A análise de fibras de DNA nos permite entender como os nanomateriais impactam o DNA em nível molecular único. E essas informações permitirão desenvolver estratégias que reduzam a nanotoxicidade. Esta técnica permite-nos compreender a dinâmica do ADN e como é impactado quando as células ou tecidos são expostos a agentes prejudiciais do ADN, exógenos ou endógenos, e podemos olhar para a replicação do ADN, reparação do ADN e dinâmica da cromatina Estudar a dinâmica da replicação do ADN e o mecanismo de reparação ajudará no desenvolvimento de estratégias que irão melhorar a eficácia do material terapêutico ou reduzir o efeito fora do alvo da nanomedicina.
O que realmente queremos que as pessoas saibam sobre essa técnica é que são as diferentes coisas que podemos ou uma pessoa pode fazer. Uma delas é entender como novos agentes quimioterápicos podem afetar a saúde de uma célula, para ver se você pode matá-los mais rápido ou com mais eficiência. A próxima coisa é pensar em quando você está adicionando um agente, digamos que é um novo agente terapêutico ou farmacêutico, você quer saber se vai machucar uma pessoa antes de dá-lo a ela.
Então, portanto, você pode simplesmente dar o agente para células ou sistemas modelo e ver se ele prejudica as células ou o sistema modelo e, em caso afirmativo, quanto? A próxima coisa é meio que olhar, estamos desenvolvendo todos esses novos nanomedicamentos e queremos ter certeza de que esses nanomedicamentos não prejudicam uma pessoa ou o local onde estamos injetando a nanomedicina. A última coisa é que às vezes você quer saber como uma proteína afeta a replicação do DNA, o reparo do DNA ou a dinâmica da cromatina e podemos usar essa técnica para poder fazer isso.
Esta é Shirali Patel, estudante de mestrado em pesquisa em biotecnologia médica em meu laboratório, que estará demonstrando o procedimento. Comece a preparação do ensaio de fibras removendo o meio de 75% a 80% de células de macrófagos RAW 264,5 confluentes e dividindo-o em duas metades. Reserve metade para o pulso de cloro-iododesoxiuridina ou reserva de cloro-iododesoxiuridina e adicione cinco microlitros de iododesoxiuridina à outra metade, fazendo 50 micromoles como concentração final.
Após a mistura, adicione o meio contendo iododesoxiuridina de volta às placas e coloque as células na incubadora por 20 minutos. Pré-aquecer o meio de reserva de cloro-iododesoxiuridina a 37 graus Celsius e adicionar cloro-iododesoxiuridina a este meio antes do pulso de cloro-iododesoxiuridina. Após 20 minutos, aspirar a mistura do meio iododesoxiuridina do frasco de células de macrófagos RAW 264.5.
Lave suavemente as células com 500 microlitros de PBS, com pH de 7,4, e gire a placa antes de descartar o PBS. Tratar as células com várias concentrações de nanopartículas de óxido de grafeno em 500 microlitros do meio e incubar por 30 minutos. Após a incubação, aspirar a mistura de meio de tratamento e lavar suavemente as células com 500 microlitros de PBS, girando suavemente a placa antes de descartar o PBS.
Em seguida, adicione cinco microlitros de cloro-iododesoxiuridina ao meio de reserva de cloro-iododesoxiuridina e cubra as células com o meio de reserva de cloro-iododesoxiuridina. Para o pulso de cloro-iododesoxiuridina, coloque as células na incubadora por 20 minutos. Após uma lavagem PBS, raspe as células por três a quatro minutos, adicione cinco mililitros de meio à placa e colete as células.
Centrifugar as células coletadas a 264G por quatro minutos. Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em um mililitro de PBS gelado. Para preparar as fibras de DNA, rotule as lâminas de vidro com a condição experimental e data, usando um lápis.
Aspirar dois microlitros de células em uma pipeta e segure a pipeta em um ângulo de aproximadamente 45 graus. Em seguida, coloque a pipeta cerca de um centímetro abaixo da etiqueta da lâmina e mova a pipeta horizontalmente em direção à etiqueta da lâmina com uma liberação lenta da solução da célula. Uma vez que a solução evapora e parece pegajosa e pegajosa, sobreponha cada linha de células com 15 microlitros de tampão de lise sem deixar a ponta da pipeta tocar a lâmina.
Em seguida, incline a lâmina em um ângulo de 25 graus e deixe o DNA se espalhar para secar ao ar por um mínimo de quatro horas. No primeiro dia, fixe as fibras de DNA imergindo as lâminas em metanol ácido acético por dois minutos. No segundo dia, coloque as lâminas em um suporte de vidro e incube-as a 20 graus Celsius por um mínimo de 24 horas.
Para desnaturar o DNA, prepare uma câmara umidificada e coloque as lâminas cuidadosamente em um frasco Coplin contendo água deionizada, ou DI, garantindo que as superfícies revestidas não toquem nas paredes do frasco. Após 20 segundos de incubação, despeje a água. Adicione ácido clorídrico 2,5 molar ao frasco de Coplin, cobrindo todas as lâminas.
Após 80 minutos de incubação, dar uma lavagem com PBS mais 0,1% de Tween, seguida de duas lavagens com PBS por três minutos cada em temperatura ambiente. Para imunomarcação, colocar as lâminas na câmara umidificada e bloqueá-las com albumina de soro bovino a 5%, ou BSA, em PBS por 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, cubra as lâminas com uma folha de plástico transparente.
Após o bloqueio, remova a tampa e adicione 100 microlitros da solução de anticorpos primários ao longo do comprimento da lâmina. Adicione uma nova tampa plástica e aguarde duas horas. Após duas horas, retire a solução de anticorpos e lave as lâminas em um frasco de Coplin preenchido com PBS duas vezes.
Bloqueie as lâminas novamente adicionando 200 microlitros de 5% BSA ao longo da lâmina. Adicione uma tampa plástica e incube por 15 minutos. Depois de retirar a folha de cobertura e remover o excesso de BSA usando uma toalha de papel, adicione 100 microlitros da solução de anticorpos secundários ao longo do comprimento da lâmina e coloque uma nova folha de plástico na tampa.
Após uma hora, retire a tampa, retire o excesso de BSA em um papel toalha e lave as lâminas duas vezes em PBS. Adicione 100 microlitros da solução de anticorpos terciários ao longo do comprimento da lâmina e coloque uma nova tampa plástica. Novamente, adicione 200 microlitros de BSA 5% ao longo de cada lâmina e incube por 15 minutos.
Após três lavagens com PBS, retire o excesso de PBS e deixe-os secar completamente. Depois de seco, adicione o meio de montagem na corrediça e coloque tampas de vidro sem permitir a formação de bolhas. Visualize as fibras de DNA imunomarcadas usando um microscópio de imunofluorescência equipado com uma câmera, uma objetiva de 60x e conjuntos de filtros apropriados para detectar os corantes Alexa Fluor 488 e 594.
A variação nos padrões de replicação após exposição prolongada aos nanomateriais foi determinada comparando-se os padrões de replicação das células antes e após a exposição às nanopartículas de iododesoxiuridina e cloro-iododesoxiuridina. Imagens de análise e interpretação de fibras de DNA revelaram um padrão para células de macrófagos controle e DNA de macrófagos tratados com óxido de grafeno-nanopartículas. A variação foi observada no padrão de replicação dos intermediários, mostrando um aumento de novas origens em uma região diferente da mesma condição.
Os dados conclusivos das fibras foram obtidos dividindo-se a área total da lâmina em cinco a seis regiões e obtendo-se múltiplas imagens de cada região. A seleção de cerca de 500 intermediários de múltiplas lâminas ou condições foi ideal para investigar a variação na dinâmica de replicação do DNA. A análise também indicou um aumento nas faixas vermelhas, indicando determinações e uma diminuição nas origens recém-queimadas nas células tratadas com óxido de grafeno em comparação com o controle.
A qualidade da propagação da fibra de DNA depende de quão bem as fibras se espalham umas das outras e que elas não se sobrepõem. Uma vez que as fibras foram espalhadas e IdU e CldU foram corados, é extremamente importante encontrar as fibras de DNA. Uma das coisas que você pode fazer depois de fazer as fibras de DNA é, uma, você pode observar como a dinâmica de replicação é afetada.
Segundo, você pode olhar onde o dano ao DNA está localizado em relação às trilhas de replicação do DNA. E a última coisa é que, se você usar as sondas FISH, você pode realmente olhar para regiões específicas e como elas são impactadas por esse dano ao DNA. Essa técnica abre caminho para o desenvolvimento de drogas quimioterápicas, design de drogas e compreensão de como a replicação do DNA é impactada por vários tipos de proteínas.
