Nuestra investigación desarrolla un modelo de biofilm agregado en esputo artificial para replicar infecciones pulmonares en pacientes con fibrosis quística. Este modelo nos permite analizar los cambios en la expresión génica y comprender por qué las bacterias se vuelven más resistentes a las terapias en estas condiciones en comparación con los entornos estándar de pruebas de fármacos. El desarrollo de un modelo de biopelícula complejo ha puesto de manifiesto los desafíos de recapitular el entorno pulmonar hostil, lo que dificulta la predicción de si los efectos antimicrobianos in vitro se alinean con los resultados in vivo.
La naturaleza específica del paciente de las infecciones pulmonares por FQ complica aún más el desarrollo de modelos de laboratorio eficaces para probar los antimicrobianos. A lo largo de esta investigación, hemos creado con éxito un modelo de biopelícula de agregados polimicrobianos, que proporciona una plataforma para probar antimicrobianos en un entorno realista, muestra el nivel de resistencia que se puede observar en estas biopelículas y destaca el potencial de las terapias antivirulencia dirigidas a componentes como el alginato. Contar con un modelo de pruebas antimicrobianas diseñado para imitar el entorno pulmonar de la FQ cerrará la brecha que existe entre las pruebas in vivo e in vitro.
Además, la evaluación del viroma de las bacterias dentro de un entorno que se asemeja más a un pulmón con FQ permitirá el desarrollo y la prueba de terapias antivirulencia. Para comenzar, escurre una sola cuenta de pseudomonas aeruginosa PAO1 de cultivos de existencias de cuentas congeladas en una barrena de caldo de lisogén. Incubar la placa durante 24 horas a 37 grados centígrados.
Para la preparación de biopelículas de una sola especie, prepare cultivos nocturnos de pseudomonas aeruginosa PAO1 con una sola colonia de la placa de rayas e incube durante la noche durante 18 horas. A continuación, diluir el cultivo hasta una densidad óptica de 0,05 a 600 nanómetros, equivalente a 1 por 10 elevado a la potencia de 8 unidades formadoras de colonias por mililitro. Además, diluya este cultivo de 1 a 100 en medio SCFM2.
A continuación, agregue 180 microlitros del inóculo a los pocillos de una placa de microtitulación de 96 pocillos de fondo redondo. Incubar la placa a 37 grados centígrados mientras se agita a 75 revoluciones por minuto durante 24 horas. Reviva Pseudomonas aeruginosa PAO1 y Staphylococcus aureus SH1000 a partir de cultivos de perlas congelados, como se demostró anteriormente.
Reviva Candida albican CAF 2.1 como una sola raya de perla en agar dextrosa sabouraud e incube las placas durante 24 horas a 37 grados centígrados. Prepare durante la noche cultivos de Staphylococcus aureus y candida albicans con colonias individuales a partir de sus respectivas placas de rayas en 5 mililitros de caldo de lisogén. Diluir los cultivos estandarizados para formar un solo inóculo que contenga ambas especies a las concentraciones requeridas en SCFM2.
Luego, agregue 162 microlitros del inóculo mezclado a los pocillos de una placa de microtitulación de 96 pocillos. Incubar la placa a 37 grados centígrados mientras se agita a 75 revoluciones por minuto durante 24 horas para permitir la formación de biopelículas multiespecie. A continuación, agregue 14,2 microlitros del cultivo preparado durante la noche de Pseudomonas aeruginosa a los pocillos de la placa de microtitulación de 96 pocillos, e incube la placa nuevamente para permitir la formación de biopelículas polimicrobianas.
Para empezar, obtenga biopelículas de una sola especie y de varias especies en placas de microtitulación de 96 pocillos. Para la alteración del biofilm, se deben añadir 8,81 microlitros de caldo de DNasa 1 directamente a los pocillos que contienen los biofilms, logrando una concentración final de 50 microgramos por mililitro. Incubar la placa durante una hora a 37 grados centígrados mientras se agita a 75 revoluciones por minuto.
Obtenga una solución madre antibiótica de meropenem a 2,56 miligramos por mililitro. Realice diluciones en serie por un factor de dos para lograr un rango de concentración de 0,01 miligramos por mililitro a 2,56 miligramos por mililitro. Ahora, agregue 20 microlitros de cada dilución de miropenem a las biopelículas, logrando un rango de dosis de 1 microgramo por mililitro a 256 microgramos por mililitro.
Selle la placa de microtitulación de 96 pocillos con una película transparente e incube a 37 grados centígrados durante 24 horas mientras la agita a 75 revoluciones por minuto. Las biopelículas de pseudomonas de una sola especie no mostraron una disminución significativa en las células viables cuando se trataron con meropenem en cualquier dosis de hasta 256 microgramos por mililitro. La recuperación de Pseudomonas aeruginosa fue de 0,74 log 10 unidades formadoras de colonias por mililitro, mayor en los entornos de una sola especie que en los ambientes polimicrobianos sin antibióticos.
Para empezar, prepare las biopelículas de una sola especie y de varias especies para la extracción de ARN. Después de la incubación, transfiera las biopelículas de cada pocillo a un tubo de microcentrífuga de un mililitro agrupando las réplicas de la biopelícula para cada muestra. Centrifugar el tubo a 16.000 g durante cinco minutos.
Si la extracción de ARN se realiza más tarde, retire el sobrenadante y almacene el pellet en 250 microlitros de solución de estabilización de ARN a 80 grados centígrados. Posteriormente, descongele el tubo con pellet a temperatura ambiente y centrifugue a 16.000 G durante cinco minutos. Vuelva a suspender el pellet en 600 microlitros de reactivo TRIzol y disrumpa manualmente con una aguja de 0,2 milímetros conectada a una jeringa de dos mililitros, aspirando de 5 a 10 veces, o hasta que el pellet esté completamente roto.
Siga las directrices del fabricante para purificar el ARN de las biopelículas interrumpidas. Para cuantificar el ARN purificado, prepare la solución de trabajo con 199 microlitros de tampón y un microlitro de reactivo para cada muestra. Mezcle 190 microlitros de la solución de trabajo y 10 microlitros de estándar uno y estándar dos en tubos separados.
A continuación, añada 199 microlitros de la solución de trabajo y 1 microlitro de la muestra de ARN en tubos individuales. Vortex durante 30 segundos y guárdelo en un lugar oscuro durante cinco minutos. A continuación, en el fluorímetro, seleccione ARN, seguido de ARN de rango amplio y siga las instrucciones en pantalla.
Después de tomar la lectura en blanco, pipetee un microlitro de ARN en el portamuestras del espectrofotómetro y mida la absorbancia a 260 por 280 nanómetros. Para la síntesis complementaria de ADN, prepare la mezcla de reacción en tubos. Coloque los tubos en un termociclador y ejecute el programa.
Use el CDNA inmediatamente o guárdelo a 80 grados centígrados. La expresión de algD en biopelículas de pseudomonas aeruginosa de una sola especie no varió significativamente a través de las concentraciones de meropenem. En las biopelículas polimicrobianas, la expresión de algD fue significativamente mayor a 256 microgramos por mililitro, lo que indica una mayor producción de alginato en presencia de organismos cocolonizadores.
