Araştırmamız, kistik fibroz hastalarında akciğer enfeksiyonlarını çoğaltmak için yapay balgamda bir agrega biyofilm modeli geliştirmektedir. Bu model, gen ekspresyonu değişikliklerini analiz etmemize ve bakterilerin standart ilaç test ortamlarına kıyasla bu koşullarda neden terapötiklere karşı daha dirençli hale geldiğini anlamamıza olanak tanır. Karmaşık bir biyofilm modeli geliştirmek, düşmanca akciğer ortamını özetlemenin zorluklarını vurguladı ve in vitro antimikrobiyal etkilerin in vivo sonuçlarla uyumlu olup olmadığını tahmin etmeyi zorlaştırdı.
KF akciğer enfeksiyonlarının hastaya özgü doğası, antimikrobiyallerin test edilmesi için etkili laboratuvar modellerinin geliştirilmesini daha da karmaşık hale getirmektedir. Bu araştırma boyunca, antimikrobiyalleri gerçekçi bir ortamda test etmek için bir platform sağlayan, bu biyofilmlerde gözlemlenebilecek direnç seviyesini gösteren ve aljinat gibi bileşenleri hedef alan anti-virülans tedavilerinin potansiyelini vurgulayan bir polimikrobiyal agrega biyofilm modelini başarıyla oluşturduk. KF akciğer ortamını taklit etmek için tasarlanmış bir antimikrobiyal test modeline sahip olmak, in vivo ve in vitro testler arasında var olan boşluğu dolduracaktır.
Ayrıca, KF akciğerini daha yakından taklit eden bir ortamda bakteri viromunun değerlendirilmesi, anti-virülans terapötiklerinin geliştirilmesine ve test edilmesine izin verecektir. Başlamak için, donmuş boncuk stok kültürlerinden lizojeni et suyu burgusu üzerine tek bir pseudomonas aeruginosa PAO1 boncuğu sürün. Plakayı 37 santigrat derecede 24 saat inkübe edin.
Tek tür biyofilm hazırlığı için, çizgi plakasından tek bir koloni ile gece boyunca pseudomonas aeruginosa PAO1 kültürlerini hazırlayın ve gece boyunca 18 saat boyunca inkübe edin. Daha sonra, kültürü 600 nanometrede 0.05'lik bir optik yoğunluğa seyreltin, bu da mililitre başına 8 koloni oluşturan birimin gücüne 1 çarpı 10'a eşdeğerdir. Ayrıca, bu kültürü SCFM2 ortamında 1 ila 100 oranında seyreltin.
Daha sonra, yuvarlak tabanlı 96 oyuklu bir mikrotitre plakasının kuyucuklarına 180 mikrolitre aşı ekleyin. 24 saat boyunca dakikada 75 devirde sallarken plakayı 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha önce gösterildiği gibi donmuş boncuk stok kültürlerinden pseudomonas aeruginosa PAO1 ve staphylococcus aureus SH1000'i canlandırın.
Candida albican CAF 2.1'i sabouraud dekstroz agar üzerine tek bir boncuk çizgisi olarak canlandırın ve plakaları 37 santigrat derecede 24 saat inkübe edin. Staphylococcus aureus ve candida albicans'ın gece boyunca kültürlerini 5 mililitre lizojeni et suyunda kendi çizgi plakalarından tek kolonilerle hazırlayın. SCFM2'de gerekli konsantrasyonlarda her iki türü de içeren tek bir aşı oluşturmak için standartlaştırılmış kültürleri seyreltin.
Daha sonra, 96 oyuklu bir mikrotitre plakasının kuyucuklarına 162 mikrolitre karışık inokülum ekleyin. Çok türlü biyofilmlerin oluşumuna izin vermek için 24 saat boyunca dakikada 75 devirde sallarken plakayı 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, hazırlanan gece boyunca pseudomonas aeruginosa kültüründen 14.2 mikrolitreyi 96 oyuklu mikrotitre plakasının kuyucuklarına ekleyin ve polimikrobiyal biyofilm oluşumuna izin vermek için plakayı tekrar inkübe edin.
Başlamak için, 96 oyuklu mikrotitre plakalarında tek tür ve çok tür biyofilmler elde edin. Biyofilmi bozmak için, biyofilmleri içeren kuyucuklara doğrudan 8.81 mikrolitre DNase 1 stoğu ekleyin ve mililitre başına 50 mikrogramlık bir nihai konsantrasyon elde edin. Plakayı dakikada 75 devirde sallarken 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin.
Mililitre başına 2.56 miligramda bir antibiyotik stok meropenem çözeltisi elde edin. Mililitre başına 0.01 miligram ila mililitre başına 2.56 miligram konsantrasyon aralığı elde etmek için iki kat seri seyreltme gerçekleştirin. Şimdi, biyofilmlere her miropenem seyreltmesinden 20 mikrolitre ekleyin ve mililitre başına 1 mikrogram ila mililitre başına 256 mikrogram arasında bir dozaj aralığı elde edin.
96 oyuklu mikrotitre plakasını şeffaf filmle kapatın ve dakikada 75 devir sallarken 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Tek tür pseudomonas biyofilmleri, mililitre başına 256 mikrograma kadar herhangi bir dozajda meropenem ile tedavi edildiğinde canlı hücrelerde önemli bir azalma göstermedi. Pseudomonas aeruginosa geri kazanımı, tek tür ortamlarında antibiyotiksiz polimikrobiyal ortamlara göre mililitre başına 0.74 log 10 koloni oluşturan birim daha yüksekti.
Başlamak için, RNA ekstraksiyonu için tek tür ve çok tür biyofilmleri hazırlayın. İnkübasyondan sonra, biyofilmleri her bir oyuktan bir mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarın ve her numune için biyofilm kopyalarını bir araya getirin. Tüpü beş dakika boyunca 16.000 G'de santrifüjleyin.
RNA ekstraksiyonu daha sonra yapılırsa, süpernatanı çıkarın ve peleti 80 santigrat derecede 250 mikrolitre RNA stabilizasyon solüsyonunda saklayın. Daha sonra, tüpü oda sıcaklığında pelet ile çözdürün ve beş dakika boyunca 16.000 G'de santrifüjleyin. Peleti 600 mikrolitre TRIzol reaktifi içinde yeniden süspanse edin ve iki mililitrelik bir şırıngaya bağlı 0,2 milimetrelik bir iğne kullanarak, 5 ila 10 kez aspire ederek veya pelet tamamen bozulana kadar manuel olarak parçalayın.
RNA'yı bozulmuş biyofilmlerden arındırmak için üreticinin yönergelerini izleyin. Saflaştırılmış RNA'yı ölçmek için, çalışma solüsyonunu her numune için 199 mikrolitre tampon ve bir mikrolitre reaktif ile hazırlayın. 190 mikrolitre çalışma solüsyonunu ve 10 mikrolitre standart bir ve standart ikiyi ayrı tüplere karıştırın.
Ardından, 199 mikrolitre çalışma solüsyonu ve 1 mikrolitre RNA örneğini ayrı tüplere ekleyin. 30 saniye boyunca girdap yapın ve beş dakika boyunca karanlık bir yerde saklayın. Ardından, florimetrede RNA'yı ve ardından Geniş Aralık RNA'yı seçin ve ekrandaki talimatları izleyin.
Boş okumayı aldıktan sonra, spektrofotometrenin numune tutucusuna bir mikrolitre RNA pipetleyin ve absorbansı 260 x 280 nanometrede ölçün. Ücretsiz DNA sentezi için, reaksiyon karışımını tüplerde hazırlayın. Tüpleri bir termal döngüleyiciye yerleştirin ve programı çalıştırın.
CDNA'yı hemen kullanın veya 80 santigrat derecede saklayın. Tek tür pseudomonas aeruginosa biyofilmlerinde algD ekspresyonu meropenem konsantrasyonları arasında önemli ölçüde değişmedi. Polimikrobiyal biyofilmlerde, algD ekspresyonu mililitre başına 256 mikrogramda önemli ölçüde daha yüksekti, bu da birlikte kolonileşen organizmaların varlığında aljinat üretiminin arttığını gösteriyor.
