O estudo investiga o desenvolvimento de lesões ateroscleróticas no arco aórtico e na raiz de camundongos knockout para LDLR, oferecendo um protocolo de isolamento, coloração e análise para avaliar a composição da placa de gravidade da aterosclerose. Além do exame histológico utilizado neste estudo, as técnicas práticas para avaliar a aterosclerose também incluem marcadores bioquímicos, testes de biologia molecular e ultrassonografia vascular. A precisão do procedimento de dissecção representa o maior obstáculo técnico na realização da remoção aórtica in vivo dentro do modelo de aterosclerose em camundongos.
Para começar, coloque os camundongos sacrificados em decúbito dorsal em uma placa de espuma coberta com uma a duas camadas de papel absorvente. Fixe os membros com pinos para estabilizar o corpo. Pulverize 75% de etanol sobre o abdômen dos camundongos para limpar e umedecer o pelo.
Use uma pinça para agarrar a pele ventral do camundongo. Em seguida, usando uma tesoura fina, corte a pele da base do abdômen até o topo do pescoço. Abra a parede abdominal e use uma pinça para levantar o esterno.
Corte o diafragma e as costelas para expor a cavidade torácica. Remova o esôfago e a traqueia para facilitar a limpeza das artérias carótidas. Remova cuidadosamente os órgãos, incluindo fígado, pulmões, baço, trato gastrointestinal e pâncreas, preservando os rins e a aorta abdominal.
Ao dissecar as artérias mesentéricas, levante os intestinos e faça incisões longe da aorta para evitar danos. Agora, posicione o mouse sob um microscópio estéreo para fornecer um campo de observação claro e alinhe uma fonte de luz fria com a área de dissecação. Usando uma seringa de 10 mililitros cheia de PBS, injete lentamente no ápice do ventrículo esquerdo com uma agulha e observe a dilatação da aorta.
Limpe suavemente o sangue e o fluido na área de dissecção com papel de seda para expor totalmente o campo de visão. Em seguida, segure o segmento diafragmático da aorta torácica com uma pinça e use uma tesoura de mola para cortar o tecido conjuntivo entre a aorta e a parede do músculo torácico. Puxe suavemente o coração com uma pinça e levante a aorta torácica.
Observe os ramos do arco aórtico e disseque a gordura adventícia e o tecido conjuntivo ao redor do arco aórtico e seus ramos para cima ao longo da aorta torácica. Disseque a aorta abdominal e as artérias ilíacas comuns para baixo ao longo da aorta torácica. Apare o tecido cardíaco e corte a metade inferior do coração ao longo de um plano paralelo aos átrios e coloque o coração aparado em um meio de armazenamento adequado.
Antes de dissecar o arco aórtico, coloque uma pequena junta de cor escura embaixo dele para criar contraste. Tire uma fotografia da área do arco aórtico. Corte as artérias ilíacas comuns um a dois milímetros abaixo de sua bifurcação e apare os pequenos ramos da aorta ao longo da coluna para liberá-la.
Depois de desprender as artérias renais perto dos rins, corte os três vasos ramificados do pescoço de suas extremidades distais. Finalmente, corte a aorta ascendente perto do coração. Prepare um mililitro de solução de paraformaldeído a 4% em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro com antecedência.
Coloque a aorta no tubo preparado e fixe-a em temperatura ambiente por pelo menos 24 horas. Em seguida, transfira a aorta para uma placa de Petri contendo PBS para evitar que seque. Sob um microscópio estéreo, remova cuidadosamente qualquer gordura adventícia remanescente usando uma pinça e uma tesoura de mola para reduzir a interferência na quantificação da placa.
Usando uma tesoura de mola, corte cuidadosamente a aorta ao longo de seu eixo longitudinal interno. Sequencialmente, abra os três ramos do arco aórtico ao longo do lado lateral até o nível da curvatura do arco aórtico, permitindo que ele se espalhe completamente. Nesta fase, prossiga com a coloração Oil Red O ou armazene a aorta em paraformaldeído a 4% para análise futura.
Coloque a aorta aberta cortada em uma placa de seis poços. Adicione um mililitro de água bidestilada estéril a cada poço e lave por cinco minutos em uma coqueteleira. Coloque a placa de seis poços em uma capela e seque ao ar por 20 minutos até que não haja marcas d'água visíveis.
Adicione um mililitro de solução de trabalho Oil Red O recém-preparada a cada poço. Depois de agitar a placa por 20 minutos, remova a solução de óleo vermelho O dos poços. Adicione dois mililitros de água estéril bidestilada a cada poço e lave por cinco minutos.
Após três lavagens, mantenha a aorta em água bidestilada Transfira a aorta para um slide e coloque uma almofada de borracha preta embaixo do slide para aumentar o contraste. Espalhe a aorta enquanto visualiza sob o microscópio estéreo.
Agora, coloque o slide em um papel branco para aumentar ainda mais o contraste. Posicione uma régua ao lado do slide e adquira uma fotografia usando uma câmera. Armazene a aorta tratada em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro contendo um mililitro de PBS para mantê-la úmida.
Os pesos corporais dos camundongos knockout para LDLR alimentados com uma dieta de estilo ocidental aumentaram significativamente em comparação com aqueles alimentados com a dieta chow. Os níveis plasmáticos de triglicerídeos e colesterol total foram significativamente maiores no grupo de dieta de estilo ocidental do que no grupo controle. A coloração com óleo aórtico Red O mostrou acúmulo severo de lipídios nas artérias de camundongos knockout para LDLR alimentados com a dieta de estilo ocidental em comparação com aqueles em uma dieta de ração.
O aumento dos depósitos lipídicos correlacionou-se com lesões ateroscleróticas mais graves. A área lesional da raiz da aorta e o núcleo necrótico foram significativamente maiores em camundongos alimentados com dieta ocidental em comparação com camundongos alimentados com ração chow. A quantificação da área lesional da raiz da aorta e da área necrótica confirmou que a dieta ocidental exacerbou a formação de placa aterosclerótica em camundongos knockout para LDLR.
