В рамках нашего исследования разрабатывается модель агрегированной биопленки в искусственной мокроте для репликации инфекций легких у пациентов с муковисцидозом. Эта модель позволяет нам проанализировать изменения экспрессии генов и понять, почему бактерии становятся более устойчивыми к терапии в этих условиях по сравнению со стандартными средами тестирования лекарств. Разработка сложной модели биопленки высветила проблемы, связанные с повторением враждебной среды легких, что затруднило прогнозирование того, согласуются ли антимикробные эффекты in vitro с исходами in vivo.
Специфичный характер инфекций легких при муковисцидозе еще больше усложняет разработку эффективных лабораторных моделей для тестирования противомикробных препаратов. В ходе этого исследования мы успешно создали модель полимикробной агрегированной биопленки, которая обеспечивает платформу для тестирования противомикробных препаратов в реалистичной среде, показывает уровень резистентности, который можно наблюдать в этих биопленках, и подчеркивает потенциал антивирулентной терапии, нацеленной на такие компоненты, как альгинат. Наличие модели для тестирования противомикробных препаратов, разработанной для имитации среды легких при муковисцидозе, позволит преодолеть разрыв, существующий между тестированием in vivo и in vitro.
Кроме того, оценка вирома бактерий в среде, которая более точно имитирует легкие с муковисцидозом, позволит разработать и протестировать антивирулентные терапевтические средства. Для начала нанесите одну бусину Pseudomonas aeruginosa PAO1 из замороженных бусинных культур на шнек для бульона лизогенеза. Инкубируйте тарелку в течение 24 часов при температуре 37 градусов Цельсия.
Для получения одновидовой биопленки в течение ночи готовят культуры pseudomonas aeruginosa PAO1 с одной колонией из полосовой пластины и инкубируют в течение ночи в течение 18 часов. Затем разведите культуру до оптической плотности 0,05 на 600 нанометрах, что эквивалентно 1 умножить на 10 в степени 8 колониеобразующих единиц на миллилитр. Далее разведите эту культуру 1 к 100 в среде SCFM2.
Далее добавьте 180 микролитров посевного материала в лунки 96-луночной микротитровой пластины с круглым дном. Инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия, встряхивая со скоростью 75 оборотов в минуту в течение 24 часов. Оживите Pseudomonas aeruginosa PAO1 и Staphylococcus aureus SH1000 из замороженных культур бусин, как было показано ранее.
Оживите Candida albican CAF 2.1 в виде одной полосы бусины на агаре декстрозы сабуро и инкубируйте планшеты в течение 24 часов при температуре 37 градусов Цельсия. Приготовьте на ночь культуры золотистого стафилококка и Candida albicans с отдельными колониями из их соответствующих полосовых пластин в 5 миллилитрах отвара лизогении. Разбавляют стандартизированные культуры с образованием одного инокулюма, содержащего оба вида в требуемых концентрациях в SCFM2.
Затем добавьте 162 микролитра смешанного посевного материала в лунки 96-луночного микротитровального планшета. Инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия, встряхивая со скоростью 75 оборотов в минуту в течение 24 часов, чтобы обеспечить образование многовидовых биопленок. Далее добавьте 14,2 микролитра подготовленной на ночь культуры Pseudomonas aeruginosa в лунки 96-луночного микротитровального планшета и снова инкубируйте планшет, чтобы дать возможность образования полимикробной биопленки.
Для начала необходимо получить одновидовые и многовидовые биопленки в 96-луночных микротитровальных планшетах. Для разрушения биопленки добавьте 8,81 микролитров запаса ДНКазы 1 непосредственно в лунки, содержащие биопленки, достигнув конечной концентрации 50 микрограммов на миллилитр. Инкубируйте планшет в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия, встряхивая со скоростью 75 оборотов в минуту.
Получить антибиотик в запасе раствор меропенема в дозе 2,56 миллиграмм на миллилитр. Выполняйте серийные разведения в два раза, чтобы достичь диапазона концентраций от 0,01 мг на миллилитр до 2,56 мг на миллилитр. Теперь добавьте по 20 микролитров каждого раствора миропенема в биопленки, достигнув диапазона дозировки от 1 микрограмма на миллилитр до 256 микрограммов на миллилитр.
Запечатайте 96-луночный микротитровальный планшет прозрачной пленкой и инкубируйте его при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов, встряхивая его со скоростью 75 оборотов в минуту. Биопленки одного вида pseudomonas не показали существенного снижения жизнеспособных клеток при обработке меропенемом в любой дозировке до 256 мкг/миллилитр. Восстановление Pseudomonas aeruginosa было на 0,74 log 10 колониеобразующих единиц на миллилитр выше в условиях одного вида, чем в полимикробной среде без антибиотиков.
Для начала подготовьте одновидовые и многовидовые биопленки для экстракции РНК. После инкубации перенесите биопленки из каждой лунки в микроцентрифугу объемом один миллилитр, где биопленка будет воспроизводиться для каждого образца. Центрифугируйте пробирку при 16 000 G в течение пяти минут.
Если экстракция РНК проводится позже, удалите надосадочную жидкость и храните гранулу в 250 микролитрах раствора для стабилизации РНК при температуре 80 градусов Цельсия. Позже разморозьте пробирку с гранулами при комнатной температуре и центрифугируйте при 16 000 G в течение пяти минут. Повторно суспендируйте гранулу в 600 микролитрах реагента TRIzol и вручную разрушьте ее с помощью иглы диаметром 0,2 миллиметра, прикрепленной к двухмиллилитровому шприцу, аспирируя от 5 до 10 раз, или до полного разрушения гранулы.
Следуйте рекомендациям производителя по очистке РНК от разрушенных биопленок. Чтобы количественно определить очищенную РНК, приготовьте рабочий раствор со 199 микролитрами буфера и одним микролитром реагента для каждого образца. Смешайте в отдельные пробирки 190 микролитров рабочего раствора и 10 микролитров стандартного одного и стандартного двух.
Затем добавьте 199 микролитров рабочего раствора и 1 микролитр образца РНК в отдельные пробирки. Вортексируйте в течение 30 секунд и храните в темном месте в течение пяти минут. Затем на флуориметре выберите РНК, а затем «РНК широкого диапазона» и следуйте инструкциям на экране.
После снятия пустого показания пипеткой нанесите один микролитр РНК на держатель образца спектрофотометра и измерьте поглощение на уровне 260 на 280 нанометров. Для комплементарного синтеза ДНК приготовьте реакционную смесь в пробирках. Поместите трубки в термоамплификатор и запустите программу.
Используйте CDNA немедленно или храните ее при температуре 80 градусов Цельсия. Экспрессия algD в биопленках одного вида pseudomonas aeruginosa существенно не варьировала в зависимости от концентрации меропенема. В полимикробных биопленках экспрессия algD была значительно выше и составляла 256 мкг/миллилитр, что указывает на повышенную продукцию альгината в присутствии коколонизирующих организмов.
