DNA lifi analizi, nanomalzemelerin DNA'yı tek moleküler düzeyde nasıl etkilediğini anlamamızı sağlar. Ve bu bilgi, nanotoksisiteyi azaltacak stratejilerin geliştirilmesini sağlayacaktır. Bu teknik, DNA dinamiklerini ve hücreler veya dokular eksojen veya endojen DNA'ya zarar veren ajanlara maruz kaldığında nasıl etkilendiğini anlamamızı sağlar ve DNA replikasyonuna, DNA onarımına ve kromatin dinamiklerine bakabiliriz DNA replikasyon dinamiklerini ve onarım mekanizmasını incelemek, terapötik materyalin etkinliğini artıracak veya nanotıbbın hedef dışı etkisini azaltacak stratejilerin geliştirilmesine yardımcı olacaktır.
İnsanların bu teknik hakkında gerçekten bilmelerini istediğimiz şey, yapabileceğimiz veya bir kişinin yapabileceği farklı şeylerdir. Birincisi, yeni kemoterapötik ajanların bir hücrenin sağlığını nasıl etkileyebileceğini anlamak, onları daha hızlı veya daha verimli bir şekilde öldürüp öldüremeyeceğinizi görmektir. Bir sonraki şey, bir ajan eklerken düşünmektir, diyelim ki yeni bir terapötik veya farmasötik ajan, onlara vermeden önce bir kişiye zarar verip vermeyeceğini bilmek istersiniz.
Bu nedenle, ajanı hücrelere veya model sistemlere verebilir ve hücrelere veya model sisteme zarar verip vermediğini ve eğer öyleyse, ne kadar olduğunu görebilirsiniz. Bir sonraki şey, tüm bu yeni nanoilaçları geliştiriyoruz ve bu nanoilaçların bir kişiye veya nanotıbbı enjekte ettiğimiz yere zarar vermediğinden emin olmak istiyoruz. Son olarak, bazen bir proteinin DNA replikasyonunu, DNA onarımını veya kromatin dinamiklerini nasıl etkilediğini bilmek istersiniz ve bunu yapabilmek için bu tekniği kullanabiliriz.
Bu, laboratuvarımda tıbbi biyoteknoloji araştırma alanında yüksek lisans öğrencisi olan Shirali Patel, prosedürü gösterecek. Lif tahlili hazırlığına, ortamı% 75 ila% 80 arasında birleşen RAW 264.5 makrofaj hücrelerinden çıkararak ve iki yarıya bölerek başlayın. Bir yarısını kloro-iyodeoksiüridin nabzı veya kloro-iyododeoksiüridin rezervi için ayırın ve diğer yarısına beş mikrolitre iyododeoksiüridin ekleyerek son konsantrasyon olarak 50 mikromol yapın.
Karıştırdıktan sonra, iyododeoksiüridin içeren ortamı tekrar plakalara ekleyin ve hücreleri inkübatöre 20 dakika boyunca yerleştirin. Kloro-iyodeoksiüridin rezerv ortamını 37 santigrat derecede önceden ısıtın ve kloro-iyododeoksiüridin darbesinden önce bu ortama kloro-iyododeoksiüridin ekleyin. 20 dakika sonra, iyododeoksiüridin ortam karışımını RAW 264.5 makrofaj hücre şişesinden aspire edin.
Hücreleri 7.4 pH'a sahip 500 mikrolitre PBS ile nazikçe yıkayın ve PBS'yi atmadan önce plakayı döndürün. Hücreleri, ortamın 500 mikrolitresinde çeşitli konsantrasyonlarda grafen oksit nanopartikülleri ile tedavi edin ve 30 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyondan sonra, tedavi ortamı karışımını aspire edin ve PBS'yi atmadan önce plakayı hafifçe döndürerek hücreleri 500 mikrolitre PBS ile hafifçe yıkayın.
Daha sonra, kloro-iyododeoksiüridin rezerv ortamına beş mikrolitre kloro-iyododeoksiüridin ekleyin ve hücreleri kloro-iyododeoksiüridin rezerv ortamı ile örtün. Kloro-iyododeoksiüridin darbesi için, hücreleri inkübatöre 20 dakika boyunca yerleştirin. Bir PBS yıkamasından sonra, hücreleri üç ila dört dakika kazıyın, ardından plakaya beş mililitre ortam ekleyin ve hücreleri toplayın.
Toplanan hücreleri dört dakika boyunca 264G'de santrifüj edin. Süpernatantı çıkarın ve hücreleri bir mililitre buz gibi soğuk PBS'de yeniden askıya alın. DNA liflerini hazırlamak için, cam slaytları bir kalem kullanarak deneysel koşul ve tarihle etiketleyin.
Bir pipetteki iki mikrolitre hücreyi aspire edin ve pipeti yaklaşık 45 derecelik bir açıyla tutun. Ardından pipeti slayt etiketinin yaklaşık bir santimetre altına yerleştirin ve yavaş hücre çözeltisi salınımıyla pipeti yatay olarak slayt etiketine doğru hareket ettirin. Çözelti buharlaşıp yapışkan ve yapışkan göründüğünde, pipet ucunun slayta temas etmesine izin vermeden her bir hücre hattını 15 mikrolitre lizis tamponu ile kaplayın.
Daha sonra slaytı 25 derecelik bir açıyla eğin ve DNA'nın en az dört saat boyunca hava kurumasına izin verin. Birinci günde, slaytları iki dakika boyunca metanol asetik aside batırarak DNA liflerini sabitleyin. İkinci günde, slaytları bir cam slayt taşıyıcısına yerleştirin ve en az 24 saat boyunca 20 santigrat derecede inkübe edin.
DNA'yı denatüre etmek için, nemlendirilmiş bir oda hazırlayın ve slaytları dikkatlice deiyonize veya DI su içeren bir Coplin kavanozuna yerleştirin ve kaplanmış yüzeylerin kavanozun duvarlarına temas etmemesini sağlayın. 20 saniyelik inkübasyondan sonra suyu dökün. Tüm slaytları kaplayan Coplin kavanozuna 2.5 molar hidroklorik asit ekleyin.
80 dakikalık inkübasyondan sonra, PBS artı % 0.1 Tween ile bir yıkama yapın, ardından oda sıcaklığında her biri üç dakika boyunca PBS ile iki yıkama yapın. İmmün boyama için, slaytları nemlendirilmiş odaya yerleştirin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca PBS'de% 5 sığır serum albümini veya BSA kullanarak bloke edin. Ardından slaytları şeffaf bir plastik tabaka ile örtün.
Bloke ettikten sonra, kapak kayışını çıkarın ve slayt uzunluğu boyunca 100 mikrolitre birincil antikor çözeltisi ekleyin. Yeni bir plastik kapak fişi ekleyin ve iki saat bekleyin. İki saat sonra, antikor çözeltisini çıkarın ve slaytları PBS dolu bir Coplin kavanozunda iki kez durulayın.
Slayt boyunca 200 mikrolitre% 5 BSA ekleyerek slaytları tekrar bloke edin. Plastik bir kapak fişi ekleyin ve 15 dakika boyunca inkübe edin. Kapak fişini çıkardıktan ve fazla BSA'yı bir kağıt havlu kullanarak çıkardıktan sonra, slayt uzunluğu boyunca 100 mikrolitre ikincil antikor çözeltisi ekleyin ve yeni bir plastik kapak fişi yerleştirin.
Bir saat sonra, kapak fişini çıkarın, fazla BSA'yı bir kağıt havlu üzerinde çıkarın ve slaytları PBS'de iki kez yıkayın. Slayt uzunluğu boyunca 100 mikrolitre üçüncül antikor çözeltisi ekleyin ve yeni bir plastik kapak kayması yerleştirin. Yine, her slayt boyunca 200 mikrolitre% 5 BSA ekleyin ve 15 dakika boyunca inkübe edin.
PBS ile üç yıkamadan sonra, fazla PBS'yi çıkarın ve tamamen kurumasını bekleyin. Kuruduktan sonra, montaj ortamını slayta ekleyin ve kabarcık oluşumuna izin vermeden cam kapak kaymalarını yerleştirin. Alexa Fluor 488 ve 594 boyalarını tespit etmek için bir kamera, 60x objektif ve uygun filtre setleri ile donatılmış bir immünofloresan mikroskop kullanarak immün boyalı DNA liflerini görselleştirin.
Nanomalzemelere uzun süreli maruz kaldıktan sonra replikasyon modellerindeki varyasyon, iyododeoksiüridin ve kloro-iyododeoksiüridin nanopartikül maruziyetinden önce ve sonra hücrelerin replikasyon paternleri karşılaştırılarak belirlenmiştir. DNA lifi analizi ve yorumlama görüntüleri, makrofaj hücrelerini ve grafen-oksit-nanopartikül ile muamele edilmiş makrofaj DNA'sını kontrol etmek için bir model ortaya koydu. Varyasyon, replikasyon ara ürünlerinin modelinde gözlendi ve aynı durumun farklı bir bölgesinde yeni kökenlerde bir artış gösterdi.
Kesin fiber verileri, slaytın toplam alanının beş-altı bölgeye bölünmesi ve her bölgeden birden fazla görüntü alınması ile elde edilmiştir. Birden fazla slayttan veya koşuldan yaklaşık 500 ara ürün seçmek, DNA replikasyon dinamiklerindeki varyasyonu araştırmak için idealdi. Analiz ayrıca, sadece kırmızı izlerde bir artışa işaret ederek, grafen-oksit ile muamele edilmiş hücrelerde yeni ateşlenen kökenlerde bir azalma olduğunu gösteren belirlemeleri ve bir azalmayı gösterdi.
DNA lifi yayılımının kalitesi, liflerin birbirlerinden ne kadar iyi yayıldığına ve örtüşmediğine bağlıdır. Lifler yayıldıktan ve IdU ve CldU boyandıktan sonra, DNA liflerini bulmak son derece önemlidir. DNA liflerini yaptıktan sonra yapabileceğiniz şeylerden biri, birincisi, replikasyon dinamiklerinin nasıl etkilendiğine bakabilirsiniz.
İkincisi, DNA replikasyon izlerine göre DNA hasarının nerede bulunduğuna bakabilirsiniz. Ve son olarak, FISH problarını kullanırsanız, aslında belirli bölgelere ve bu DNA hasarından nasıl etkilendiklerine bakabilirsiniz. Bu teknik, kemoterapi ilaçlarının geliştirilmesi, ilaç tasarımı ve DNA replikasyonunun çeşitli protein türleri tarafından nasıl etkilendiğinin anlaşılmasının yolunu açar.
