私たちの研究では、嚢胞性線維症患者の肺感染症を再現するために、人工喀痰中の凝集体バイオフィルムモデルを開発しています。このモデルにより、遺伝子発現の変化を解析し、標準的な薬物試験環境と比較して、これらの条件下で細菌が治療薬に対してより耐性を持つ理由を理解することができます。複雑なバイオフィルムモデルの開発により、敵対的な肺環境を再現することの課題が浮き彫りになり、in vitroの抗菌効果がin vivoの結果と一致するかどうかを予測することが困難になっています。
CF肺感染症の患者特有の性質は、抗菌薬を試験するための効果的な実験室モデルの開発をさらに複雑にします。この研究を通じて、私たちは、現実的な環境で抗菌薬をテストするためのプラットフォームを提供し、これらのバイオフィルムで観察できる耐性のレベルを示し、アルギン酸などの成分を標的とする抗病原性療法の可能性を強調する多微生物凝集体バイオフィルムモデルの作成に成功しました。CF肺環境を模倣するように設計された抗菌試験モデルを持つことで、in vivo試験とin vitro試験の間に存在するギャップを埋めることができます。
さらに、CF肺により密接に模倣された環境内の細菌のウイルス性を評価することで、抗病原性治療薬の開発と試験が可能になります。まず、凍結ビーズストック培養物から緑膿菌PAO1の1つのビーズをリソジェニーブロスオーガーにストリークします。プレートを摂氏37度で24時間インキュベートします。
単一種のバイオフィルム調製では、緑膿菌PAO1のストリークプレートからの単一コロニーで一晩培養し、18時間一晩インキュベートします。次に、培養物を600ナノメートルで0.05の光学密度に希釈し、10の10の1ミリメートルあたり8コロニー形成単位の累乗に相当します。さらに、この培養物をSCFM2培地で1〜100に希釈します。
次に、丸底の96ウェルマイクロタイタープレートのウェルに180マイクロリットルの接種材料を追加します。プレートを摂氏37度でインキュベートし、毎分75回転で24時間振とうします。前述したように、凍結ビーズストック培養物から緑膿菌PAO1および黄色ブドウ球菌SH1000を復活させます。
カンジダ・アルビカンCAF 2.1を1本のビーズストリークとしてサブローデキストロース寒天培地に蘇生させ、プレートを摂氏37度で24時間インキュベートします。黄色ブドウ球菌とカンジダ・アルビカンスの培養物を、それぞれのストリークプレートから5ミリリットルのリゾジェニーブロスに単一のコロニーで一晩培養します。標準化された培養物を希釈して、SCFM2に必要な濃度で両方の種を含む単一の接種物を形成します。
次に、162マイクロリットルの混合接種物を96ウェルマイクロタイタープレートのウェルに加えます。プレートを摂氏37度でインキュベートし、毎分75回転で24時間振とうして、多種バイオフィルムの形成を可能にします。次に、調製した緑膿菌の一晩培養液14.2マイクロリットルを96ウェルマイクロタイタープレートのウェルに加え、プレートを再度インキュベートして、多微生物バイオフィルムの形成を可能にします。
まず、96ウェルマイクロタイタープレートで単一種および多種のバイオフィルムを取得します。バイオフィルムを破壊するには、バイオフィルムを含むウェルに8.81マイクロリットルのDNase 1ストックを直接追加し、ミリリットルあたり50マイクログラムの最終濃度を達成します。プレートを摂氏37度で1時間インキュベートし、毎分75回転で振とうします。
メロペネムの抗生物質原液を2.56ミリグラム/ミリリットルで入手します。2倍に段階希釈を行い、0.01ミリグラム/ミリリットルから2.56ミリグラム/ミリリットルの濃度範囲を達成します。次に、各ミロペネム希釈液を20マイクロリットルをバイオフィルムに追加し、1ミリリットルあたり1マイクログラムからミリリットルあたり256マイクログラムの投与量範囲を達成します。
96ウェルマイクロタイタープレートを透明フィルムで密封し、37°Cで24時間インキュベートし、毎分75回転振とうします。単一種のシュードモナスバイオフィルムは、ミリリットルあたり最大256マイクログラムの用量でメロペネムで処理した場合、生存細胞の有意な減少を示さなかった。緑膿菌の回収率は0.74 log 10コロニー形成単位/ミリリットルであり、抗生物質を使用しない多微生物環境よりも単一種の設定で高かった。
まず、RNA抽出用の単一種および複数種のバイオフィルムを調製します。インキュベーション後、各ウェルからバイオフィルムを1ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移し、バイオフィルムを各サンプルに複製します。チューブを16, 000 Gで5分間遠心分離します。
後でRNA抽出を行う場合は、上清を取り除き、ペレットを250マイクロリットルのRNA安定化溶液に摂氏80度で保存します。その後、ペレットでチューブを室温で解凍し、16, 000 Gで5分間遠心分離します。ペレットを600マイクロリットルのTRIzol試薬に再懸濁し、2ミリリットルのシリンジに取り付けられた0.2ミリメートルの針を使用して、5〜10回吸引するか、ペレットが完全に破壊されるまで手動で破壊します。
メーカーのガイドラインに従って、破壊されたバイオフィルムからRNAを精製します。精製されたRNAを定量するには、各サンプルにつき199マイクロリットルのバッファーと1マイクロリットルの試薬を使用して作業溶液を調製します。190マイクロリットルの作業溶液と10マイクロリットルの標準溶液と標準2リットルを別々のチューブに混合します。
次に、199マイクロリットルの作業溶液と1マイクロリットルのRNAサンプルを個々のチューブに加えます。30秒間渦巻き、暗い場所に5分間保管します。次に、蛍光計で「RNA」、「Broad Range RNA」の順に選択し、画面に表示される指示に従います。
ブランク読み取りを行った後、1マイクロリットルのRNAを分光光度計のサンプルホルダーにピペットで移し、260×280ナノメートルの吸光度を測定します。相補的なDNA合成のために、反応ミックスをチューブで調製します。チューブをサーマルサイクラーに入れ、プログラムを実行します。
CDNAはすぐに使用するか、摂氏80度で保管してください。単一種の緑膿菌バイオフィルムにおけるalgD発現は、メロペネム濃度間で有意に変化しませんでした。ポリマイクロバイオフィルムでは、algDの発現は256μg/millと有意に高く、共コロニー形成生物の存在下でアルギン酸産生が増加したことを示しています。
