Bu tahlil metodolojisi, kan evresi sıtmasına karşı hücre bağışıklığı bilgisinde, yeni terapötik hedeflerin ortaya çıkarılmasına ve sıtma aşısının ilerlemesinin hızlandırılmasına yardımcı olan büyük bir ilerlemedir. İnsan veya hayvan örnekleri için kullanılabilecek bir plazmodyum in vitro testinin oluşturulması, sıtma patogenezinin daha iyi anlaşılması için değerlidir. Koruyucu sıtma bağışıklığı tam olarak anlaşılamamıştır.
Yeni tedavilerin geliştirilmesi için, sıtma paraziter evresine karşı hücre bağışıklığı mekanizmalarını araştırmak esastır. Prosedürü gösteren ben, Luna de Lacerda ve Caroline'in laboratuvarından bir lisans öğrencisi olan Christopher Gomes olacak. Başlamak için, 100 mikrolitre heparin çözeltisini 26 gauge iğne ile bir mililitrelik bir şırıngaya aspire edin.
Fareyi yan tarafına yerleştirin ve iğneyi dirseğin hemen altına, kaburgaların içinden ve kalbe dik olarak yerleştirin. Şırınga pistonunu yavaşça dışarı çekin ve iğneyi 0,5 ila bir mililitre kan elde edilene kadar döndürün. Farenin sol tarafını %70 etanol ile aseptik olarak temizleyin.
Cerrahi makas ile, farenin sol tarafında, deriden ve peritondan geçerek bir kesim yapın. Dalağı bulun ve çıkarın. İstenilen efektör hücre popülasyonunu saflaştırmak için fare dalağını beş mililitre tam ortama sahip bir Petri kabına yerleştirin.
50 mililitrelik bir konik tüpün üzerine 100 mikromolar hücreli bir süzgeç yerleştirin ve eksize edilen dalağı anatomik forsepsler kullanarak hücre süzgecine aktarın. Dalağı süzgeçten bir şırınga pistonuyla ezin. Hücreleri süzgeçten 10 mililitre tam ortam ile yıkayın.
Hücreleri 300 G'de dört santigrat derecede 10 dakika boyunca santrifüj edin. Ardından, süpernatanı atın. Hücre peletini iki mililitre soğuk RBC lizis tamponunda tekrar askıya alın ve süspansiyonu buz üzerinde beş dakika boyunca inkübe edin.
Hücre süspansiyonunu 10 mililitre dört santigrat derece tam ortam ile yıkayın ve plazmodyum ile enfekte olmuş farelerden gelen dalaklar için yıkamalar arasındaki hücre pıhtılarını çıkarın. Hücreleri 400 G'de dört santigrat derecede beş dakika boyunca santrifüj edin. Ardından, süpernatanı atın.
Şimdi manyetik alana bir LS veya LD sütunu yerleştirin ve sütunu üç mililitre MACS tamponu ile durulayarak hazırlayın. Ardından, sütuna hücre askıya alma işlemi uygulayın. Kolonu üç mililitre MACS tamponu ile üç kez yıkadıktan sonra, dalak hücrelerini içeren akışı toplayın.
Dalak hücrelerinin 10 mikrolitresini toplayın ve hücre canlılığını kontrol etmek için 10 mikrolitre tripan mavisi ekleyin. Hücreleri hemositometreye ekleyin. Splenositleri tripan mavisi bir çözelti içinde sayın ve hücre canlılığını kontrol edin.
Tüm splenositleri santrifüj edin ve süpernatanı atın. Hücre peletini 40 mikrolitre MACS tamponunda yeniden askıya alın. Hücrelere 10 mikrolitre biyotin antikor kokteyli ekleyin, iyice karıştırın ve buz üzerinde beş dakika inkübe edin.
Anti-biyotin mikroboncuklarını buz üzerinde 10 dakika inkübe ettikten sonra, MACS LS sütununu manyetik alan desteğine yerleştirin ve kolonu üç mililitre MACS tamponu ile durulayarak hazırlayın. Sütuna hücre süspansiyonu uygulayın. Kolonu üç mililitre MACS tamponu ile üç kez yıkayın ve etiketlenmemiş tüm sitotoksik hücreleri içeren akışı toplayın.
Toplanan kanı beş dakika boyunca 350 kez G'de santrifüj ettikten sonra, serumu atın ve kanı FBS olmadan bir mililitre RPMI'da yeniden askıya alın. LS sütununu manyetik alan desteğine yerleştirdikten sonra, RPMI ile durulayın ve RBC süspansiyonunu kolondan geçirin. Hücreler kolondan geçtikten sonra, akışı santrifüj edin, süpernatanı atın ve daha fazla iRBC'yi izole etmek için akışın bir mililitresini sütuna yeniden uygulayın.
Kolonu beş mililitre RPMI ile iki kez yıkayın. Kolon haznesi boşalır boşalmaz tampon alikotları ekleyerek yıkama adımlarını gerçekleştirin. Beş mililitre RPMI ekleyin, sütunu çıkarın ve iRBC'leri yeni bir 15 mililitrelik tüpe boşaltın.
FBS olmadan bir mililitre RPMI'da 10 milimolar CFSE çözeltisinin bir mikrolitresini seyreltin. RBC'leri FBS olmadan 500 mililitre RPMI'da askıya aldıktan sonra, 500 mililitre seyreltilmiş CFSE ekleyin ve ışıktan korunan oda sıcaklığında sekiz dakika inkübe edin. Hücreleri 14 mililitre tam ortam ile üç kez yıkayın ve hücreleri iki kez santrifüj edin.
Sitotoksik lenfosit ko-kültürü için, hücreleri 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı bir plakada plakalayın. Saflaştırılmış lenfositleri ve CFSE etiketli iRBC'leri istenen efektör/hedef hücre oranında 200 mililitrelik nihai hacme ekleyin ve homojenize edin. Her koşulu üçlü olarak hazırlayın ve hücreleri 37 santigrat derecede inkübe edin.
İRBC'ler, LS sütunları kullanılarak P.yoelii ile enfekte olmuş farelerden saflaştırıldı. Saflaştırma, kolon zenginleştirmeden önce ve sonra toplanan kandan kan yaymaları ile vurgulanır. RBC lizis yüzdesini değerlendirmek için gereken geçit stratejisi burada sunulmuştur.
Durdurma kapısı, sayma boncuk popülasyonuna ayarlanır. Geçit stratejisi, ileri saçılma tepe yükseklik-alan oranına göre enkaz hariç tek hücrelerin seçilmesiyle başlatılır, ardından Ter119 + ve CD8'deki RBC popülasyonunun seçilmesi ile başlar - Ardından, canlı IBC'leri CFSE yüksek pozitif olarak seçin. İşte oranları hedeflemek için farklı efektörler kullanan deneysel bir örneğe uygulanan analiz, ortak kültürden sonra canlı RBC'leri görüntüler.
RBC lizis yüzdesinin grafiksel bir gösterimi, bu formüle dayanarak hesaplanan gösterilir. Sitotoksik CD8 veya naif CD8 kullanan gruplar arasındaki anlamlılık, çoklu karşılaştırmalarla iki yönlü ANOVA ile değerlendirildi. Mevcut yöntem, öldürücü hücrelerle doğrudan hücre teması yoluyla RBC lizizini araştırmaktadır ve spesifik reseptörlere veya moleküllere bloke edici antikorlar kullanarak ilgili mekanizmaları ortaya çıkarmak planlanabilir.
Bu in vitro öldürme testi, yeni sıtma tedavilerinin ve aşılarının ilerlemesine yardımcı olacak kan evresi sıtmasına karşı hücre aracılı bağışıklık mekanizmalarını açıklığa kavuşturmak için yeni bir strateji sunmaktadır.
