La nostra ricerca si concentra sul trattamento delle metastasi del cancro al seno utilizzando terapie guidate da immagini su una piattaforma di nanoparticelle di ossido di ferro. L'obiettivo è quello di sviluppare terapie efficaci dirette specificamente ai tessuti metastatici, che sono le principali cause di morte correlata al cancro. Può essere difficile determinare se le terapie sistemiche hanno raggiunto il tessuto desiderato senza sacrificare gli animali.
La nostra nanoparticella può essere visualizzata utilizzando la risonanza magnetica e le modalità di imaging ottico, consentendoci di monitorare la somministrazione e l'accumulo di farmaci negli animali vivi. Le attuali terapie per il carcinoma mammario metastatico non sono specifiche per le metastasi, hanno un'efficacia variabile e causano effetti collaterali indesiderati. La nostra piattaforma di nanoparticelle si rivolge specificamente alla nicchia metastatica e consente un monitoraggio non invasivo della sua somministrazione senza evidenza di effetti avversi.
In precedenza, abbiamo utilizzato la nostra piattaforma di nanoparticelle per colpire un driver di metastasi, il miR-10b, e siamo stati in grado di arrestare le metastasi e la crescita delle metastasi. Con un occhio alla traduzione clinica, stiamo studiando la farmacodinamica di questa formulazione per ottimizzare il regime di trattamento e massimizzare l'efficacia. Per iniziare, posiziona il Matrigel congelato a 4 gradi Celsius per 24 ore per consentire all'estratto della matrice di liquefarsi .
Dopo aver determinato il numero totale di cellule necessarie per lo studio, tripsinizzare le cellule e lavare con PBS. Centrifugare le celle a 200 G per 5 minuti. Quindi risospendere il pellet in 500 microlitri di PBS raffreddato per creare lo stock cellulare.
Ora, diluisci il numero totale di celle a 40 volte 10 alla potenza di 6 celle per millilitro. Quindi aggiungere un volume uguale dell'estratto di matrice refrigerata per ottenere una concentrazione finale di 1 volte 10 alla potenza di 6 cellule per 50 microlitri. Conservare la miscela in ghiaccio per evitare che l'estratto si solidifichi prima dell'impianto.
Trasferire il mouse anestetizzato su un cono nasale su un termoforo. Dopo aver confermato il piano chirurgico dell'anestesia, applicare un unguento oftalmico per proteggere gli occhi dall'essiccazione corneale. Quindi pulire la pelle vicino al sito di iniezione con una salvietta imbevuta di alcol e lasciarla asciugare per alcuni secondi.
Indurre alla ghiandola mammaria numero quattro per ridurre al minimo la sovrapposizione del segnale tra il tumore primario e i siti di metastasi comuni. Ora, pipettare il cappello cellulare su e giù per risospendere le cellule. Aspirare 50 microlitri di sospensione di cellule ghiacciate in una siringa da insulina con un ago da 29 gauge.
Inserire lo smusso dell'ago direttamente sotto il capezzolo della ghiandola mammaria desiderata, parallelamente al corpo del topo, e iniettare le cellule a una velocità costante e lenta. Lasciare l'ago nella pelle per almeno 5 secondi dopo aver completato l'iniezione per consentire al Matrigel di solidificarsi e prevenire perdite. Successivamente, sposta il mouse in una gabbia pulita su un cuscinetto riscaldante per il recupero e supervisiona fino a quando non è completamente deambulante e può mantenere la decubito sternale.
Per monitorare la crescita del tumore e lo sviluppo delle metastasi, iniettare 150 milligrammi per chilogrammo di peso corporeo di luciferina per via intraperitoneale nel modello murino di carcinoma mammario metastatico anestetizzato. Rimetti i topi nella loro gabbia su un tappetino riscaldante per consentire loro di risvegliarsi e metabolizzare la luciferina. Quindi, eseguire l'imaging dei topi utilizzando lo scanner del sistema di imaging, a partire da circa 10 minuti dopo l'iniezione con luciferina.
Riprendi fino a 5 topi insieme in posizione supina, assicurandoti che tutto il loro corpo sia incluso all'interno delle marcature della guida del campo visivo e orientato il più dritto possibile. Usa del nastro adesivo trasparente per fissare le braccia per visualizzare meglio i linfonodi ascellari. Ora, nel software del sistema di imaging, impostare l'esposizione su Auto, il binning su medio, l'FStop su 1, l'eccitazione sul blocco, l'emissione su Open, il FOV su D e l'altezza su 1,50 per l'imaging a bioluminescenza.
Quando si esegue l'imaging del tumore primario, che in genere produce un segnale forte a causa della sua posizione superficiale, impostare l'esposizione su Auto. Se si monitorano le metastasi, coprire accuratamente il tumore primario con nastro isolante nero e impostare manualmente l'esposizione su 300 secondi per catturare eventuali segnali deboli. Per iniziare, pesare i topi con carcinoma mammario metastatico, poiché il dosaggio del nanofarmaco si basa sul peso corporeo.
Preparare una siringa da insulina con un ago calibro 29 riempito con 10 milligrammi di ferro Nanodrug per chilogrammo di peso corporeo del topo. Quindi immergere la coda dell'animale anestetizzato in acqua tiepida a 30-35 gradi Celsius per 30 secondi per dilatare le vene della coda. Successivamente, rimuovere l'acqua in eccesso dalla coda e pulire il sito di iniezione con una salvietta imbevuta di alcol al 70%.
Ora, inserisci lo smusso dell'ago nella vena laterale della coda a circa metà della coda. Tirare leggermente indietro lo stantuffo per confermare il posizionamento con il ritorno di fiamma nel punto dell'ago. Una volta inserito con successo, iniettare il nanofarmaco costantemente a una velocità lenta di circa 5-10 secondi per un'iniezione di 40 microlitri.
Confermare il successo dell'iniezione dalla mancanza di ristagno di soluzione sotto la pelle della coda vicino al sito di iniezione e dall'oscuramento della vena dalla soluzione di nanoparticelle scure. Mantenere la pressione sul sito di iniezione con una garza e rimuovere l'ago. Mantenere la pressione per circa 30 secondi fino a quando l'emorragia non si ferma.
Per raccogliere campioni di metastasi, iniziare con l'imaging dei topi utilizzando l'imaging a bioluminescenza. Dopo aver raccolto le metastasi, posizionare i tessuti raccolti in una capsula di Petri. Nel software del sistema di imaging, impostare Esposizione su Auto, Binning su Media, FStop su 1, Eccitazione su Blocco, Emissione su Apertura, FOV su D e Altezza su 1,50 per l'imaging a bioluminescenza.
Per l'imaging a fluorescenza, impostare Esposizione su Auto, Binning su Media, FStop su 1, Eccitazione su 675, Emissione su 720, Livello lampada su Alto, FOV su D, Altezza su 1,50. Quindi visualizza la carcassa del topo con BLI per determinare se c'è del tessuto tumorale rimanente che vale la pena raccogliere. Quindi, sciacquare i tessuti tumorali raccolti in PBS.
Per raccogliere i tessuti per la microscopia o la reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa quantitativa, incorporarli in un composto a temperatura di taglio ottimale e conservarli a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'elaborazione. Per raccogliere i tessuti per la spettroscopia di emissione ottica al plasma accoppiato induttivamente, tarare una bilancia utilizzando un tubo vuoto da 1,7 millilitri. Posizionare il fazzoletto nel tubo e registrarne il peso.
Dopo aver congelato il fazzoletto, conservarlo a meno 80 gradi Celsius fino al momento della lavorazione. Criosezione della temperatura di taglio ottimale, incorporando campioni freschi congelati su vetrini per microscopia a 10 micrometri di spessore. Regolare le temperature della camera e del supporto del campione tra meno 20 gradi Celsius e meno 15 gradi Celsius, a seconda del tipo di tessuto.
Fissare le sezioni di tessuto sui vetrini immergendole in una soluzione di paraformaldeide al 4% per 15 minuti. Sciacquare accuratamente i vetrini con PBS. Quindi montare i vetrini coprioggetto sui vetrini utilizzando un mezzo contenente DAPI per visualizzare l'architettura dei tessuti.
Utilizzare un microscopio a fluorescenza per esaminare le sezioni di tessuto per la fluorescenza Cy5.5, che indica la somministrazione di nanofarmaci. Confermare che il segnale di fluorescenza non è rumore di fondo confrontandolo con un campione di controllo negativo di un animale non iniettato. I topi trattati con Nanodrug hanno mostrato significativi segnali bioluminescenti nelle metastasi polmonari una settimana dopo la somministrazione, confermando la presenza di metastasi nei tessuti polmonari.
L'imaging a fluorescenza ha confermato l'accumulo di Cy5.5 dal nanofarmaco solo nei tessuti polmonari metastatici dei topi trattati.
