Наши исследования сосредоточены на лечении метастазов рака молочной железы с помощью терапии под визуальным контролем на платформе наночастиц оксида железа. Цель состоит в том, чтобы разработать эффективные методы лечения, направленные конкретно на метастатические ткани, которые являются основными причинами смерти, связанной с раком. Может быть сложно определить, достигли ли системные методы лечения желаемых тканей, не жертвуя при этом животными.
Наши наночастицы могут быть визуализированы с помощью МРТ и оптической визуализации, что позволяет нам контролировать доставку и накопление лекарств у живых животных. Современные методы лечения метастатического рака молочной железы не специфичны для метастазов, имеют переменную эффективность и вызывают нежелательные побочные эффекты. Наша платформа наночастиц специально нацелена на метастатическую нишу и позволяет проводить неинвазивный мониторинг их доставки без каких-либо побочных эффектов.
Ранее мы использовали нашу платформу наночастиц для нацеливания на драйвер метастазирования, miR-10b, и смогли остановить метастазирование и рост метастазов. С прицелом на клиническую трансляцию мы исследуем фармакодинамику этой формулы для оптимизации схемы лечения и максимизации эффективности. Для начала поместите замороженный Матригель при температуре 4 градуса Цельсия на 24 часа, чтобы экстракт матрицы разжижался.
После определения общего количества клеток, необходимых для исследования, трипсинизируйте клетки и промойте PBS. Центрифугируйте клетки при 200 G в течение 5 минут. Затем повторно суспендируйте гранулу в 500 микролитрах охлажденного PBS для создания клеточного запаса.
Теперь разбавьте общее количество клеток в 40 раз по 10 в степени 6 клеток на миллилитр. Затем добавьте равный объем охлажденного матричного экстракта для достижения конечной концентрации 1 х 10 в степени 6 клеток на 50 микролитров. Держите смесь на льду, чтобы экстракт не застыл перед имплантацией.
Перенесите мышь, находящуюся под наркозом, в носовой конус на грелке. После подтверждения хирургической плоскости анестезии нанесите офтальмологическую мазь для защиты глаз от пересыхания роговицы. Затем очистите кожу возле места инъекции спиртовой салфеткой и дайте ей высохнуть в течение нескольких секунд.
Индуцировать в молочной железе номер четыре, чтобы свести к минимуму перекрытие сигнала между первичной опухолью и общими местами метастазирования. Теперь пипетируйте запас клеток вверх и вниз, чтобы снова подвесить элементы. Наберите 50 микролитров суспензии ледяной камеры в инсулиновый шприц с помощью иглы 29 калибра.
Вставьте скос иглы прямо под сосок нужной молочной железы, параллельно телу мыши, и вводите клетки с равномерной, медленной скоростью. Оставьте иглу в коже не менее чем на 5 секунд после завершения инъекции, чтобы Матригель застыл и предотвратил утечку. После этого переместите мышь в чистую клетку на грелке для восстановления и наблюдайте за ней, пока она полностью не начнет передвигаться и не сможет поддерживать лежачее положение за грудиной.
Чтобы контролировать рост опухоли и развитие метастазов, введите 150 мг на килограмм массы тела люциферина внутрибрюшинно в мышиную модель с метастатическим раком молочной железы под наркозом. Верните мышей в клетку на согревающей подушке, чтобы они могли проснуться и усвоить люциферин. Затем визуализируйте мышей с помощью сканера системы визуализации, начиная примерно через 10 минут после инъекции люциферина.
Представьте до 5 мышей вместе в положении лежа на спине, убедившись, что все их тела включены в направляющую маркировку поля зрения и ориентированы как можно прямее. Используйте прозрачную ленту для фиксации рук, чтобы лучше визуализировать подмышечные лимфатические узлы. Теперь в программном обеспечении системы визуализации установите Exposure на Auto, Binning на Medium, FStop на 1, Excitation на Block, Emission на Open, FOV на D и Height на 1.50 для биолюминесцентной визуализации.
При визуализации первичной опухоли, которая обычно издает сильный сигнал из-за своего поверхностного расположения, установите для параметра Exposure (Экспозиция) значение Auto (Авто). При мониторинге метастазов тщательно накройте первичную опухоль черной изолентой и вручную установите Exposure на 300 секунд, чтобы улавливать любые слабые сигналы. Для начала взвесьте мышей с метастатическим раком молочной железы, так как дозировка Nanodrug основана на массе тела.
Приготовьте инсулиновый шприц с иглой 29 калибра, наполненный 10 миллиграммами железа Nanodrug на килограмм массы тела мыши. Затем погрузите хвост животного под наркозом в теплую воду при температуре от 30 до 35 градусов Цельсия на 30 секунд, чтобы расширить хвостовые вены. После этого вытрите лишнюю воду с хвоста и очистите место инъекции салфеткой с 70% содержащим спиртом.
Теперь вставьте игольчатый скос вверх в боковую хвостовую вену примерно на полпути вниз по хвосту. Слегка оттяните поршень назад, чтобы подтвердить его размещение с помощью вспышки крови в иглу. После успешного введения вводите нанопрепарат постепенно с медленной скоростью примерно от 5 до 10 секунд для инъекции объемом 40 микролитров.
Подтвердите успешность инъекции отсутствием скопления раствора под кожей хвоста рядом с местом инъекции, а также потемнением вены от темного раствора наночастиц. Удерживайте давление на месте инъекции с помощью марли и извлеките иглу. Сохраняйте давление в течение примерно 30 секунд, пока кровотечение не остановится.
Чтобы собрать образцы метастазов, начните с визуализации мышей с помощью биолюминесцентной визуализации. После сбора метастазов поместите собранные ткани в чашку Петри. В программном обеспечении системы обработки изображений установите для параметров «Экспозия» значение «Авто», для параметра «Биннинг — среда», для FStop — значение 1, для параметра «Возбуждение» — значение «Блок», для параметра «Излучение» — значение «Разомкнутый», для параметра «FOV» — значение D, а для параметра «Высота» — значение 1,50.
Для флуоресцентной визуализации установите для параметров «Экспозия» значение «Авто», для параметра «Биннинг — среда», для параметра «FStop» — значение 175, для параметра «Излучение» — значение 720, для параметра «Уровень лампы» — значение «Высокий», для параметра «FOV» — значение D, для параметра «Высота» — значение 1,50. Затем сфотографируйте тушу мыши с помощью BLI, чтобы определить, есть ли еще какая-либо раковая ткань, которую стоит собрать. Далее промойте собранные раковые ткани в PBS.
Чтобы собрать ткани для микроскопии или количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией, поместите их в состав с оптимальной температурой резки и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия до готовности к обработке. Для забора тканей для оптической эмиссионной спектроскопии с индуктивно связанной плазмой необходимо провести взвешивание с помощью пустой пробирки объемом 1,7 миллилитров. Поместите салфетку в трубку и запишите ее вес.
После заморозки ткани храните ее при температуре минус 80 градусов Цельсия до готовности к обработке. Криосекция при оптимальной температуре резки встраивается в свежезамороженные образцы на предметные стекла микроскопии толщиной 10 мкм. Отрегулируйте температуру камеры и держателя образца в диапазоне от минус 20 градусов Цельсия до минус 15 градусов Цельсия, в зависимости от типа ткани.
Закрепите срезы ткани на предметных стеклах, погрузив их в 4% раствор параформальдегида на 15 минут. Тщательно промойте горки с помощью PBS. Затем монтажная крышка надевается на предметные стекла с помощью среды, содержащей DAPI, для визуализации архитектуры ткани.
Используйте флуоресцентный микроскоп для изучения срезов тканей на флуоресценцию Cy5,5, которая указывает на доставку нанолекарств. Убедитесь, что сигнал флуоресценции не является фоновым шумом, сравнив его с отрицательным контрольным образцом от животного, которому не вводили инъекцию. Мыши, получавшие нанопрепарат, показали значимые биолюминесцентные сигналы в метастазах в легких через неделю после введения, подтвердив наличие метастазов в тканях легких.
Флуоресцентная визуализация подтвердила накопление Cy5.5 из нанопрепарата только в метастатических тканях легких обработанных мышей.
