Çalışma, LDLR nakavt farelerin aort arkında ve kökünde aterosklerotik lezyon gelişimini araştırır ve ateroskleroz şiddeti plak bileşimini değerlendirmek için izolasyon, boyama ve analiz için bir protokol sunar. Bu çalışmada kullanılan histolojik incelemenin yanı sıra, aterosklerozu değerlendirmek için pratik teknikler arasında biyokimyasal belirteçler, moleküler biyoloji testleri ve vasküler ultrason da bulunmaktadır. Diseksiyon prosedürünün hassasiyeti, aterosklerozun fare modelinde in vivo aort sıyırma işleminde en büyük teknik engeli oluşturmaktadır.
Başlamak için, ötenazi yapılmış fareleri bir ila iki kat emici kağıtla kaplı bir köpük levha üzerine sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Vücudu stabilize etmek için uzuvları pimlerle sabitleyin. Kürkü temizlemek ve nemlendirmek için farelerin karnına %75 etanol püskürtün.
Farenin ventral derisini kavramak için forseps kullanın. Daha sonra ince bir makas kullanarak cildi karın tabanından boynun üstüne kadar kesin. Karın duvarını açın ve sternumu kaldırmak için forseps kullanın.
Göğüs boşluğunu ortaya çıkarmak için hem diyaframı hem de kaburgaları kesin. Karotis arterlerin temizlenmesini kolaylaştırmak için yemek borusunu ve trakeayı çıkarın. Böbrekleri ve abdominal aortu korurken karaciğer, akciğerler, dalak, gastrointestinal sistem ve pankreas gibi organları dikkatlice çıkarın.
Mezenterik arterleri diseksiyon yaparken, bağırsakları kaldırın ve hasarı önlemek için aorttan kesiler yapın. Şimdi, net bir gözlem alanı sağlamak için fareyi stereo mikroskop altına yerleştirin ve soğuk bir ışık kaynağını diseksiyon alanıyla hizalayın. PBS ile doldurulmuş 10 mililitrelik bir şırınga kullanarak, sol ventrikül apeksine bir iğne ile yavaşça enjekte edin ve aortun genişlemesini gözlemleyin.
Görüş alanını tamamen ortaya çıkarmak için diseksiyon alanındaki kan ve sıvıyı kağıt mendille nazikçe silin. Daha sonra, torasik aortun diyafram segmentini forseps ile kavrayın ve aort ile torasik kas duvarı arasındaki bağ dokusunu kesmek için yaylı makas kullanın. Kalbi forseps ile yavaşça çekin ve torasik aortu kaldırın.
Aort arkının dallarını gözlemleyin ve aort arkının etrafındaki adventisyel yağ ve bağ dokusunu ve dallarını torasik aort boyunca yukarı doğru inceleyin. Abdominal aortu ve ortak iliak arterleri torasik aort boyunca aşağı doğru diseke edin. Kalp dokusunu kesin ve kalbin alt yarısını kulakçıklara paralel bir düzlem boyunca kesin ve kesilmiş kalbi uygun bir saklama ortamına yerleştirin.
Aort arkını incelemeden önce, kontrast oluşturmak için altına küçük, koyu renkli bir conta yerleştirin. Aort arkı bölgesinin bir fotoğrafını çekin. Ortak iliak arterleri çatallanmalarının bir ila iki milimetre altında kesin ve aortun küçük dallarını omurga boyunca serbest bırakmak için kesin.
Böbreklerin yakınındaki renal arterleri ayırdıktan sonra, boyundaki üç dal damarını distal uçlarından kesin. Son olarak, kalbe yakın çıkan aortu kesin. Önceden 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpünde bir mililitre% 4 paraformaldehit çözeltisi hazırlayın.
Aortu hazırlanan tüpe yerleştirin ve en az 24 saat oda sıcaklığında sabitleyin. Daha sonra, kurumasını önlemek için aortu PBS içeren bir Petri kabına aktarın. Stereo mikroskop altında, plak nicelemesindeki paraziti azaltmak için forseps ve yaylı makas kullanarak kalan advential yağları dikkatlice çıkarın.
Yaylı makas kullanarak, aortu iç uzunlamasına ekseni boyunca dikkatlice kesin. Sırayla, aort kemerinin üç dalını lateral taraf boyunca aort kemerinin eğrilik seviyesine kadar kesin ve tamamen yayılmasına izin verin. Bu aşamada ya Yağ Kırmızısı O boyamaya devam edin ya da aortu ileride analiz etmek üzere %4 paraformaldehit içinde saklayın.
Kesilmiş açık aortu altı oyuklu bir plakaya yerleştirin. Her kuyucuğa bir mililitre steril çift damıtılmış su ekleyin ve bir çalkalayıcı üzerinde beş dakika yıkayın. Altı kuyulu plakayı bir çeker ocak içine yerleştirin ve görünür filigran kalmayana kadar 20 dakika havayla kurutun.
Her kuyucuğa bir mililitre taze hazırlanmış Yağ Kırmızısı O çalışma çözeltisi ekleyin. Plakayı 20 dakika çalkaladıktan sonra, Yağ Kırmızısı O çözeltisini kuyulardan çıkarın. Her kuyucuğa iki mililitre steril çift damıtılmış su ekleyin ve beş dakika yıkayın.
Üç yıkamadan sonra aortu çift damıtılmış suda tutun. Aortu bir slayta aktarın ve kontrastı artırmak için slaytın altına siyah bir lastik ped koyun. Stereo mikroskop altında görüntülerken aortu yayın.
Şimdi, kontrastı daha da artırmak için slaydı beyaz bir kağıda yerleştirin. Slaytın yanına bir cetvel yerleştirin ve bir kamera kullanarak bir fotoğraf çekin. Tedavi edilen aortu nemli tutmak için bir mililitre PBS içeren 1.5 mililitrelik bir santrifüj tüpünde saklayın.
Batı tarzı diyetle beslenen LDLR nakavt farelerin vücut ağırlıkları, chow diyeti ile beslenenlere göre önemli ölçüde artmıştır. Plazma trigliserid ve total kolesterol düzeyleri Western tarzı diyet grubunda kontrol grubuna göre anlamlı olarak daha yüksekti. Aort Yağı Kırmızı O boyaması, Batı tarzı diyetle beslenen LDLR nakavt farelerin arterlerinde, yemek diyeti uygulayanlara kıyasla ciddi lipid birikimi gösterdi.
Artmış lipid birikintileri daha şiddetli aterosklerotik lezyonlarla korelasyon gösterdi. Aort kökü lezyonel alanı ve nekrotik çekirdek, Batı diyetiyle beslenen farelerde, yemekle beslenen farelere kıyasla anlamlı olarak daha büyüktü. Aort kök lezyonel alanının ve nekrotik alanın nicelleştirilmesi, Batı diyetinin LDLR nakavt farelerde aterosklerotik plak oluşumunu şiddetlendirdiğini doğruladı.
