DNA 섬유 분석을 통해 나노 물질이 단일 분자 수준에서 DNA에 어떤 영향을 미치는지 이해할 수 있습니다. 그리고 이 정보는 나노독성을 줄이는 전략을 개발할 수 있게 해줄 것입니다. 이 기술을 통해 DNA 역학과 세포나 조직이 외인성 또는 내인성 DNA 손상 물질에 노출될 때 DNA 역학이 어떻게 영향을 받는지 이해할 수 있으며 DNA 복제, DNA 복구 및 염색질 역학을 살펴볼 수 있습니다. DNA 복제 역학 및 복구 메커니즘을 연구하면 치료 물질의 효능을 개선하거나 나노 의학의 표적 이탈 효과를 줄이는 전략을 개발하는 데 도움이 될 것입니다.
우리가 사람들이 이 기술에 대해 정말로 알기를 바라는 것은 우리가 할 수 있는 일이나 한 사람이 할 수 있는 다양한 일이라는 것입니다. 하나는 새로운 화학 요법 제가 세포의 건강에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 이해하여 더 빠르고 효율적으로 죽일 수 있는지 확인하는 것입니다. 다음은 약제를 추가할 때 새로운 치료제 또는 약제라고 가정하고 사람에게 주기 전에 사람에게 해를 끼칠지 알고 싶어하는 것입니다.
따라서 에이전트를 세포나 모델 시스템에 제공하고 그것이 세포나 모델 시스템에 해를 끼치는지 확인할 수 있으며, 그렇다면 얼마나 손상되는지 확인할 수 있습니다. 다음으로 살펴보는 것은 우리가 이 모든 새로운 나노의약품을 개발하고 있으며 이러한 나노의약품이 사람이나 우리가 나노의약품을 주입하는 장소에 해를 끼치지 않도록 하고 싶습니다. 마지막으로 단백질이 DNA 복제, DNA 복구 또는 염색질 역학에 어떤 영향을 미치는지 알고 싶을 때 이 기술을 사용하여 그렇게 할 수 있습니다.
이것은 내 실험실의 의료 생명 공학 연구 학생 인 Shirali Patel이 절차를 시연 할 것입니다. 75%에서 80%의 융합성 RAW 264.5 대식세포에서 배지를 제거하고 두 부분으로 나누어 섬유 분석 준비를 시작합니다. 클로로 요오도 데 옥시 유리딘 펄스 또는 클로로 요오드 데 옥시 유리딘 예비를 위해 절반을 예약하고 나머지 절반에 5 마이크로 리터의 요오드 데 옥시 유리딘을 추가하여 최종 농도로 50 마이크로 몰을 만듭니다.
혼합 후, 요오도데옥시유리딘 함유 배지를 플레이트에 다시 첨가하고 세포를 20분 동안 배양기에 넣는다. 클로로-요오도데옥시유리딘 예비 배지를 섭씨 37도에서 예열하고 클로로-요오도데옥시유리딘 펄스 전에 이 배지에 클로로-요오도데옥시유리딘을 첨가합니다. 20분 후, RAW 264.5 대식세포 플라스크로부터 요오도데옥시유리딘 배지 혼합물을 흡인한다.
세포를 7.4 pH를 갖는 500 마이크로리터의 PBS로 부드럽게 세척하고, PBS를 폐기하기 전에 플레이트를 회전시킨다. 500 마이크로리터의 배지에서 다양한 농도의 산화 그래핀 나노입자로 세포를 처리하고 30분 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 처리-배지 혼합물을 흡인하고, PBS를 버리기 전에 플레이트를 부드럽게 회전시켜 500 마이크로리터의 PBS로 세포를 부드럽게 세척한다.
다음으로, 5 마이크로리터의 클로로-요오도데옥시유리딘을 클로로-요오도데옥시유리딘 예비 배지에 첨가하고, 세포를 클로로-요오도데옥시유리딘 예비 배지로 덮는다. 클로로-요오도데옥시유리딘 펄스의 경우, 세포를 20분 동안 인큐베이터에 넣는다. PBS 세척 후 3-4 분 동안 세포를 긁어 낸 다음 5 밀리리터의 배지를 플레이트에 넣고 세포를 수집합니다.
수집된 세포를 264G에서 4분 동안 원심분리합니다. 상청액을 제거하고 1밀리리터의 얼음처럼 차가운 PBS에서 세포를 다시 현탁시킵니다. DNA 섬유를 준비하려면 연필을 사용하여 유리 슬라이드에 실험 조건과 날짜를 표시합니다.
피펫에서 2마이크로리터의 세포를 흡인하고 피펫을 약 45도 각도로 잡습니다. 그런 다음 피펫을 슬라이드 라벨 아래 약 1cm에 놓고 세포 용액을 천천히 방출하면서 피펫을 슬라이드 라벨 쪽으로 수평으로 이동합니다. 용액이 증발하고 끈적거리고 끈적거리면 피펫 팁이 슬라이드에 닿지 않도록 15마이크로리터의 용해 완충액으로 각 세포 라인을 오버레이합니다.
그런 다음 슬라이드를 25도 각도로 기울이고 DNA 확산이 최소 4시간 동안 자연 건조되도록 합니다. 첫째 날에, 슬라이드를 메탄올 아세트산에 2분 동안 담가서 DNA 섬유를 고정한다. 둘째 날에는 슬라이드를 유리 슬라이드 캐리어에 넣고 섭씨 20도에서 최소 24시간 동안 배양합니다.
DNA를 변성시키려면 가습 챔버를 준비하고 슬라이드를 탈이온화 또는 DI 물이 들어 있는 Coplin 병에 조심스럽게 넣어 코팅된 표면이 항아리 벽에 닿지 않도록 합니다. 20 초간의 배양 후 물을 붓습니다. 코플린 병에 2.5몰 염산을 넣고 모든 슬라이드를 덮습니다.
80분 배양 후 PBS와 0.1%Tween으로 1회 세척한 후 실온에서 PBS로 각각 3분 동안 2회 세척합니다. 면역염색을 위해 슬라이드를 가습 챔버에 넣고 실온에서 30분 동안 PBS에서 5% 소 혈청 알부민(BSA)을 사용하여 차단합니다. 그런 다음 슬라이드를 투명 플라스틱 시트로 덮으십시오.
차단 후 커버 슬립을 제거하고 슬라이드 길이를 따라 100 마이크로 리터의 1 차 항체 용액을 추가합니다. 새 플라스틱 커버 슬립을 추가하고 2시간 동안 기다립니다. 2 시간 후, 항체 용액을 떨어 뜨리고 PBS로 채워진 코플린 병에서 슬라이드를 두 번 헹굽니다.
슬라이드를 따라 200마이크로리터의 5% BSA를 추가하여 슬라이드를 다시 차단합니다. 플라스틱 커버 슬립을 넣고 15분 동안 배양합니다. 커버 슬립을 제거하고 종이 타월을 사용하여 과도한 BSA를 제거한 후 슬라이드 길이를 따라 100마이크로리터의 2차 항체 용액을 추가하고 새 플라스틱 커버 슬립을 놓습니다.
1시간 후, 커버 슬립을 제거하고, 종이 타월로 여분의 BSA를 털어내고, 슬라이드를 PBS로 두 번 세척한다. 슬라이드 길이를 따라 100마이크로리터의 3차 항체 용액을 추가하고 새 플라스틱 커버 슬립을 놓습니다. 다시, 각 슬라이드를 따라 200 마이크로리터의 5% BSA를 첨가하고 15분 동안 배양한다.
PBS로 세 번 세척한 후 여분의 PBS를 제거하고 완전히 건조시킵니다. 건조되면 슬라이드에 장착 매체를 추가하고 기포가 형성되지 않도록 유리 덮개 슬립을 놓습니다. 카메라, 60x 대물렌즈 및 적절한 필터 세트가 장착된 면역형광 현미경을 사용하여 면역염색된 DNA 섬유를 시각화하여 Alexa Fluor 488 및 594 염료를 검출합니다.
나노물질에 장기간 노출된 후의 복제 패턴의 변화는 요오도데옥시우리딘과 클로로요오도데옥시유리딘 나노입자 노출 전후의 세포의 복제 패턴을 비교하여 결정하였다. DNA 섬유 분석 및 해석 이미지는 대조군 대식세포 및 그래핀 산화물 나노입자 처리된 대식세포 DNA에 대한 패턴을 밝혀냈습니다. 복제 중간체의 패턴에서 변이가 관찰되었으며, 동일한 조건의 다른 영역에서 새로운 기원이 증가한 것으로 나타났습니다.
결정적인 광섬유 데이터는 슬라이드의 전체 영역을 5-6개 영역으로 나누고 각 영역에서 여러 이미지를 촬영하여 얻었습니다. 여러 슬라이드 또는 조건에서 약 500개의 중간체를 선택하는 것이 DNA 복제 역학의 변화를 조사하는 데 이상적이었습니다. 분석은 또한 적색 전용 트랙의 증가를 나타냈으며, 이는 대조군과 비교하여 그래핀 산화물 처리된 세포에서 결정 및 새로 소성된 기원의 감소를 나타냅니다.
DNA 섬유 확산의 품질은 섬유가 서로 얼마나 잘 퍼지고 겹치지 않는지에 달려 있습니다. 섬유가 퍼지고 IdU와 CldU가 염색되면 DNA 섬유를 찾는 것이 매우 중요합니다. DNA 섬유를 만든 후 할 수 있는 일 중 하나는 복제 역학이 어떻게 영향을 받는지 볼 수 있다는 것입니다.
둘째, DNA 복제 경로와 관련하여 DNA 손상이 어디에 있는지 볼 수 있습니다. 그리고 마지막으로 FISH 프로브를 사용하면 특정 영역과 DNA 손상이 어떻게 영향을 받는지 실제로 볼 수 있습니다. 이 기술은 화학 요법 약물 개발, 약물 설계 및 DNA 복제가 다양한 유형의 단백질에 의해 어떻게 영향을 받는지 이해하는 길을 열어줍니다.
