Araştırmamız, bir demir oksit nanopartikül platformunda görüntü güdümlü terapötikler kullanarak meme kanseri metastazlarını tedavi etmeye odaklanmaktadır. Amaç, özellikle kansere bağlı ölümlerin ana nedenleri olan metastatik dokulara yönelik etkili tedaviler geliştirmektir. Sistemik terapötiklerin hayvanları kurban etmeden istenen dokuya ulaşıp ulaşmadığını belirlemek zor olabilir.
Nanoparçacıkımız, MRI ve optik görüntüleme modaliteleri kullanılarak görüntülenebilir ve bu da canlı hayvanlarda ilaç dağıtımını ve birikimini izlememize olanak tanır. Metastatik meme kanseri için mevcut tedaviler metastazlara özgü değildir, değişken etkinliğe sahiptir ve istenmeyen yan etkilere neden olur. Nanopartikül platformumuz özellikle metastatik nişi hedefler ve herhangi bir yan etki kanıtı olmaksızın dağıtımının invaziv olmayan bir şekilde izlenmesine izin verir.
Daha önce, bir metastaz itici gücü olan miR-10b'yi hedeflemek için nanoparçacık platformumuzu kullandık ve metastazı ve metastazların büyümesini durdurabildik. Klinik translasyonu göz önünde bulundurarak, tedavi rejimini optimize etmek ve etkinliği en üst düzeye çıkarmak için bu formülasyonun farmakodinamiklerini araştırıyoruz. Başlamak için, matris ekstraktının sıvılaşmasını sağlamak için donmuş Matrigel'i 24 saat boyunca 4 santigrat dereceye koyun.
Çalışma için gerekli olan toplam hücre sayısını belirledikten sonra, hücreleri tripnize edin ve PBS ile yıkayın. Hücreleri 200 G'de 5 dakika santrifüjleyin. Ardından, hücre stoğunu oluşturmak için peleti 500 mikrolitre soğutulmuş PBS'de yeniden askıya alın.
Şimdi, toplam hücre sayısını 40 çarpı 10 ila mililitre başına 6 hücre kuvvetine seyreltin. Daha sonra, 50 mikrolitre başına 6 hücre gücüne 1 kez 10'luk bir nihai konsantrasyon elde etmek için eşit miktarda soğutulmuş matris özü ekleyin. İmplantasyondan önce ekstraktın katılaşmasını önlemek için karışımı buz üzerinde tutun.
Anestezi uygulanmış fareyi bir ısıtma yastığı üzerindeki bir burun konisine aktarın. Anestezi cerrahi düzlemini onayladıktan sonra, gözleri kornea kurumasından korumak için oftalm merhem sürün. Ardından enjeksiyon bölgesinin yakınındaki cildi alkollü bir mendille temizleyin ve birkaç saniye kurumasını bekleyin.
Primer tümör ve yaygın metastaz bölgeleri arasındaki sinyal örtüşmesini en aza indirmek için dört numaralı meme bezini indükleyin. Şimdi, hücreleri yeniden askıya almak için hücre stoğunu yukarı ve aşağı pipetleyin. 50 mikrolitre buz gibi soğuk hücre süspansiyonunu 29 gauge iğne ile bir insülin şırıngasına çekin.
İğne eğimini, farenin gövdesine paralel olarak, istenen meme bezinin meme ucunun hemen altına yerleştirin ve hücreleri sabit, yavaş bir hızda enjekte edin. Matrigel'in katılaşmasını sağlamak ve sızıntıyı önlemek için enjeksiyonu tamamladıktan sonra iğneyi en az 5 saniye ciltte bırakın. Daha sonra, fareyi iyileşme için bir ısıtma pedi üzerindeki temiz bir kafese taşıyın ve tamamen yürüyene ve sternal yaslanmayı koruyabilene kadar denetleyin.
Tümör büyümesini ve metastaz gelişimini izlemek için, anestezi uygulanmış metastatik meme kanseri fare modeline peritoneal olarak vücut ağırlığının kilogramı başına 150 miligram lusiferin enjekte edin. Fareleri, lusiferini uyandırmalarına ve metabolize etmelerine izin vermek için bir ısınma pedi üzerinde kafeslerine geri koyun. Ardından, lusiferin ile enjeksiyondan yaklaşık 10 dakika sonra başlayarak görüntüleme sistemi tarayıcısını kullanarak fareleri görüntüleyin.
5 adede kadar fareyi sırtüstü pozisyonda bir araya getirerek, tüm vücutlarının görüş alanı kılavuzu işaretlerine dahil edildiğinden ve mümkün olduğunca düz yönlendirildiğinden emin olun. Aksiller lenf düğümlerini daha iyi görselleştirmek için kollarını sabitlemek için şeffaf bant kullanın. Şimdi, görüntüleme sistemi yazılımında, biyolüminesans görüntüleme için Pozlamayı Otomatik olarak, Gruplamayı Orta, FStop'u 1'e, Uyarmayı Engelle, Emisyonu Açık, FOV'u D'ye ve Yüksekliği 1.50'ye ayarlayın.
Yüzeysel konumu nedeniyle tipik olarak güçlü bir sinyal üreten primer tümörü görüntülerken, Maruz Kalma'yı Otomatik olarak ayarlayın. Metastazları izliyorsanız, birincil tümörü dikkatlice siyah elektrik bandı ile örtün ve herhangi bir zayıf sinyali yakalamak için Maruz Kalma süresini manuel olarak 300 saniyeye ayarlayın. Başlamak için, metastatik meme kanseri farelerini tartın, çünkü Nano ilaç dozu vücut ağırlığına dayanmaktadır.
Fare vücut ağırlığının kilogramı başına 10 miligram demir Nanodrug ile doldurulmuş 29 gauge iğneli bir insülin şırıngası hazırlayın. Daha sonra anestezi uygulanmış hayvanın kuyruğunu kuyruk damarlarını genişletmek için 30 saniye boyunca 30 ila 35 santigrat derecede ılık suya batırın. Bundan sonra, kuyruktaki fazla suyu silin ve enjeksiyon bölgesini %70 alkollü bir mendille temizleyin.
Şimdi, iğne eğimini kuyruğun yaklaşık yarısına kadar yanal kuyruk damarına yerleştirin. Kanın iğneye geri dönüşüyle yerleştirmeyi onaylamak için pistonu hafifçe geri çekin. Başarılı bir şekilde yerleştirildikten sonra, Nanodrug 40 mikrolitrelik bir enjeksiyon için yaklaşık 5 ila 10 saniyelik yavaş bir hızda sabit bir şekilde enjekte edin.
Enjeksiyon bölgesinin yakınında kuyruğun derisi altında çözelti birikmesi olmaması ve damarın koyu nanopartikül çözeltisinden koyulaşması ile başarılı enjeksiyonu onaylayın. Gazlı bez ile enjeksiyon bölgesi üzerinde baskı tutun ve iğneyi çıkarın. Kanama durana kadar yaklaşık 30 saniye boyunca basıncı koruyun.
Metastaz örneklerini toplamak için, fareleri biyolüminesans görüntüleme kullanarak görüntüleyerek başlayın. Metastazları topladıktan sonra, toplanan dokuları bir Petri kabına yerleştirin. Görüntüleme sistemi yazılımında, biyolüminesans görüntüleme için Pozlamayı Otomatik olarak, Gruplamayı Orta olarak ayarlayın, FStop'u 1 olarak, Uyarmayı Engelle, Emisyonu Açık olarak, FOV'u D olarak ve Yüksekliği 1.50 olarak ayarlayın.
Floresan görüntüleme için Pozlama'yı Otomatik'e, Gruplama'yı Orta'ya, FStop'u 1'e, Uyarma'yı 675'e, Emisyon'u 720'ye, Lamba Seviyesi'ni Yüksek'e, FOV'u D'ye, Yükseklik'i 1,50'ye ayarlayın. Ardından, toplanmaya değer herhangi bir kanser dokusu olup olmadığını belirlemek için fare karkasını BLI ile görüntüleyin. Daha sonra, toplanan kanser dokularını PBS'de durulayın.
Mikroskopi veya kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu için dokuları toplamak için, bunları optimum kesme sıcaklığı bileşiğine gömün ve işlemeye hazır olana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Endüktif olarak eşleştirilmiş plazma optik emisyon spektroskopisi için doku toplamak için, boş bir 1.7 mililitrelik tüp kullanarak bir ölçek dara. Dokuyu tüpe yerleştirin ve ağırlığını kaydedin.
Dokuyu dondurduktan sonra, işlenmeye hazır olana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Kriyoseksiyon: optimum kesme sıcaklığı, taze donmuş numuneleri 10 mikrometre kalınlığında mikroskopi slaytlarına gömdü. Doku tipine bağlı olarak hazne ve numune tutucu sıcaklıklarını eksi 20 santigrat derece ile eksi 15 santigrat derece arasında ayarlayın.
Doku bölümlerini 15 dakika boyunca %4 paraformaldehit çözeltisine batırarak slaytlara sabitleyin. Slaytları PBS ile dikkatlice durulayın. Ardından, doku mimarisini görselleştirmek için DAPI içeren bir ortam kullanarak kapak kızaklarını slaytların üzerine monte edin.
Nanoilaç dağıtımını gösteren Cy5.5 floresan için doku kesitlerini incelemek için bir floresan mikroskobu kullanın. Floresan sinyalinin, enjekte edilmemiş bir hayvandan alınan negatif bir kontrol numunesiyle karşılaştırarak arka plan gürültüsü olmadığını onaylayın. Nanodrug ile tedavi edilen fareler, uygulamadan bir hafta sonra akciğer metastazlarında önemli biyolüminesan sinyaller gösterdi ve akciğer dokularında metastaz varlığını doğruladı.
Floresan görüntüleme, Nanoilac'tan Cy5.5'in sadece tedavi edilen farelerin metastatik akciğer dokularında biriktiğini doğruladı.
