Bu araştırma (Z01 AG000746-08) ve Fanconi Anemisi Araştırma Fonu Yaşlanma üzerine NIH, Ulusal Enstitüsü İntramural Araştırma Programı tarafından kısmen desteklenmiştir.

Dig-TMP hazırlanması 1. <ol><li> 50 mg (0.18 mmol) 8-trımetılpsoralen&#39;dır 4&#39;-klorometil-4,5&#39; , ve bir kuru 25 mL&#39;lik yuvarlak 590 mg (2.7 mmol) 4,7,10-trioksa-1,13-tridecanedi-amin karıştırın nitrojen altında bir şişeye -Dip. 12 saat için 10 ml toluen ve geri akış ekleyin. Indirgenmiş basınç altında, bir döner buharlaştırıcı içerisinde çözücüden çıkarın. <ol><li> Silika jel üzerinde flaş kolon kromatografisiyle artığı arıtın. (: 1: 0.5, 9), kloroform, metanol ve% 28 amonyak çözeltisi ile sütun elute. düşük basınç altında bir döner buharlaştırıcı çözücü buharlaşır ve geri saf 4 &#39;- [N- (13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminometil-4,5&#39;, 8-trımetılpsoralen&#39;dır yapışkan sarı bir soluk sıvı. </li><li> 4, 5.5 mg (0.012 mmol) karıştırın &#39;- [N- (13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminometil-4,5&#39;, digoksigenin NHS ester 5 mg (0.008 mmol) içindeki bir 8-trımetılpsoralen&#39;dır azot altında kuru bir yuvarlak dipli şişeye. 0.5 ml susuz dimetil formamid ekleme (DMF) bird trimetilamin 3.4 uL, 18 saat boyunca 50 ° C&#39;de karıştırın. </li><li> indirgenmiş basınç altında, bir döner buharlaştırıcı içerisinde çözücüden çıkarın. </li><li> diklorometan minimum miktarda tortu çözülür. yatay bir durağan faz olarak silis jeli ile hazırlayıcı ince tabaka levhasının alt kısmı boyunca 2 uL noktalar çözelti uygulanır. metanol: kloroform içinde hazırlayıcı TLC çalıştırın% 28 amonyum hidroksit (8: 1: 0.1). </li><li> dikey kenarlarda hariç plaka Maske ve kısa dalga boylu UV 254 nm lambası ile ürünün bandını belirlemek. Bir spatula ile plakadan kazıyın ve ürün kloroform kullanılarak saf ürün izole: metanol:% 28 amonyum hidroksit (8: 1: 0.1) karışımı ile gerçekleştirilmektedir. </li><li> indirgenmiş basınç altında, bir döner buharlaştırıcı içinde çözücüleri çıkarın. % 50 1 mL EtOH içinde kalan pelet çözülür: H2O, tüm solvent (~ 3 saat) buharlaştırılır kadar bir santrifüjlü buharlaştıncı içerisinde 1.5 ml tüpler (~ 20 kısımlar) ve kuru 50 uL&#39;lik bölümler halinde dağıtmak. </li><li>Bir santrifüjlü buharlaştıncı içerisinde yeniden H2O ve kuru:% 50 EtOH, 200 uL, her bir kısım yeniden çözündürülür. % 50 EtOH 200 uL yeniden her kısım çözülür: H2O, uzun süreli depolama için -20 ° C &#39;de santrifüj buharlaştırıcı ve mağaza peletler kuru. </li></ol></li><li> H2 O, 1 hazırlayın: H2O içinde çözülmüş Dig-TMP 100 seyreltme ve 250 nm &#39;de OD ölçümü kullanmak için,% 50 EtOH 50 uL pelet çözülür. Dig-TMP ekstinksiyon katsayısı 25.000&#39;dir. -20 ° C&#39;de muhafaza edildiğinde çözeltisi yaklaşık bir ay boyunca stabildir. Her kullanımdan önce, 250 nm &#39;de OD ölçümü ile konsantrasyonunu kontrol edin. <ol><li> Stok konsantrasyonu hesaplanır: Abs x 100 x 10 (uM olarak) 6 / 25,000 = Konsantrasyon. Tipik olarak, stok çözeltisi, yaklaşık 3 mM&#39;dir. Ortama ilave EtOH hacmini en aza indirmek için, bu aralık içinde olması önem taşımaktadır. </li></ol></li></ol> 2. Lazer Lokalize Dig-TMP ICLs <ol><li> peBir SRS azot lazeri (337 nm) ile bir eş odaklı mikroskop ile rform lazer lokalizasyonu 365 nm&#39;lik bir çizgi yayan ve 0.7 nW bir güç ile, 10 Hz, 3 ns darbeleri ateşleme bir boya hücresi içinden pompalanır. </li><li> 35 mm cam tarafında dikey bir işaret koyun bir işaret kalemi ile hücre kültür çanağı tabanı. Bir elmas kalem ile kültür yüzey üzerinde cam merkezinde bir çapraz kaşı bu çanak tarafındaki siyah şerit çapraz bir kol üstünde olduğundan emin olun. Bu ve hücreler aynı odak düzleminde olacak şekilde enine cam büyüme yüzeyi üzerine işaretlenir. </li><li> % 70 EtOH durulama ile işaretlendikten sonra plaka sterilize edin. Hücreleri kaplama önce kuru. </li><li> ortada plakası hücreleri (örneğin, HeLa veya U2OS gibi standart laboratuar suşları) bir ya da iki gün önce kültür kaplarına oldu. Hücre aktif olarak bölünen ve deney günü% 50-70 konfluent olmalıdır. eşit etiket DNA 1 uM 5-kloro-2-deoksiüridin (CldU) ile 24 saat inkübe edin. </li><li> Eklemek% 50 EtOH Dig-TMP: 20 uM nihai konsantrasyona kadar hücre kültürü ortamına H2O. 37 ° C&#39;ye kadar ortam getirin. Inkübatörde hücre ve yer üzerinde orta değiştirme (37 ° C,% 5 CO2) 30 dakika Dig-TMP dengeye gelmesine izin vermek için. </li><li> Hücreler kuluçka iken, lazer aktif olduğu görüş alanının x / y koordinatlarını belirlemek. Lazer, yatay ve diyagonal bir hat boyunca yansıtılmış cam slayt etch yazılım tarafından yönlendirildiği üreticinin kalibrasyon prosedürünü izleyin. iki satır lazer hedef grev hangi alanın sınırlarını tanımlar. </li><li> Mikroskop sahnede kontrol CO2 ve nem ile 37 ° C &#39;de, çevre odasında plaka koyun ve çapraz kesiştiği 60X yağa amacı ile odaklanır. </li><li> yazılım şekil aracıyla araştırmacı tarafından kurulmuş bir ROI, 365 nm lazer ışını doğrudan, 3 ve bir şerit oluşturmak üzere# 181; 0.6 um mx. ROI anahat haç kesiştiği hemen yakınında bulunan hücrelerin çekirdeklerinde imleç tarafından yerleştirilir. çekirdek boyunca lazer yarıda hedef z odak düzlemi ayarlayın. 350-370 nm aralığında bir lazer kullanın. 405 nm lazer çapraz bağ 19 neden olamaz. NOT: diferansiyel girişim kontrast (DIC) görüntülemede nükleolazma ayırt edilebilir nükleol dışında nükleoplazmik alanlarda yatırım getirisini bulun. </li><li> Bir hücreyi (hücre karartmak ve ardından kaybolur) yoketmek için yeterli bir seviyeye güç ayarını artırarak lazer odak ve aktivitesini kontrol edin. Bu mikroskopta ve sonra lamel içinden ve hücrelere lazer için engelsiz bir ışık yolu için önemli bir tanı olduğunu. <ol><li> psoralen ve ICL uyarılan DDR (bu her lazer / mikrofon için ampirik olarak tespit edilmelidir aktive etmek için yeterli güç ayarını düşürünroscope kombinasyon). (Γ-H2AX oluşumu ile izlenmiştir) psoralen yokluğunda DDR aktif olmayan bir lazer yoğunluğu ayarını (burada% 1.7) kullanın. NOT: Bu önemli bir belirlenmesidir ve lazer kaynağı veya ışık yolu bir bileşen değiştirilirse ayarlarının yapılmasını gerektirebilir. GFP birikimi lazer psoralen çizgili tür hızlı bir şekilde (saniye olarak) ortaya çıkar, her ikisi de XPC veya OPT_FAN1 gibi tamir etiketli proteinlerin izleyin, ancak tek başına lazer maruz ROI için değil. Birkaç dakika diğerleri için gerekli olabilecek iken DDR Bazı proteinler, saniyeler içinde görünür. Ilgi her protein için zaman ders saptamaları yapmak gereklidir. Biz de lazere maruz kalmamış hücrelerden yanıt proteinlerin hiçbir çizgiler olduğunu unutmayın. </li></ol></li><li> Bir alandaki tüm hücreler haç kesiştiği yakın kalarak hareket ettiremeyecek yeni bir alana plaka hedeflenmiş sonra. </li><li> deneylerde unsurlar için tasarlanmışarası lezyon mesafelerin dağıtım kesişme 20-25 alanları (4-5 hücre / görüş alanı), lazere hücreler maruz ine. lokalize ICLs yakın çoğaltma kalıpları analiz etmek için lazer atışı sonrasında 10 uM 5-İyodo-2-deoksiüridin (DUK) ile hücrelerin inkübe edin. NOT: DUK ile inkübasyon süresi biraz keyfi olduğu. Bu, 20 dakika kadar kısa ve en fazla 60, min (aşağıya bakınız) olarak kullanılmıştır. Daha uzun bakliyat (birkaç saat) genellikle böylece görüntüye tek çatal ilerlemesini fırsat kaybediyor, kaynaştırma çoklu çoğaltma yolları ile sonuçlanır. Bazı deneylerde, ces çoğaltma yolları darbe etiketleme ve ardından Dig-TMP maruz bırakılmadan önce etiket DNA muntazam üzere 24 saat boyunca CldU ile etiketlenmiştir. </li></ol> 3. Hücreleri hasat ve DNA Liflerin germe <ol><li> Sahneden plaka çıkarın orta kaldırmak ve fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile yıkanır. PBS çözüm çıkarın. Ticari bir tripsin 10 mcL damla yerleştirin/ Cam yüzeyinin ortasında çapraz kesişme EDTA çözeltisi. </li><li> Oda sıcaklığında (RT) 3-4 dakika boyunca inkübe edin ve daha sonra pipet ucuna müstakil hücreler tripsin solüsyonu çizin. tripsin nötralize etmeye gerek yoktur. </li><li> bir silanize cam mikroskop lamı bir ucunda hücreler tripsin / EDTA damla yerleştirin. Hücreleri, ve kurumaya havuzun çevresini sağlayan,% 0.5 SDS çözeltisi 10 uL eklenmesiyle DNA&#39;yı serbest bırakmak ve pipet ucu ile hafifçe karıştırılarak oda sıcaklığında 3-4 dakika inkübe edilir. </li><li> slayt eğin 20 ° ve sıvı aşağı ucuna çalışmasına izin verir. DNA, lifler akan sıvının hidrodinamik kuvvetler tarafından gerilir / uzatılır. Slaytlar kuru hava (yaklaşık 10 dakika) izin 3 düzeltmek: 10 dakika için 1 metanol / asetik asit. Tekrar düzeltme çözümü ve kuru hava slaytları çıkarın. Bu noktada, -20 ° C&#39;de% 70 EtOH içinde süresiz olarak saklanabilir. % 70 EtOH çıkarıldıktan NE önce kurumaya bırakınxt adım. </li><li> PBS içinde slaytlar yıkayın ve daha sonra oda sıcaklığında 1 saat boyunca 2.5 M HCl içinde denatüre. Bu işlem, DNA antikorlara dahil halojenlenmiş nükleobaz erişilebilir hale depurinates. </li><li> 0.4 M Tris-HCI, pH 7.4 içinde kayar nötralize. PBS içinde iki kere yıkayın /% 0.5 Tween-20 (PBST) her biri 5 dakika için. </li><li> Blok PBS içinde% 5 sığır serum albümini (BSA) ve% 10 keçi serumu ile kayar. slayt üzerine eşit bir şekilde bloke çözeltisi yayılır ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübasyona bir parafilm yavaşça slaytlar örtün. </li><li> 1 pipetleyin 100 uL: sıçan anti-bromodeoksiüridin çözümü engelleme 200 seyreltme Her bir slayt, birincil antikor (özellikle CldU tespit eder). Oda sıcaklığında 1 saat boyunca nemlendirilmiş bir odada sürgü üzerinde eşit olarak seyreltme yayılmış ve inkübasyona bir parafilm yavaşça slaytlar örtün. parafilm çıkarın ve 5 dakika her biri için slaytlar PBST üç kez yıkayın. </li><li> Her bir slayt çözüm engelleme: (1: 100) keçi anti-fare Alexa Fluor 647 seyreltilmiş pipetleyin 100 uL. KapakBir parafilm nazikçe kayar ve oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edilir. 5 dakika her biri için slaytlar PBST üç kez yıkayın. </li><li> 200: seyreltilmiş (1:40) fare anti-bromodeoksiüridin pipetleyin 100 uL primer antikor ile ve tavşan anti-DIG antikoru (1 (. LDU ve CldU Bu çift özgüllük sıçan inkübasyondan önce anti BrdU ile CldU bloke gerektiren tespit eder) ) her bir slayta çözüm engelleme. bir parafilm yavaşça slaytlar kapatılır ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca nemlendirilmiş bir odada kuluçkaya. 5 dakika her biri için slaytlar PBST üç kez yıkayın. </li><li> Her bir slayt çözüm engelleme keçi anti-tavşan prob (örneğin, Qdot 655) (: 1: 100), keçi anti-fare Alexa Fluor 488 andC (5.000 1) ile seyreltildi pipetleyin 100 uL. nazikçe parafilm slaytlar örtün ve oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edilir. 5 dakika her biri için slaytlar PBST üç kez yıkayın. </li><li> bir kağıt havlu üzerine aşırı PBST boşaltın. Her bir slayt üzerine antifade montaj orta 50 uL ekleyin ve bir lamel ile kaplayın. Görüntü veya mağaza için-20 ° C de bir fazla 48 saat. </li></ol> Floresan mikroskobu ile 4. Fiber Görüntüleme <ol><li> FITC, Cy5 ve Q Dot 655 algılama ile ekli bir tam motorlu filtre çarkı ile bir inverted mikroskop ile 63X objektif ile görüntü alımı gerçekleştirin. Uyarma filtresi 425 nm ve emisyon filtresi emisyon tepe 20 ortalanan 20 nm ile 655 nm arasındadır. </li></ol>

<ol>
	<li>Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Intrinsic+Fragility+of+DNA+(Nobel+Lecture).">The Intrinsic Fragility of DNA (Nobel Lecture).</a> Angew. Chem. Int. Ed Engl. 55 (30), 8528-8534 (2016).</li><li>Sirbu, B. M., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+response:+three+levels+of+DNA+repair+regulation.">DNA damage response: three levels of DNA repair regulation.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a01272 (2013).</li><li>Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+protein+dynamics+and+DNA+repair+following+generation+of+DNA+double-strand+breaks+at+defined+genomic+sites.">Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites.</a> Nat. Protoc. 3 (5), 915-922 (2008).</li><li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo.">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).</li><li>Lan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+analysis+of+repair+processes+for+oxidative+DNA+damage+in+mammalian+cells.">In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 13738-13743 (2004).</li><li>Reynolds, P., Botchway, S. W., Parker, A. W., O'Neill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+dynamics+of+DNA+repair+proteins+following+laser+microbeam+induced+DNA+damage+-+when+is+a+DSB+not+a+DSB?.">Spatiotemporal dynamics of DNA repair proteins following laser microbeam induced DNA damage - when is a DSB not a DSB?.</a> Mutat. Res. 756, 14-20 (2013).</li><li>Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+DNA+double-strand+breaks:+production,+fidelity+of+repair,+and+induction+of+cancer.">Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 12871-12876 (2003).</li><li>Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+dose-rate+effects,+endogenous+DNA+damage,+and+signaling+resonance.">Radiation dose-rate effects, endogenous DNA damage, and signaling resonance.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17874-17879 (2006).</li><li>Aguilera, A., Garcia-Muse, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+of+genome+instability.">Causes of genome instability.</a> Annu. Rev. Genet. 47, 1-32 (2013).</li><li>Swenberg, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+versus+exogenous+DNA+adducts:+their+role+in+carcinogenesis,+epidemiology,+and+risk+assessment.">Endogenous versus exogenous DNA adducts: their role in carcinogenesis, epidemiology, and risk assessment.</a> Toxicol. Sci. 120 (1), S130-S145 (2011).</li><li>Eichman, B. F., Mooers, B. H., Alberti, M., Hearst, J. E., Ho, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structures+of+psoralen+cross-linked+DNAs:+drug-dependent+formation+of+holliday+junctions.">The crystal structures of psoralen cross-linked DNAs: drug-dependent formation of holliday junctions.</a> J. Mol. Biol. 308, 15-26 (2001).</li><li>Lai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+DNA+interstrand+cross-links+and+monoadducts+formed+in+human+cells+induced+by+psoralens+and+UVA+irradiation.">Quantitative analysis of DNA interstrand cross-links and monoadducts formed in human cells induced by psoralens and UVA irradiation.</a> Anal. Chem. 80, 8790-8798 (2008).</li><li>Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psoralen+conjugates+for+visualization+of+genomic+interstrand+cross-links+localized+by+laser+photoactivation.">Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation.</a> Bioconjug. Chem. 18, 431-437 (2007).</li><li>Muniandy, P. A., Thapa, D., Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Seidman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+laser-localized+DNA+interstrand+cross-links+in+G1+phase+mammalian+cells.">Repair of laser-localized DNA interstrand cross-links in G1 phase mammalian cells.</a> J Biol. Chem. 284 (41), 27908-27917 (2009).</li><li>Nowsheen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+oxidatively+induced+clustered+DNA+lesions+in+human+tumor+tissues.">Accumulation of oxidatively induced clustered DNA lesions in human tumor tissues.</a> Mutat. Res. 674, 131-136 (2009).</li><li>Meyer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustered+DNA+damage+induces+pan-nuclear+H2AX+phosphorylation+mediated+by+ATM+and+DNA-PK.">Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK.</a> Nucl Acids Res. 41, 6109-6118 (2013).</li><li>Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+DNA+replication+in+the+vertebrate+model+system+DT40+using+the+DNA+fiber+technique.">Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique.</a> J Vis. Exp. (56), e3255 (2011).</li><li>Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaborative+dynamic+DNA+scanning+by+nucleotide+excision+repair+proteins+investigated+by+single-+molecule+imaging+of+quantum-dot-labeled+proteins.">Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single- molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins.</a> Mol. Cell. 37 (5), 702-713 (2010).</li><li>Spielmann, H. P., Sastry, S. S., Hearst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+large-scale+synthesis+of+psoralen+furan-side+monoadducts+and+diadducts.">Methods for the large-scale synthesis of psoralen furan-side monoadducts and diadducts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (10), 4514-4518 (1992).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+translocase+FANCM/MHF+promotes+replication+traverse+of+DNA+interstrand+crosslinks.">The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks.</a> Mol. Cell. 52, 434-446 (2013).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Molecule+Analysis+of+Laser+Localized+Interstrand+Crosslinks.">Single Molecule Analysis of Laser Localized Interstrand Crosslinks.</a> Front Genet. 7, 84 (2016).</li><li>Ciccia, A., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+damage+response:+making+it+safe+to+play+with+knives.">The DNA damage response: making it safe to play with knives.</a> Mol. Cell. 40, 179-204 (2010).</li><li>Mori, T., Matsunaga, T., Hirose, T., Nikaido, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+monoclonal+antibody+recognizing+ultraviolet+light-induced+(6-4)+photoproducts.">Establishment of a monoclonal antibody recognizing ultraviolet light-induced (6-4) photoproducts.</a> Mutat. Res. 194, 263-270 (1988).</li><li>Poirier, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisera+specific+for+carcinogen-DNA+adducts+and+carcinogen-modified+DNA:+applications+for+detection+of+xenobiotics+in+biological+samples.">Antisera specific for carcinogen-DNA adducts and carcinogen-modified DNA: applications for detection of xenobiotics in biological samples.</a> Mutat. Res. 288, 31-38 (1993).</li><li>Henderson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+G-quadruplex+DNA+in+mammalian+cells.">Detection of G-quadruplex DNA in mammalian cells.</a> Nucleic Acids Res. 42, 860-869 (2014).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Lazer lokalizasyon teknolojisi parlak alan mikroskopisi de görebilir çekirdekleri yapışan hücrelerin kullanımını gerektirmektedir. Böyle polilisin veya kolajen veya daha fazla kompleks karışımlar olarak hücre yapıştırma preparatları ile cam yüzeyine, örneğin primer lenfositler, ya da AD293 olarak gevşek bir şekilde yapışık kültürlenmiş hücreler gibi yapışmayan hücreler, takmak için çalışılmıştır. bu tedaviler yüzeye hücreleri bağlamak olsa bile, genellikle çok zor çekirdekleri içine odaklanmak için yapım yuvarlak kalmak görüyoruz. Bundan başka, hücrelerin çoğu büyüme ortamının ayrılmasından sonra ilk yıkamayı hayatta başarısız. Bununla birlikte, yapışkan hücreler için gereksinimi içinde, başarılı bu çalışmalar için standart hücre çizgilerinin geniş hem de esas hücreleri kullanılmıştır. Mikoplazma kontaminasyonu için test hücrelerine yararlıdır. Biz hücre yanıtları bu enfeksiyonların tarafından değiştirilmiş olduğunu bulmak. lazerin odak düzlemi önemlidir. Amaç etmektirÇekirdek içerisindeki ICLs yerleştirin. Çok yüksek ve foto-aktifleştirme çekirdeği üzerinde olacak; çok düşük ve cama olacak. Biz yararlı sitoplazma ve çekirdekten kesiştiği DIC görüntünün odağını netleştirmek bulabilirsiniz. Fiber tahliller zor değildir, ancak yorumlanabilir alanlar kurtarıldı önce biraz pratik gerektirir. Düzgün bu tekniği uygulamak için önemlidir. Lazer deneylerden kazanılan hücre sayısı düşüktür ve her bir örnek, bir, tek slayt üzerinde bütünüyle kullanılır. Numuneler, daha sonra analiz için saklandı alikotları ile, bölme edilemez Sonuç olarak, her bir deneyden elde edilen verimini maksimize etmek esastır. Ancak, olayların yüzlerce tek bir örnekten elde edilebilir. Prosedürün İki özellikleri merkezi öneme sahiptir. Bir slayt aşağı hücre lizatının akış oranıdır. Çok hızlı olursa, DNA&#39;nın çok slayt kapalı çalışacaktır. cam slaytların kalitesi de önemlidir. Zaman zaman Receetkisiz bir sürü ive. Sonuç olarak her yeni lot kullanımdan önce test edilmelidir. Vb ticari reaktifler-antikorları, immunoquantum noktalar güvenilirliği tüm laboratuar manipülasyonları için geçerli olduğu gibi, her zaman bir husustur. Bunlar hep stabil değildir ve deneysel başarısızlık genellikle bir ya da başka bir reaktif ile sorunlara kadar takip edilir. immunoquantum noktalar sorunludur, ve birden fazla çok kabul edilebilir bir tespit için test edilmesi gerekebilir. Etkisiz çok yüksek arkaplan sinyalleriyle işaretlenmiştir. Bu lifler ile ilişkili değildir ve herhangi bir DNA&#39;ya sahiptir sürgünün bölgelere görülecektir. O Bonner grubunun 4 ile tanıtılan bu yana yerel DNA hasarını tanıtmak lazerlerin kullanımı oldukça popüler hale gelmiştir. doğrudan DDR uyaracak şekilde olanlar ve en sonraki deneylerde lazer güç ayarlarını ayarlanır. Biz yeterince düşük suc ayarı gücünü kullanmış olanDDR aktivasyonu lazer ve psoralen hem bağlıdır h. Yukarıda ele alındığı gibi, psoralen adüktleri arasındaki ayrılma tek tek olaylara yanıt bakıyor iddia etmektedir. Endojen çapraz bağlama maddeleri ile oluşturulmaktadır ICLs sayısı bilinmemektedir birlikte, 6-8 saat (yayınlanmamış veriler) içinde psoralen ilave maddelerin kaldırmak mümkün olduğu gibi psoralen adüktlerin lokalizasyonu, hücreleri öldürmez olduğunu not edin ve mevcut ve sağlıklı, 24 saat sonra bulunmaktadır. Dolayısıyla bu yaklaşım daha az toksik çekirdek ve mitokondri içinde DNA hasarına tanıtmak ajanlara maruz gerektirir protokollere göre hücreler etmektir. lazer / psoralen kombinasyonu DDR aktive bir sarmal çarpıtan yapısını tanıtmak. Bu bağlamda, bu yaklaşım elde edilen sonuçlar, ATM / DNAPK / ATR aktivasyonundan sonra, DDR basamaklı doğası göz önüne alındığında, helezon bozan lezyonların bir dizi için geçerli olduğu, 22. kinaz.Bu bağlamda, burada açıklanan DNA elyaf yaklaşım floresan ile görüntülenebilir immünolojik veya kimyasal veya biyokimyasal yollarla saptanabilir herhangi bir DNA yapısı genişletilebilir. UV içerebilir Bu 23, hacimli alkilatörler 24, G quadruplexes 25 ve oksidatif lezyonlar 5 PHOTOPRODUCTS.

DNA, ek olarak, bu oksidatif metabolizma tarafından üretilen endojen radikal türleri tarafından saldırıya vb radyasyon, ultraviyole ışık, çevresel toksinler, yanma ürünleri gibi eksojen maddeler sürekli saldırı altındadır. Bunların hepsi, kimyasal veya fiziksel olarak DNA 1 bütünlüğünü bozmak için potansiyele sahiptir. genomunda pertübasyonlar lezyon onarımında yer alan proteinleri ve mikroRNA binlerce değilse, yüzlerce, DNA hasarına (DDR), bir işe ve post-translasyonel modifikasyonlar kaskadını aktive edebilirler, hücre döngüsü, apoptoz, yaşlanma ve inflamatuar yolların düzenlenmesi 2. DDR hakkındaki bilgilerin çoğu DSBs ile çalışmalardan gelmektedir. Bunun nedeni canlı hücreler 3&#39;te genomik DNA&#39;da, sekans spesifik sonları dahil, sonları tanıştırmak için teknolojilerin kullanılabilirliği büyük ölçüde olduğunu. Buna ek olarak, propensitsonları y immünofloresansla görüntülenebilir DDR proteinlerin odakları indükleme, kinetik ve yanıt proteinlerinin gereksinimlerini tanımlanması için yararlı olmuştur. DDR eğitimi için anahtar teknolojilerden biri canlı hücreler 4 çekirdeklerinde bir &quot;İlgi Bölgesi&quot; içinde DSBs bir şerit yönlendirmek için (YG) bir lazer ışını kullanılır Bonner ve arkadaşları tarafından tanıtıldı. Aslında, onlar DDR proteinler Immünofloresan tarafından tespit edilebilir ki uzun bir odak oluşturdu. Bu lazer maruz bırakılmış hücreler içinde fosforile histon H2AX güçlü şerit (γ-H2AX) kendi gösterilmesiyle izah edildi. O zamandan beri, lazer yaklaşım DSBs tarafından uyarılan DDR sayısız çalışmalarda kullanılmıştır. Güçlü ve popüler ve dramatik immünfloresans görüntülerin kaynağı olsa da, lezyon kimlik kaygısı olmadan, gözlemlenebilir sonuçlar üretmek üzere en deneylerinde lazer yoğunluğu ayarlanır unutulmamalıdıryoğunluk ya da aralık. Gerçekten de, tahminler yapmak zor olabilir. Böylece büyük ölçüde lazerler 5 ile DNA içine lezyonların çokluğu rağmen göz ardı edilir. Bu literatürde 6&#39;da birçok çelişkiler katkıda bulunur. DSBs aksine, DNA&#39;nın çoğu kimyasal modifikasyonlar, DDR proteinlerin ayrı kümelerle oluşumunu teşvik etmemektedir. Bu lezyon frekanslarının mevcut anlayış ışığında önemlidir. Kültürde insan hücreleri S fazında 7, 8, 9 sırasında büyük ölçüde oluşan hücre döngüsü başına 50 kadar DSBs, tabi olduğu tahmin edilmiştir. Daha az çoğalmayan hücrelerden oluşur. Bu hücre / gün 1, 10 başına binlerce olan nükleobaz kayıp veya değişiklik olaylarının sayısı ile tezat teşkil etmektedir. Böylece, en biliyorNispeten nadir bulunur ve bütünüyle çok daha yaygındır sarmal bozan lezyonlar, neden oldukları hakkında çok az olan olaylar neden olduğu DDR. Genomik DNA modifikasyonları kovalent hücresel yanıtı hakkında sorulara cevap bulmak amacıyla, biz doğal DDR indüksiyon aktivitesine sahip bir helezon bozan DNA adükt ile çalışmak istediğini. Dahası, deneysel tasarım kolaylaştırmak ve yorumlama kimin giriş zamana göre kontrol edilen ve görselleştirme edilebilir niteliktedir edilebilecek bir yapıda ilgi için. Buna göre, psoralen dayalı bir strateji geliştirdi. siteleri: AT psoralenler de 5&#39; TA lehine fotoaktif DNA araya karakterize edilir. nitrojen hardalları ve mitomisin C (MMC) uzun dalga UV (UVB) ışığa maruz sürece, DNA reaktif değildir gibi diğer çapraz bağlama maddeleri aksine. birleştirilmiş moleküller sarmal bozan içi çapraz bağlantılar üretebilme karşıt şeritler üzerindeki timin bazların (ICLs ile reaksiyona) 11. Deneylerde kullanılan trimetil psoralen ile en ürünleri oluşmadığı nispeten az monoadüktler içeren gruptan (% 10&#39;dan az) oluşturulur ICLs, 12 ve bir iplik üzerindeki bitişik bazlar arasında şerit-arası çapraz bağları olan. bunlar sis-platin ve MMC gibi replikasyon ve transkripsiyon, psoralen ve diğer çapraz bağlama maddeleri, güçlü blok için, yaygın olarak kemoterapi kullanılır. Bu nedenle, psoralen bir helis bozan yapı ile DDR aktivasyonunu takip ve aynı zamanda klinik öneme sahip bir bileşiğin hücresel tepki ilişkin bilgi temin çalışmalar sağladı. Bu trimetil psoralen digoksijenin (DIG) ile bağlantılı olduğu bir reaktif sentezlenmiş, bir bitki sterol memeli hücrelerinde bulunan ve sık sık bir immunotag olarak kullanılmaz. fotoaktivasyon şartı canlı hücrelerde çekirdek tanımlanan ROI içinde psoralen ICLs lazer ışığına (365 nm) ile konumlandırılmasına olanak vermektedir. Bunlar imm tarafından görüntülenebilirKazı etiketine karşı unofluorescence. DNA onarımı ve DDR proteinleri ICLs 13, 14 lokal lazer çizgili ortaya çıktı. DSBs üretilmesi için kullanılan yüksek lazer yoğunlukları ile aktive DDR izole edilmiş ya da kümelenmiş hasar 15, 16 nedeniyle olabilir. Sonuç olarak, bu deneyden elde edilen sonuçlar ile ilgisi doğal lezyonlar, bu çok daha düşük bir konsantrasyonda meydana için, kesin değildir. DNA psoralen adükt sıklığı ve aralığı ile ilgili benzer soruları için, DNA elyaf teknolojisi 17 ve immunoquantum noktaların yararlandı. Kuantum nokta floresan boyalar daha parlak ve ışığa maruz kalma ile ağartılmış değildir. Bu nedenle sık sık, tek molekül görüntüleme 18 için kullanılan bir uygulama olan floresan boyalar yeterince parlak. Bireysel DNA lifler g üzerinde gerilebilirkız slaytlar ve hasat hücre önce inkubasyon sırasında dahil nükleosid analogları karşı immünofloresansla görüntülenebilir. Biz Dig-psoralen ile hücreleri tedavi ve lazer mikro ışınımına yatırım getirisi teşhir etti. Elyaf immunoquantum noktalarla görüntülenebildi hücrelerin ve tek tek Dig-psoralen adüktleri hazırlanmıştır. nispeten kısa sürelerde (20-60 dakika), nükleozid analogları ile hücrelerin maruz lazer lokalize ICLs yakın çoğaltma yolları görüntü ile birlikte.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Digoxigenin NHS ester</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11333054001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloro-psoralen</td>
			<td>Berry and Associates</td>
			<td>PS 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diaminoglycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>369519</td>
			<td>4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>423550040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A4524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC plates</td>
			<td>Analtech, Inc.</td>
			<td>P02511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flass glass column 24/40, 100ml</td>
			<td>Chemglass Life Sciences</td>
			<td>CG-1196-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon T2000_E2 spinning disk confocal microscope, equipped with automated stage and environmental control chamber and plate holder</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td>With Volocity Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropoint Galvo&#160;</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td></td>
			<td>with a Nitrogen pulsed laser&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dye cell</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td>MP-2250-2-365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>365 dye</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td>MP-27-365-DYE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IdU&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm glass botomm plates 1.5 coverslip, 10mm glass diameter, uncoated</td>
			<td>Matek</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides</td>
			<td>New Comer Supply</td>
			<td>Part # 5070</td>
			<td>New Silane Slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti BrdU antibody (IdU)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>347580</td>
			<td>1 in 40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti BrdU Antibody (CldU)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6326</td>
			<td>1 in 200&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti Dig antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>710019</td>
			<td>1 in 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-dot 655 goat anti Rabbit IgG</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q-11421MP</td>
			<td>1 in 5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF647- goat anti Rat IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>112-605-167</td>
			<td>1 in 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF488-goat anti mouse IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>115-545-166</td>
			<td>1 in 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss epifluorescent microscope A200</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>&#160;with Axiovision software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-dot 655 filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>39107</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single molecule analysis of laser localized psoralen adducts

DNA hasarı yanıt (DDR) yaygın olarak canlı hücreler lazer mikro ışın demeti radyasyonu ile indüklenen çift iplik kırılmaları (DSB&#39;ler) çalışmalarında karakterize edilmiştir. DDR kol içi çapraz bağlantılar DNA (ICLs) de dahil olmak üzere kovalent DNA modifikasyonları bozucu sarmalı için, hem de tanımlanmamıştır. Biz canlı hücrelerin çekirdeklerinde, immunotagged psoralenler laser fotoaktivasyon tarafından lokalize ICLs tarafından uyarılan DDR, inceledik. yaklaşımlı dağıtım ve çoğaltma çatal karşılaşmalar hakkında temel sorulara cevap bulmak amacıyla, biz iki diğer teknolojilerle lazer yerelleştirme birleştirdi. DNA, elyaf genellikle kısa darbeler sırasında eklenen nükleosit analoglarının immünofloresansla replikasyon çatalları ilerleyişini görüntülemek için kullanılır. Immunoquantum noktalar yaygın tek bir molekül görüntüleme için kullanılmıştır. yeni bir yaklaşım ise, lazer lokalize ICLs taşıyan hücreler DNA lifler mikroskop lamı üzerine yayılır. Etiketlenmiş ICLs immunoquantum noktalar ve inci ile görüntülenirE arası lezyon mesafeleri tespit edilmiştir. ICLs ile Çoğaltma çatal çarpışmalar görülebilir ve farklı karşılaşma desenler belirlendi ve miktarı belirlenir.

Lazer lokalize Dig-TMP (Şekil 1A) ICLs psoralen ile bağlantılı Dig-etiketine karşı immünofloresansla görüntülenebilir. Lazer, herhangi bir konturun bir alanda vurmaya yönelik olmasına rağmen, şeritler hücrelerde &quot;doğal&quot; biçimleri değildir ve yasal sinyalleri kolayca Primer ya da sekonder antikor ile spesifik olmayan bağlanma için eserler ayırt edilebilir. Mükemmel özgüllük daha az antikorlar kullanılırken bu özellik yararlıdır. Dig-TMP ICLs bir şerit DDR, y-H2AX iyi bilinen markeri, bir örneği Şekil 1 B &#39;de gösterilmiştir. Dig immünofloresan adüktlerin sıklığı ve aralığı herhangi bir sonuç izin vermez lazer çizgili lezyon etiketli. yapmak için bu belirleme önce hücreler ICLs tanıtılması, 24 saat boyunca CldU ile inkübe edilmiştir. th karşı boyamae CldU Dig görselleştirme uzun lifler ile ilgili lezyonlar etiketli izin verir ve bu DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol) ya da YOYO {1,1&#39; , direkt lekeleri daha net elyaf kalıpları elde edilir - (4,4,8 , 8-tetrametil-4,8-diazaundecamethylene) [4 - [(3-metil-benzo-1,3-oksazol-2-il) metiliden] -l, 4-dihydroquinolinium] bis tetraiyodid}. Lazer fotoaktivasyonu tarafından ICLs girişten sonra, lifler hedeflenen hücrelerden yayıldı. Örneğin, Şekil 2&#39;de gösterilen gibi lifler üzerinde Dig sinyallerin analizi son yayın 21 de tarif edildiği gibi arası ICL mesafeler, daha büyük 160 kb&#39;ye az 10 kb arasında değiştiğini ortaya koymuştur. kümelenmiş katkılar temin hiçbir kanıt yoktu. Böylece Kazı etiketi ve şerit DDR proteinlerinin birikimi şerit, uzatılmış DNA boyunca ölçüldüğünde en azından, iyi ayrılmış lezyonları yansıtmaktadır. 6 ile, nükleozomal diziler oluşan ICLs durumunda hücresel kromatin açısından bakıldığındauzatılmış DNA uzunluğu sıkıştırma kat, hala DNA&#39;nın yaklaşık 1.6 kb eşdeğeri ile ayrılabilecektir. Lazer neden olduğu DNA hasarına sahip Deneyler genellikle DDR indüksiyonunu takip edin. Bu deneyler nadiren DNA replikasyonu ile ilgili sorularını ilgileniyoruz. Öte yandan, bir DNA elyaf tahliller tipik olarak bir replikasyon çalışmaları için kullanılır. DNA içine dahil olarak halojenlenmiş nükleosid analogları sonuçların kısa darbeler hücrelerin maruz kalma. DNA liflerinin immünofloresan analizi son DNA sentezini temsil dahil analoglarının yolları ortaya koymaktadır. DNA replikasyonu ICL çizgili lokalize lazer meydana eğer sormak ilgi oldu ve eğer öyleyse ne ICLs civarında replikasyon desen olurdu? Hücreler, uzun liflerin bir görüntü olmasını kolaylaştırmak için CldU ile 24 saat süreyle inkübe edildi. Lazer lokalize ICLs Idu 1 saatlik puls ve ardından hücrelere dahil edilmiştir. DNA, f<html> Ibers hedef hücrelerden hazırlanan ve Dig ICLs ve görüntülenen çoğaltma yolları etiketlendi. Sonuçlar psoralen lazer aktivasyonu çoğaltma kapatmaya veya çoğaltma şekilleri sıklığını etkilemediğini göstermiştir. Kısa bir süre önce 21 gösterildiği gibi 1 çoğunluğu: çoğaltma 4 çift taraflı desenleri ile, bir tarafta meydana gelen ve aynı zamanda ICLs her iki tarafında. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55541/55541fig1.jpg" /> Şekil 1: Lazer Lokalize Dig-TMP ICLs üretilmesi. Dig-trimetil psoralen (A) yapısı. Lazer lokalize ICLs (kırmızı Dig) içeren YG γ-H2AX&#39;e (yeşil) (B) Birikim. çekirdeği DAPI (mavi) ile boyandı. aydınlık fotoğraf elmas kalemle yapılan isabetli kısmen bir hücreyi gösterir. nükleollü ve bunların dışında ROI yerleştirilmesi unutmayın.csource.jove.com/files/ftp_upload/55541/55541fig1large.jpg&quot; target = &#39;_ blank&#39;&gt; bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayın. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55541/55541fig2.jpg" /> Şekil 2: Lazer Lokalize Dig-TMP Sinyalleri DNA elyaflar. (A) Hücreler DNA işaretlemek için CldU ile 24 saat süreyle inkübe edildi. Daha sonra bir lazer lokalize ICLs tanıtıldı ve (B) hücreler hasat edilmiştir ve lifler yayıldı. (C, D) Dig sinyaller, bir immunoquantum nokta (kırmızı) ve immünofloresans (yeşil) ile CldU ile sergilendi. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55541/55541fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts at JoVE.com

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

Lazerler sıklıkla DNA hasarına hücre tepkisinin çalışmada kullanılır. Bununla birlikte, normal koşullar altında, aralık, sıklık, ve çarpışmalar çoğaltma çatal nadiren karakterize lezyonlar üretir. Burada, lazer lokalize kol içi çapraz bağlar ile bu parametrelerin belirlenmesini sağlayan bir yaklaşım açıklar.

Lazer Lokalize Psoralen adüktlerinin Tek Molekül Analizi

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

single-molecule-analysis-of-laser-localized-psoralen-adducts

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

6.6K Görüntüleme.  National Institute on Aging, National Institutes of Health.  Lazerler sıklıkla DNA hasarına hücre tepkisinin çalışmada kullanılır. Bununla birlikte, normal koşullar altında, aralık, sıklık, ve çarpışmalar çoğaltma çatal nadiren karakterize lezyonlar üretir. Burada, lazer lokalize kol içi çapraz bağlar ile bu parametrelerin belirlenmesini sağlayan bir yaklaşım açıklar. 

Video: Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.

This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

Lazer destekli Hayvancılık Zigotlann Sitoplazmik Mikroenjeksiyon

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

Genetik

Metagenomic Analysis of Silage

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of the microbial communities present within them. Two main metagenomic approaches exist; sequencing the 16S rRNA gene coding region, which exhibits sufficient variation between taxa for identification, and shotgun sequencing, in which genomes of the organisms that are present in the sample are analyzed and ascribed to "operational taxonomic units"; species, genera or families depending on the extent of sequencing coverage. 
In this study, shotgun sequencing was used to analyze the microbial community present in cattle silage and, coupled with a range of bioinformatics tools to quality check and filter the DNA sequence reads, perform taxonomic classification of the microbial populations present within the sampled silage, and achieve functional annotation of the sequences. These methods were employed to identify potentially harmful bacteria that existed within the silage, an indication of silage spoilage. If spoiled silage is not remediated, then upon ingestion it could be potentially fatal to the livestock.

Metagenomics was used to investigate the microbiome of silage cattle feed. Analysis was performed by shotgun sequencing. This approach was used to characterize the composition of the microbial community within the cattle feed.

Yemlerin metagenomic Analizi

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

Tek Hücre sıralama kullanarak Kopya sayısı Değişmeler Algılama

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA interactions such as microRNA-mRNA interactions have been shown to regulate gene expression, the full extent to which RNA interactions occur in the cell is still unknown. Previous methods to study RNA interactions have primarily focused on subsets of RNAs that are interacting with a particular protein or RNA species. Here, we detail a method named Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH) that allows genome-wide capture of RNA interactions in vivo in an unbiased manner. SPLASH utilizes in vivo crosslinking, proximity ligation, and high throughput sequencing to identify intramolecular and intermolecular RNA base-pairing partners globally. SPLASH can be applied to different organisms including bacteria, yeast and human cells, as well as diverse cellular conditions to facilitate the understanding of the dynamics of RNA organization under diverse cellular contexts. The entire experimental SPLASH protocol takes about 5 days to complete and the computational workflow takes about 7 days to complete.

Here, we detail the method of Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH), which enables genome-wide mapping of intramolecular and intermolecular RNA-RNA interactions in vivo. SPLASH can be applied to study RNA interactomes of organisms including yeast, bacteria and humans.

RNA-RNA Etkileşmelerini Biyotinlenmiş Psooren Kullanarak Küresel Olarak Haritalama

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation became a valuable experimental tool to investigate the DNA damage response (DDR) in vivo. It allows real-time high-resolution single-cell analysis of macromolecular dynamics in response to laser-induced damage confined to a submicrometer region in the cell nucleus. However, various laser conditions have been used without appreciation of differences in the types of damage induced. As a result, the nature of the damage is often not well characterized or controlled, causing apparent inconsistencies in the recruitment or modification profiles. We demonstrated that different irradiation conditions (i.e., different wavelengths as well as different input powers (irradiances) of a femtosecond (fs) near-infrared (NIR) laser) induced distinct DDR and repair protein assemblies. This reflects the type of DNA damage produced. This protocol describes how titration of laser input power allows induction of different amounts and complexities of DNA damage, which can easily be monitored by detection of base and crosslinking damages, differential poly (ADP-ribose) (PAR) signaling, and pathway-specific repair factor assemblies at damage sites. Once the damage conditions are determined, it is possible to investigate the effects of different damage complexity and differential damage signaling as well as depletion of upstream factor(s) on any factor of interest.

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

The goal of this protocol is to describe how to use laser microirradiation to induce different types of DNA damage, including relatively simple strand breaks and complex damage, to study DNA damage signaling and repair factor assembly at damage sites in vivo.

Vivo hücresel yanıt-e doğru basit ve karmaşık DNA hasarı incelemek için lazer Microirradiation

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for example, during cellular differentiation, morphogenesis, and functional stimulation (such as activation of immune cells), or after exposure to drugs and other factors from the local environment. Depending on the stimulus and cell type, these changes occur rapidly and at any possible level of gene regulation. Displaying all molecular processes of a responding cell to a certain type of stimulus/drug is one of the hardest tasks in molecular biology. Here, we describe a protocol that enables the simultaneous analysis of multiple layers of gene regulation. We compare, in particular, transcription factor binding (Chromatin-immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq)), de novo transcription (4-thiouridine-sequencing (4sU-seq)), mRNA processing, and turnover as well as translation (ribosome profiling). By combining these methods, it is possible to display a detailed and genome-wide course of action.
Sequencing newly transcribed RNA is especially recommended when analyzing rapidly adapting or changing systems, since this depicts the transcriptional activity of all genes during the time of 4sU exposure (irrespective of whether they are up- or downregulated). The combinatorial use of total RNA-seq and ribosome profiling additionally allows the calculation of RNA turnover and translation rates. Bioinformatic analysis of high-throughput sequencing results allows for many means for analysis and interpretation of the data. The generated data also enables tracking co-transcriptional and alternative splicing, just to mention a few possible outcomes.
The combined approach described here can be applied for different model organisms or cell types, including primary cells. Furthermore, we provide detailed protocols for each method used, including quality controls, and discuss potential problems and pitfalls.

This protocol describes the combinatorial use of ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq, and ribosome profiling for cell lines and primary cells. It enables tracking changes in transcription-factor binding, de novo transcription, RNA processing, turnover and translation over time, and displaying the overall course of events in activated and/or rapidly changing cells.

Gerçek zamanlı analiz bağlama, transkripsiyon, çeviri ve ciro hücresel etkinleştirme sırasında küresel olayları görüntülemek üzere transkripsiyon faktörü

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand genome maintenance mechanisms. Since recruitment and exchange of proteins at lesions are highly dynamic, their study requires the ability to generate DNA damage in a rapid and spatially-delimited manner. Here, we describe procedures to locally induce DNA damage in human cells using a commonly available laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser line. Accumulation of genome maintenance factors at laser stripes can be assessed by immunofluorescence (IF) or in real-time using proteins tagged with fluorescent reporters. Using phosphorylated histone H2A.X (&#947;-H2A.X) and Replication Protein A (RPA) as markers, the method provides sufficient resolution to discriminate locally-recruited factors from those that spread on adjacent chromatin. We further provide ImageJ-based scripts to efficiently monitor the kinetics of protein relocalization at DNA damage sites. These refinements greatly simplify the study of the DDR dynamics.

Studying DNA damage repair kinetics requires a system to induce lesions at defined sub-nuclear regions. We describe a method to create localized double-stranded breaks using a laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser and provide automated procedures to quantify the dynamics of repair factors at these lesions.

Soruşturma 405 Nm lazer mikro-ile kullanarak DNA lezyonlar için Protein alımı

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect and count individual RNA molecules. Complementary to deep sequencing-based methods, smFISH provides information about the cell-to-cell variation in transcript abundance and the subcellular localization of a given RNA. Recently, we have used smFISH to study the expression of the gene&#160;NDC80&#160;during meiosis in budding yeast, in which two transcript isoforms exist and the short transcript isoform has its entire sequence shared with the long isoform. To confidently identify each transcript isoform, we optimized known smFISH protocols and obtained high consistency and quality of smFISH data for the samples acquired during budding yeast meiosis. Here, we describe this optimized protocol, the criteria that we use to determine whether high quality of smFISH data is obtained, and some tips for implementing this protocol in&#160;other yeast strains and growth conditions.

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

This single molecule fluorescence in situ hybridization protocol is optimized to quantify the number of RNA molecules in budding yeast during vegetative growth and meiosis.

Tek molekül floresans In Situ hibridizasyon (smFISH) analizi Budding Maya bitkisel büyüme ve mayoz

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences is desired. We herein provide a detailed in vitro and in-cell selective 2&#39;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) protocol to study the RNA structural change in the presence of an experimental drug for spinal muscular atrophy (SMA), survival of motor neuron (SMN)-C2, and in exon 7 of the pre-mRNA of the SMN2 gene. In in vitro SHAPE, an RNA sequence of 140 nucleotides containing SMN2 exon 7 is transcribed by T7 RNA polymerase, folded in the presence of SMN-C2, and subsequently modified by a mild 2&#39;-OH acylation reagent, 2-methylnicotinic acid imidazolide (NAI). This 2&#39;-OH-NAI adduct is further probed by a 32P-labeled primer extension and resolved by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Conversely, 2&#39;-OH acylation in in-cell SHAPE takes place in situ with SMN-C2 bound cellular RNA in living cells. The pre-mRNA sequence of exon 7 in the SMN2 gene, along with SHAPE-induced mutations in the primer extension, was then amplified by PCR and subject to next-generation sequencing. Comparing the two methodologies, in vitro SHAPE is a more cost-effective method and does not require computational power to visualize results. However, the in vitro SHAPE-derived RNA model sometimes deviates from the secondary structure in a cellular context, likely due to the loss of all interactions with RNA-binding proteins. In-cell SHAPE does not need a radioactive material workplace and yields a more accurate RNA secondary structure in the cellular context. Furthermore, in-cell SHAPE is usually applicable for a larger range of RNA sequences (~1,000 nucleotides) by utilizing next-generation sequencing, compared to in vitro SHAPE (~200 nucleotides) that usually relies on PAGE analysis. In case of exon 7 in SMN2 pre-mRNA, the in vitro and in-cell SHAPE derived RNA models are similar to each other.

Detailed protocols for both in vitro and in-cell selective 2&#39;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) experiments to determine the secondary structure of pre-mRNA sequences of interest in the presence of an RNA-targeting small molecule are presented in this article.

İn vitro ve hücre içi şeklinde küçük molekül araştırmak için kullanarak Pre-mRNA yapısal değişiklikler indüklenen

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), quantitative, real-time RT-PCR (RT-qPCR) and RNA sequencing. When these techniques are performed using a single oocyte or embryo, low-copy mRNAs are not reliably detected. To overcome this problem, oocytes or embryos can be pooled together for analysis; however, this often leads to high variability amongst samples. In this protocol, we describe the use of fluorescence in situ hybridization (FISH) using branched DNA chemistry. This technique identifies the spatial pattern of mRNAs in individual cells. When the technique is coupled with Spot Finding and Tracking&#160;computer software, the abundance of mRNAs in the cell can also be quantified. Using this technique, there is reduced variability within an experimental group and fewer oocytes and embryos are required to detect significant differences between experimental groups. Commercially available branched-DNA SM-FISH kits have been optimized to detect mRNAs in sectioned tissues or adherent cells on slides. However, oocytes do not effectively adhere to slides and some reagents in the kit were too harsh resulting in oocyte lysis. To prevent this lysis, several modifications were made to the FISH kit. Specifically, oocyte permeabilization and wash&#160;buffers designed for the immunofluorescence of oocytes and embryos replaced the proprietary buffers. The permeabilization, washes, and incubations with probes and amplifier were performed in 6-well plates and oocytes were placed on slides at the end of the protocol using mounting media. These modifications were able to overcome the limitations of the commercially available kit, in particular, the oocyte lysis. To accurately and reproducibly count the number of mRNAs in individual oocytes, computer software was used. Together, this protocol represents an alternative to PCR and sequencing to compare the expression of specific transcripts in single cells.

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

To reproducibly count the numbers of mRNAs in individual oocytes, single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) was optimized for non-adherent cells. Oocytes were collected, hybridized with the transcript specific probes, and quantified using an image quantification software.