Unsere Forschung konzentriert sich auf die Behandlung von Brustkrebsmetastasen mit bildgesteuerten Therapeutika auf einer Eisenoxid-Nanopartikel-Plattform. Ziel ist es, wirksame Therapien zu entwickeln, die speziell auf metastasierendes Gewebe abzielen, die die Hauptursachen für krebsbedingte Todesfälle sind. Es kann schwierig sein, festzustellen, ob systemische Therapeutika das gewünschte Gewebe erreicht haben, ohne Tiere zu opfern.
Unsere Nanopartikel können mit MRT und optischen Bildgebungsverfahren abgebildet werden, was es uns ermöglicht, die Verabreichung und Akkumulation von Medikamenten in lebenden Tieren zu überwachen. Die derzeitigen Therapien für metastasierenden Brustkrebs sind nicht spezifisch für Metastasen, haben eine unterschiedliche Wirksamkeit und verursachen unerwünschte Nebenwirkungen. Unsere Nanopartikel-Plattform zielt speziell auf die metastasierende Nische ab und ermöglicht eine nicht-invasive Überwachung der Abgabe ohne Hinweise auf Nebenwirkungen.
Zuvor haben wir unsere Nanopartikelplattform verwendet, um einen Treiber der Metastasierung, miR-10b, ins Visier zu nehmen, und konnten die Metastasierung und das Wachstum von Metastasen stoppen. Mit Blick auf die klinische Umsetzung untersuchen wir die Pharmakodynamik dieser Formulierung, um das Behandlungsschema zu optimieren und die Wirksamkeit zu maximieren. Zu Beginn das gefrorene Matrigel 24 Stunden lang bei 4 Grad Celsius erhitzen, damit sich der Matrixextrakt verflüssigen kann.
Nach der Bestimmung der Gesamtzahl der für die Studie benötigten Zellen trypsinisieren Sie die Zellen und waschen sie mit PBS. Die Zellen werden bei 200 g 5 Minuten lang zentrifugiert. Suspendieren Sie dann das Pellet erneut in 500 Mikrolitern gekühltem PBS, um den Zellvorrat herzustellen.
Verdünnen Sie nun die Gesamtzahl der Zellen auf 40 mal 10 hoch 6 Zellen pro Milliliter. Fügen Sie dann ein gleiches Volumen des gekühlten Matrixextrakts hinzu, um eine Endkonzentration von 1 mal 10 hoch 6 Zellen pro 50 Mikroliter zu erreichen. Bewahren Sie die Mischung auf Eis auf, um zu verhindern, dass sich der Extrakt vor der Implantation verfestigt.
Übertragen Sie die betäubte Maus auf einen Nasenkonus auf einem Heizkissen. Nachdem Sie die chirurgische Ebene der Anästhesie bestätigt haben, tragen Sie eine Augensalbe auf, um die Augen vor dem Austrocknen der Hornhaut zu schützen. Reinigen Sie dann die Haut in der Nähe der Injektionsstelle mit einem Alkoholtupfer und lassen Sie sie einige Sekunden trocknen.
Induktion an der Brustdrüse Nummer vier, um die Signalüberlappung zwischen dem Primärtumor und den häufigen Metastasierungsstellen zu minimieren. Pipettieren Sie nun den Zellvorrat auf und ab, um die Zellen wieder zu suspendieren. Ziehen Sie 50 Mikroliter der eiskalten Zellsuspension mit einer 29-Gauge-Nadel in eine Insulinspritze.
Führen Sie die Nadelfase direkt unter der Brustwarze der gewünschten Brustdrüse parallel zum Körper der Maus ein und injizieren Sie die Zellen in einem gleichmäßigen, langsamen Tempo. Lassen Sie die Nadel nach Abschluss der Injektion mindestens 5 Sekunden lang in der Haut, damit sich das Matrigel verfestigen und ein Auslaufen verhindert wird. Bringen Sie die Maus anschließend zur Erholung in einen sauberen Käfig auf einem Wärmekissen und überwachen Sie, bis sie vollständig gehfähig ist und die sternale Liege aufrechterhalten kann.
Um das Tumorwachstum und die Metastasenentwicklung zu überwachen, injizieren Sie 150 Milligramm Luciferin pro Kilogramm Körpergewicht intraperitoneal in das anästhesierte metastasierende Brustkrebs-Mausmodell. Bringen Sie die Mäuse auf einem Wärmekissen in ihren Käfig zurück, damit sie das Luciferin aufwecken und verstoffwechseln können. Dann werden die Mäuse mit dem Scanner des Bildgebungssystems abgebildet, beginnend etwa 10 Minuten nach der Injektion mit Luciferin.
Stellen Sie sich bis zu 5 Mäuse zusammen in Rückenlage vor, wobei Sie sicherstellen, dass ihr gesamter Körper in die Sichtfeldmarkierungen einbezogen und so gerade wie möglich ausgerichtet ist. Verwenden Sie durchsichtiges Klebeband, um die Arme zu sichern, um die axillären Lymphknoten besser sichtbar zu machen. Stellen Sie nun in der Software des Bildgebungssystems die Belichtung auf Auto, das Binning auf Mittel, FStop auf 1, die Anregung auf Block, die Emission auf Open, das FOV auf D und die Höhe auf 1,50 für die Biolumineszenz-Bildgebung ein.
Wenn Sie den Primärtumor bildgeben, der aufgrund seiner oberflächlichen Lage in der Regel ein starkes Signal erzeugt, stellen Sie die Belichtungszeit auf Auto. Wenn Sie auf Metastasen überwachen, decken Sie den Primärtumor vorsichtig mit schwarzem Isolierband ab und stellen Sie die Exposition manuell auf 300 Sekunden ein, um schwache Signale zu erfassen. Wiegen Sie zunächst die metastasierten Brustkrebsmäuse, da die Dosierung des Nanodrugs auf dem Körpergewicht basiert.
Bereiten Sie eine Insulinspritze mit einer 29-Gauge-Nadel vor, die mit 10 Milligramm Eisen-Nanodrug pro Kilogramm Körpergewicht der Maus gefüllt ist. Tauchen Sie dann den Schwanz des betäubten Tieres für 30 bis 30 Sekunden in warmes Wasser bei 30 bis 35 Grad Celsius, um die Schwanzvenen zu erweitern. Wischen Sie danach überschüssiges Wasser vom Schwanz ab und reinigen Sie die Injektionsstelle mit einem 70%igen Alkoholtuch.
Führen Sie nun die Nadelschräge nach oben in die seitliche Schwanzvene etwa auf halber Höhe des Schwanzes ein. Ziehen Sie den Kolben leicht zurück, um die Platzierung mit dem Rückschlag des Blutes in die Nadel zu bestätigen. Nach erfolgreicher Insertion injizieren Sie das Nanodrug gleichmäßig mit einer langsamen Geschwindigkeit von etwa 5 bis 10 Sekunden für eine 40-Mikroliter-Injektion.
Bestätigen Sie die erfolgreiche Injektion durch das Fehlen von Lösungsansammlungen unter der Haut des Schwanzes in der Nähe der Injektionsstelle und durch die Verdunkelung der Vene durch die dunkle Nanopartikellösung. Halten Sie den Druck mit Gaze auf die Injektionsstelle und entfernen Sie die Nadel. Halten Sie den Druck etwa 30 Sekunden lang aufrecht, bis die Blutung aufhört.
Um Metastasierungsproben zu sammeln, beginnen Sie mit der Bildgebung der Mäuse mittels Biolumineszenz-Bildgebung. Nachdem Sie die Metastasen gesammelt haben, legen Sie das gesammelte Gewebe in eine Petrischale. Stellen Sie in der Software des Bildgebungssystems die Belichtung auf Auto, das Binning auf Mittel, FStop auf 1, die Anregung auf Block, die Emission auf Open, das FOV auf D und die Höhe auf 1,50 für die Biolumineszenz-Bildgebung ein.
Für die Fluoreszenzbildgebung stellen Sie die Belichtung auf Auto, Binning auf Mittel, FStop auf 1, Anregung auf 675, Emission auf 720, Lampenpegel auf Hoch, FOV auf D, Höhe auf 1,50 ein. Bilden Sie dann den Mauskadaver mit BLI ab, um festzustellen, ob es noch Krebsgewebe gibt, das es wert ist, entnommen zu werden. Spülen Sie anschließend das gesammelte Krebsgewebe in PBS.
Um Gewebe für die Mikroskopie oder die quantitative Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion zu sammeln, betten Sie sie in eine Verbindung mit optimaler Schnitttemperatur ein und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius, bis sie für die Verarbeitung bereit sind. Um Gewebe für die optische Emissionsspektroskopie mit induktiv gekoppeltem Plasma zu entnehmen, tarieren Sie eine Waage mit einem leeren 1,7-Milliliter-Röhrchen. Legen Sie das Taschentuch in die Tube und notieren Sie sein Gewicht.
Lagern Sie das Gewebe nach dem Einfrieren bei minus 80 Grad Celsius, bis es für die Verarbeitung bereit ist. Bei der Kryosektion, der optimalen Schnitttemperatur, werden frische gefrorene Proben auf Mikroskopieobjektträger mit einer Dicke von 10 Mikrometern eingebettet. Stellen Sie die Temperaturen der Kammer und des Probenhalters je nach Gewebetyp zwischen minus 20 Grad Celsius und minus 15 Grad Celsius ein.
Befestigen Sie die Gewebeschnitte auf den Objektträgern, indem Sie sie 15 Minuten lang in 4%ige Paraformaldehydlösung tauchen. Spülen Sie die Objektträger vorsichtig mit PBS aus. Montieren Sie dann Deckgläser mit einem DAPI-haltigen Medium auf die Objektträger, um die Gewebearchitektur zu visualisieren.
Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop, um die Gewebeschnitte auf Cy5.5-Fluoreszenz zu untersuchen, die auf die Verabreichung von Nanomedikamenten hinweist. Bestätigen Sie, dass es sich bei dem Fluoreszenzsignal nicht um Hintergrundrauschen handelt, indem Sie es mit einer negativen Kontrollprobe eines nicht injizierten Tieres vergleichen. Die mit Nanodrug behandelten Mäuse zeigten eine Woche nach der Verabreichung signifikante biolumineszierende Signale in Lungenmetastasen, was das Vorhandensein von Metastasen im Lungengewebe bestätigt.
Die Fluoreszenzbildgebung bestätigte die Akkumulation von Cy5.5 aus dem Nanodrug nur im metastasierten Lungengewebe der behandelten Mäuse.
