50قد يكون٪ متموجة، يراعة و luciferase renilla luciferase المراسل قراءات منخفضة للغاية لقياس تنشيط مستقبلات. النظر في التخلص من لوحة.
2. إعداد 1 M حلول الأوراق المالية من كل رائحة في DMSO.
3. إعداد الحلول التحفيز رائحة CD293 في المتوسط.
   1. للتجارب الفرز، وتمييع الحل الأسهم من رائحة إلى 100 ميكرومتر. إعداد أيضا عنصر تحكم لا رائحة (CD293 فقط) من أجل السيطرة أو لتفعيل الخلفية. ملاحظة: للحصول على التجارب الفرز، يتم اختبار كل زوج أو / الرائحة فقط مرة واحدة في التجربة. لأن بعض الآبار عبر نشر رائحة غير ممكن، فمن المستحسن لتحفيز الرائحة مع واحدة لكل لوحة.
   2. للتجارب الاستجابة للجرعة، وإعداد سبعة أضعاف التخفيفات 10 من المسلسل محلول المخزون رائحة في ثلاث نسخ ابتداء من الساعة 1 ملم لكل مستقبلات. أيضا بإعداد نفس التخفيفات الرائحة في ثلاث نسخ للخلايا transfected ناقلات الفارغة من أجل السيطرة لتفعيل الخلفية رائحة. ملاحظة: للحصول على التجارب الاستجابة للجرعة، كل سوينبغي إجراء العلاج تركيز الدر في ثلاث نسخ.
4. الاستفادة من وسائل الإعلام على لوحات الخلية.
5. ماصة 25 ميكرولتر من رائحة حل التحفيز إلى كل بئر واحتضان لمدة 4 ساعة.

5. قياس أو آخر عبر luciferase الفحص

1. في resuspend الركيزة يراعة luciferase فقا لتعليمات الشركة المصنعة وتخزينها في -80 درجة مئوية.
2. ذوبان الجليد 1 مل من يراعة luciferase المراسل الركيزة لكل لوحة 96 جيدا.
3. إعداد رد فعل يراعة luciferase الطازجة وفاكهه تقضي Renilla luciferase المراسل الركيزة كاشف (5 ميكرولتر luciferase المراسل فاكهه تقضي / Renilla luciferase المراسل الركيزة لكل 1 مل من العازلة). ملاحظة: هناك حاجة إلى حوالي 1 مل من كاشف لكل لوحة 96 جيدا.
4. إعداد القارئ الانارة صفيحة ميكروسكوبية. فتح برنامج قارئ صفيحة ميكروسكوبية. ضمن رمز النظام:
   1. تحت عنوان "قبل التدفئة" الجدولة، حدد المربع ل "ON" وضبط درجة الحرارة من الجهاز إلى 25 درجة؛ C.
   2. تحت عنوان "مصدر" علامة التبويب، رئيس كل موزع مع 1،000 ميكرولتر من الايثانول 70٪ تليها 1،000 ميكرولتر من الماء المقطر. ملاحظة: استخدم مأخوذة منفصلة من الماء والكحول لكل موزع. يستخدم الايثانول لتطهير موزعات، والماء يزيل الايثانول المتبقية.
   3. رئيس كل موزع مع 1،500 ميكرولتر من الهواء (إزالة موزعات من السائل). ملاحظة: فتيلة بالهواء يضمن ركائز luciferase المراسل لا المخفف بالماء المتبقية.
   4. رئيس موزع 1 مع 1،080 ميكرولتر من الركيزة luciferase المراسل اليراع (من الخطوة 5.2). رئيس موزع 2 مع Renilla luciferase المراسل الركيزة (من الخطوة 5.3). ملاحظة: يجب الحرص على عدم تلويث عبر ركائز luciferase المراسل. فتيلة مع ركائز luciferase المراسل يملأ الفضاء الميت في موزعات كاشف.
5. إعداد بروتوكول التالية لقراءة كل اليراع وRenilla luciferase المراسل التلألؤ. ضمن البرامج المصاحبة للقارئ صفيحة ميكروسكوبية، من الامم المتحدةدير القائمة "ملف"، انقر على "مهمة جديدة". تسليط الضوء على "البروتوكولات" وانقر على "إنشاء جديد". في الإطار التالي، يجب أن يتم تحديد الدائرة بجانب "بروتوكول قياسي". انقر على زر "موافق". انقر مرتين على "الداخلي" على الجانب الأيسر من الشاشة.
   1. الاستغناء 10 ميكرولتر من يراعة luciferase المراسل الركيزة لجميع الآبار باستخدام موزع 1. تحت قائمة "الأعمال"، انقر فوق "الاستغناء". في الإطار "الاستغناء عن الخطوة"، مجموعة: "الصيدلي" إلى 1، "فتيلة" لا شيء "، المجلد الاستغناء" إلى 10 ميكرولتر و "قيم" إلى 225 ميكرولتر / ثانية. انقر على زر "موافق".
   2. يهز لوحة لمدة 30 ثانية. تحت قائمة "الأعمال"، انقر فوق "اهتز". في الإطار "اهتز الخطوة"، مجموعة "شدة" إلى متوسط ​​و "المدة" ل00:30 MM: SS. انقر على زر "موافق".
   3. قراءة التلألؤ جميع الآبار لل0.5 ثانية لكل بئر. تحت قائمة "الأعمال"، انقر فوق "اقرأ"؛ في الإطار "اقرأ الخطوة"، مجموعة: "أسلوب اكتشاف" لالتلألؤ، "قراءة نوع" لنقطة النهاية، "تكامل الوقت" ل00:00:50 MM: SS: SS، "تصفية مجموعات" إلى 1، "الانبعاث" لهول "، البصريات المركز" إلى أعلى "كسب" إلى 135، و "قراءة الارتفاع" إلى 1.00 ملم. انقر على زر "موافق".
   4. الاستغناء 10 ميكرولتر من الركيزة luciferase المراسل Renilla لجميع الآبار باستخدام موزع 2. تعيين الشروط كما في الخطوة 5.6.1، باستثناء مجموعة "مصدر" إلى 2.
   5. يهز لوحة لمدة 30 ثانية. تعيين شروط كما في الخطوة 5.6.2.
   6. قراءة التلألؤ جميع الآبار لل0.5 ثانية لكل بئر. تعيين شروط كما في الخطوة 5.6.3.
6. إزالة الغطاء عن لوحة 96 جيدا ووضع لوحة في قارئ صفيحة ميكروسكوبية. بدء تشغيل البرنامج الذي أنشئ في الخطوة 5.5 لقراءة لوحة التلألؤ.
7. تنظيف مضخات موزع كاشف. من رمز النظام تحت "مصدر" علامة التبويب:
   1. تطهير 1،000 ميكرولتر من وirefly الركيزة luciferase المراسل من موزع يراعة luciferase في أنبوب الانتعاش. ملاحظة: يمكن تخزين luciferase المراسل اليراع في -80 درجة مئوية وإعادة استخدامها.
   2. رئيس كل موزع مع 1،000 ميكرولتر من الماء المقطر، تليها 1،000 ميكرولتر من الايثانول 70٪، وأخيرا 1،500 ميكرولتر من الهواء (إزالة موزعات من السائل). ملاحظة: الماء يزيل ركائز luciferase المراسل من مضخات الكاشف، يطهر الإيثانول، والهواء يجف أي الإيثانول المتبقية.

6. تحليل البيانات

1. تصدير البيانات
   1. في برنامج قارئ صفيحة ميكروسكوبية، انقر مرتين على "بناة تقرير / التصدير" على الجانب الأيسر من الشاشة.
   2. انقر على زر "تصدير إلى Excel جديد" وانقر على زر "موافق".
   3. تسليط الضوء Export1 وانقر على "تحرير".
      1. تحت عنوان "المحتوى" تحقق "وصف النظام"، "الداخلي"، "لوحة الوصف"، و "لوحة تخطيط ماتريكس". وتشمل "البيانات الخام" لالثانية "محسوب البيانات".
      2. تحت عنوان "سير العمل"، تحقق "Autoexecute على الانتهاء من الإجراء". تحت وضع التصدير، تحقق "جميع لوحات في نفس المصنف" و "ورقة عمل جديدة".
      3. تحت عنوان "ملف" اختيار تنسيق اسم الملف وموقع ملف، وانقر على زر "موافق".
      4. إغلاق "تقرير / التصدير بناة" نافذة.
2. الحصول على قيم luciferase المراسل تطبيع، تقسيم يراعة luciferase المراسل القراءة التلألؤ لكل بئر (الخطوة 5.6.3) من خلال القراءة التلألؤ Renilla لكل بئر (الخطوة 5.6.6).

شاشة الابتدائي اختبار 328 نسب الأرجحية ضد 26 الروائح عند تركيز 100 ميكرومتر. وقد تجلى هذا التركيز رائحة لتنشيط فعالية نسبة كبيرة من أملاح الإماهة الفموية مع بروابط معروف ^10. أولا، تم حساب luciferase النشاط تطبيع بقسمة القراءة يراعة luciferase من القراءة luciferase المراسل Renilla. المقبل، وحسبت القيم يحدد الخط الأساسي عن طريق طرح قراءات luciferase المراسل تطبيع للسيطرة لا رائحة من القراءات luciferase المراسل تطبيع لكل بئر (الشكل 1). أجريت منحنيات الاستجابة للجرعة على 48 الرائحة / أو أزواج موزعة بشكل عشوائي عبر مجموعة من القيم يحدد الخط الأساسي، كما يتبين من الحانات الملونة في الشكل 1، وعولجوا نسب الأرجحية مع 7 تركيزات الرائحة التي تغطي 1 نانومتر إلى 1 ملم، وكانت الردود الناجمة صالح إلى منحنى السيني باستخدام الانحدار غير الخطية. وتعتبر الرائحة / أو ناهض إذا اجتمع ثلاثة معايير هي: (1) الخطأ المعياريكان logEC ₅₀ أقل من 1 وحدة السجل؛ (2) 95٪ من فترات الثقة للمعلمات أعلى وأسفل منحنى لم تتداخل؛ و (3) أكدت اختبار إضافية الساحات مبالغ من بين أن الرائحة تنشيط الخلايا أو التي تحتوي على أكثر بكثير من الخلايا السيطرة، والتي كانت transfected مع متجه فارغة. وتتلخص نتائج الاستجابة للجرعة في الجدول 3.

ثم استخدمت هذه البيانات لتحديد مدى قياسات الفحص في الشاشة الرئيسية التنبؤ النتائج من منحنى الاستجابة للجرعة. أشرطة زرقاء في الشكل 1 تتوافق مع أزواج التي صنفت على أنها منبهات في تجربة الاستجابة للجرعة كاملة، في حين الحانات الحمراء لم تستوف المعايير الثلاثة المذكورة أعلاه لدينا. توقع القيم من الشاشة الرئيسية النتائج من الجرعة الكاملة التجربة استجابة (منطقة تحت منحنى خاصية التشغيل المتلقي (AUC) = 0.68، ف <0.01، مان ويتني U اختبار)، مشيرا إلى أن الشاشة الرئيسية لدينا هي طريقة مفيدة لإثراء لالرائحة / أو أزواج التي سيتم تصنيفها على أنها منبهات في استجابة التجربة الجرعة الكاملة (الشكل 2).

الشكل 1. التردد القيم luciferase المراسل يحدد الخط الأساسي للشاشة مع لوحة من المستقبلات الشمية وعطر. الرسم البياني للتردد (عدد) من القيم luciferase المراسل يحدد الخط الأساسي يحسب لكل الرائحة / أو الزوج في الشاشة الرئيسية. كما أزواج تفعيل الرائحة / مستقبلات هي متفرق، وتتركز غالبية القيم عند مستوى الصفر ويقدر توزيع مركزية كبيرة في توزيع الضوضاء لهذا الاختبار. أشرطة ملونة تشير أزواج الرائحة / مستقبلات المختارة لتحليل الاستجابة للجرعة؛ أشرطة زرقاء هي أزواج التي صنفت على أنها منبهات على أساس الاستجابة للجرعة كاملة، والحانات الحمراء هي أزواج التي لم تصنف على أنها منبهات. و = "https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51640/51640fig1highres.jpg" الهدف = "_blank"> اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الشكل 2. منحنى ROC للشاشة الرائحة / مستقبلات. صنفت 48 أزواج الرائحة / مستقبلات بأنها منبهات أو أنها غير منبهات. معدل الإيجابية الحقيقية (حساسية) ثم تآمر ضد معدل إيجابية كاذبة (1-خصوصية) باستخدام حزمة الإحصائية R ^40. المنطقة تحت المنحنى (AUC) هو 0.68، مما يدل على أن أزواج الرائحة / مستقبلات مع قيم أعلى الشاشة luciferase المراسل هم أكثر عرضة لتمرير الاستجابة للجرعة من تلك التي مع انخفاض القيم. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الجدول 3. الشمية أزواج مستقبلات / الرائحة اختبارها في الاستجابة للجرعة. القيم luciferase المراسل يحدد الخط الأساسي ونتائج الاستجابة للجرعة (تمرير أو تفشل) لمدة 48 أو / الرائحة أزواج اختياره من الشاشة. ل30 زوجا اختبارها في الشاشة مرتين، يتم تضمين كل القيم luciferase المراسل يحدد الخط الأساسي.

يتم ترميز هوية الرائحة بواسطة حاسة الشم أنماط تنشيط مستقبلات، ولكن من المعروف أنماط تنشيط مستقبلات، بما في ذلك المستقبلات التي يتم تنشيطها وإلى أي درجة، لأقل من 6٪ من المستقبلات الشمية الإنسان ^1-11. تم بذل جهود لتوصيف المستقبلات الشمية محدودة بسبب الأساليب كثيفة العمالة أو تطبيق لمجموعة فرعية فقط من حاسة الشم ^{17،23،24،33،34} عائلة مستقبلات. نظام تعبير مغايرة Hana3A يدعم تعبير قوي من غالبية المستقبلات الشمية اختبارها، ويمكن استخدامها جنبا إلى جنب مع نظام مراسل luciferase المخيم استجابة لرصد تنشيط مستقبلات الشمية ^19،26،27. أداء هذا الاختبار في شكل 96 جيدا تدعم عددا من الإنتاجية العالية التصاميم التجريبية، بما في ذلك شاشات لتحديد المرشحين المحتملين للأزواج الرائحة / حاسة الشم ومستقبلات منحنيات الاستجابة للجرعة لتأكيد التفاعلات وتقييم مدى مستويات تنشيط مستقبلات هي بالعربيةالمصابة عن طريق الاختلافات البينية والمشتركة بين محددة. أزواج الرائحة / مستقبلات مع القيم النشاط العالي في شاشة هم أكثر عرضة ليبرهن على وجود استجابة كبيرة الجرعة. وتشير هذه البيانات إلى أن هذه الطريقة قادرة على فحص إثراء للأزواج الرائحة / مستقبلات التي سيمر الاستجابة للجرعة، مما يسهل تحديد بروابط الرائحة وحاسة الشم أنماط تنشيط مستقبلات.

نجاح هذا الاختبار الأمثل لتحليل مستقبلات حاسة الشم تعتمد على عدة عوامل. يجب أن يكون مستعدا جميع الحمض النووي البلازميد عبر بروتوكول خالية من الذيفان الداخلي. متسقة حاسة الشم التعبير مستقبلات على سطح الخلية أمر بالغ الأهمية. خط الخلية Hana3A عن ثابت العديد من البروتينات التي تساعد في ملحق أو التعبير، ولكن شارك في ترنسفكأيشن من RTP1S وM3-R يعزز التعبير مستقبلات والتنشيط، على التوالي ^27. هذا المزيج من الإكسسوارات التعبير البروتين النتائج في التعبير موثوق بها معظم المستقبلات الشمية، والسماح للcomparisoن من بين التجارب أو التنشيط والمستقبلات. بالإضافة إلى ذلك، رصد الخلية confluency المهم للحصول على نتائج متسقة. على افتراض الخلايا في الاصل 10 سم ² وطبق ما يقرب من 100٪ متموجة، بعد أن بروتوكول الموصوفة هنا يؤدي إلى الخلية confluency موثوقة في كافة مراحل التجربة. الأهم من ذلك، سيتم مطلي خلايا كافية للحصول على القراءة luciferase المراسل قابلة للقياس، ولكن لن يتم الإفراط في نمت الخلايا، وهو الشرط الذي قد يؤثر على تنشيط مستقبلات الرائحة بعد التحفيز. تطبيع للضوابط التأسيسية renilla التعبير ليس فقط لمزيد من كثافة الخلية، ولكن أيضا لتحقيق الكفاءة ترنسفكأيشن. A luciferase المراسل renilla قراءة أكثر من 2.5 الانحرافات المعيارية أقل من المتوسط ​​قد يشير إلى فقدان الخلية. وينبغي مطلي الخلايا بشكل موحد لتجنب ويحات الكثيفة التي فصل أكثر سهولة من سطح لوحة من الخلايا تناثرا، وينبغي أن يضاف ترنسفكأيشن والرائحة حلول بلطف إلى جانب البئر لتجنب فصل سلليرة سورية. يمكن أن يكون فقدان الخلية أيضا بسبب موت الخلايا الناجمة عن سمية الرائحة، وهي المشكلة التي يمكن التحايل عليها من خلال خفض تركيز الرائحة، أو DMSO المفرطة، والتي يمكن تجنبها عن طريق الحفاظ على تركيزات DMSO أقل من 0.5٪. أخيرا، وعلاج كل سكان الخلية، معربا عن مستقبلات مع 1 ميكرومتر forskolin، وهي محلقة المنشط الذي يسبب أدينيليل مراسل luciferase التعبير من المروج مخيم استجابة، يمكن أن تكون بمثابة مراقبة إيجابية للمقايسة.

على الرغم من أن الفحص الموصوفة هنا يمثل تحسنا عن طرق بديلة، بما في ذلك تنسيق الإنتاجية العالية وأكثر من ذلك تطبيقها بصفة عامة على مستقبلات حاسة الشم الأسرة الثدييات، له حدود. أولا، في المختبر لدينا فحص يفتقر كثير من مكونات نظام حاسة الشم في الجسم الحي، بما في ذلك البروتينات ملزمة الرائحة، وهي طبقة مخاطية، والجزيئات داخل الخلايا والسلوكيات استنشاق. الثانية، ويعتمد هذا الأسلوب على نظام مراسل luciferase لقياس مستقبلات حاسة الشموعلى النقيض من تفعيل الطرق البديلة شيوعا التي تستخدم التصوير الكالسيوم. الأعمال الأخيرة تشير إلى أن هاتين الطريقتين يمكن أن تنتج نتائج متضاربة؛ في الواقع، عدد قليل من المستقبلات الشمية لرد على الرائحة خاصة عندما درست عن طريق التصوير الكالسيوم ولكن لا مقايسة luciferase المراسل ^41. إذا كان واحد نوع الاختبار هو أكثر ملاءمة لدراسات الإدراك حاسة الشم الإنسان لا يزال غير واضح، ولكن كلتا الطريقتين يمكن أن تكون مفيدة اعتمادا على السياق ونوع مستقبلات. الثالث، في حين أن هذا النظام التعبير وظيفية وقد تم بنجاح المستخدمة للتعبير عن غالبية المستقبلات الشمية اختبار الثدييات، قد لا تكون بعض نسب الأرجحية قابلة للتعبير باستخدام هذا النظام. إذا فشلت المستقبلات uncharacterized سابقا للرد على رائحة، فإنه قد يكون راجعا إلى عدم التعبير على سطح الخلية بدلا من عدم وجود تفاعل بين الرائحة ومستقبلات. يمكن فحص الخلايا مستقبلات التعبير عبر سطح المناعي قبل استخلاص الاستنتاجات من فحص النتائج السلبية ^27،42 . أخيرا، وذلك بسبب خلفية منخفضة luciferase النشاط في ظروف لا رائحة، لم يتم تصميم مقايسة لدينا للكشف عن الردود المثبطة. لتحديد مضادات مستقبلات حاسة الشم رائحة ^ل38،39، يجب أولا حفز معظم المستقبلات مع رائحة من أجل مراقبة انخفاض في luciferase النشاط.

على الرغم من هذه القيود، وهذا النظام مقايسة لديه القدرة على زيادة كبيرة في الحصول على البيانات في مجال الشم. الأول، تنسيق عالية الإنتاجية 96 جيدا يجعل مستقبلات و / أو رائحة شاشات نطاق واسع ممكنا. الثانية، نظام تعبير مغايرة تنطبق على مجموعة متنوعة من المستقبلات الشمية الثدييات. الثالث، luciferase النشاط يمكن استخدامها لقياس تنشيط مستقبلات حاسة الشم، الذي هو قيمة في وصف أنماط تنشيط مستقبلات الرائحة لخاص. الرابع، النتائج السابقة من أنظمة مماثلة في المختبر فحص حاسة الشم التنبؤ تصور الإنسان ^8،11،35. هذه الخصائص هي particالمهم ularly نظرا لحجم كبير من مستقبلات الشم الأسرة الثدييات والمعرفة المحدودة لدينا بخصوص أو أنماط التنشيط التي تسببها الروائح محددة. والتطبيق الواسع لهذا النظام الفحص الأمثل لتحليل مستقبلات حاسة الشم تسهم في صورة أكثر شمولا للمستقبلات الشمية / التفاعل الرائحة والأساس الجزيئي للرائحة الترميز.

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

وأيد هذا العمل من قبل R01 DC013339، R03 DC011373، وروث L. كيرشتاين خدمة القومي للبحوث جائزة T32 DC000014. تم تنفيذ جزء من العمل باستخدام مونيل حسي كيميائي مستقبلات الإشارات الأساسية، الذي تدعمه، في جزء منه، من خلال تمويل من P30 DC011735 NIH-NIDCD الأساسية غرانت. المؤلفين أشكر C. Sezille للمساعدة في جمع البيانات.