Entomopatojenik mantarların izolasyonu, bir biyopestisit geliştirmek için önemlidir ve bu özel grubun çeşitliliğini, dağılımını ve ekolojisini incelemek için yararlı olabilir. Entomopatojenik mantarları izole etmek için böcek yemlerinin kullanılması düşük maliyetli ve oldukça verimli bir yöntem olarak kabul edilir. kloramfenikol, tiyabendazol, sikloheksimid, yapay ortam dodin kullanmaz ve toprak numunesi işleminde daha az yer gerektirir.
Kritik adımlar, diğer mantarların gelişme halindeki entomopatojenik mantarların daralmasını ve entomopatojenik mantarları önlemek için bir ve iki hafta sonra CTC plakalarının araştırılmasını ve daha sonra makro morfolojilerine ve mikro morfolojilerine dayanarak entomopatojenik mantar kolonilerinin tanımlanmasını içerir. Küçük bir kürek kullanarak 800 gram toprağı 10 santimetre derinliğe kadar toplayarak başlayın. Numuneleri, deneyin başlangıcına kadar oda sıcaklığında polipropilen torbalarda saklayın.
Entomopatojenik mantarların rizosfer yeterliliğine sahip olduğu bilindiğinden küçük kökler de toplanabilir. Kloramfenikol, tiyabendazol, sikloheksimid veya CTC seçici yapay ortam kullanarak mantarların izolasyonu için, kökleri olan veya olmayan toprak örneğinin 0.35 gramını tartın. Bu örneği 1,5 mililitrelik bir mikrotüpe yerleştirin.
Bir biyogüvenlik kabininde çalışırken, toprak içeren mikrotüpe bir mililitre steril 0.01 hacim yüzde polioksietilen sorbitan monooleat sulu süspansiyon ekleyin ve tüpü 30 saniye boyunca vorteksleyin. Tamamlandığında, süpernatantın 50 mikrolitresini CTC ortamı ile Petri plakalarının merkezine çıkarın ve pipetleyin. Ardından, süspansiyonları ortamın yüzeyine homojen bir şekilde dağıtmak için altı milimetre çapında steril bir Drigalski spatulası kullanın.
İklim odalarındaki plakaları 25 santigrat derecede ve karanlıkta en az% 80 bağıl nemde inkübe edin. Yedi, 14 ve 21 günlük inkübasyondan sonra, mantar kolonilerinin büyümesi için plakaları gözlemleyin. Yüzey dezenfekte edilmiş Galleria mellonella ve Tenebrio molitor geç evre larvalarını böcek yemleri olarak kullanarak mantarları izole etmek.
Larvaları sterilizasyon için bir dakika boyunca% 0.5 sodyum hipoklorite batırın. Sonra larvaları iki kez steril suyla yıkayın. Yemleri, toplanan toprağın 250 gramını içeren kapakta 10 milimetre çapında 10 küçük delikli plastik kaplarda birleştirin.
Larvaların toprakla maksimum temasına izin vermek için toprağı her gün homojenize edin ve ölü böcekleri arayarak saksıları günlük olarak analiz edin. Ölü böcekleri tencereden çıkardıktan sonra, böcekleri bir dakika boyunca% 0.5 sodyum hipoklorit ile yüzeysel olarak sterilize edin. Mikozu desteklemek için, steril böcekleri yedi gün boyunca% 80 bağıl nemde ve 25 santigrat derecede nemli bir odaya yerleştirin.
Mikozda, konidiayı böcek yüzeyinden toplayın ve mikrobiyolojik döngünün yardımıyla, konidiayı stereoskopik bir mikroskop altında% 0.05 kloramfenikol veya PDAC ortamı içeren patates dekstroz agar ortamına yerleştirin. Alternatif olarak, enfekte olmuş larvaların tamamını PDAC ortamına yerleştirin. Ve kültür plakalarını daha önce açıklandığı gibi bir iklim odasında kuluçkaya yatırın.
14 günlük inkübasyondan sonra, makalede açıklandığı gibi plakalardaki mantar kültürlerinin makro morfolojik özelliklerini analiz ederek EPF türlerini tanımlayın. Daha sonra hava konidiasını üç gün boyunca% 80 bağıl nem ve 25 santigrat derecede kültürleri kaydırmak için aktarın. Üç gün sonra, mikroskobik özellikleri gözlemlemek için slaytı laktofenol mavisi ile boyayın.
Optik mikroskop altında, konidianın düzenlenmesi, konidioforları, şekli ve büyüklüğü gibi mantar yapılarını 400 kez gözlemleyin ve EPF tanımlamasını onaylayın. Çalışmada, Metarhizium ve Beaveria türlerinin 51 EPF suşu 524 toprak örneğinden izole edildi. Temsili analiz, Metarhizium türlerinin ve Beaveria türlerinin birkaç izolatının mikromorfolojik özelliklerini göstermektedir.
24 toprak örneğinde EPF oluşumu üç farklı izolasyon yöntemi kullanılarak incelenmiştir. Galleria mellonella yeminin izolasyonda daha verimli olduğu kanıtlandı, bunu Tenebrio molitor yemi ve CTC ortamı izledi. Aynı 24 toprak örneği, Kunduz türlerinin geri kazanıldığını göstermedi, sadece Metarhizium'u gösterdi.
Hatırlanması gereken en önemli şeyler, hava konidiasının mikroskop özelliklerini gözlemleyerek kayan kaplamaya aktarılması ve morfolojik anahtarlar kullanılarak entomopatojenik mantarların tanımlanmasının doğrulanmasıdır. Ek yöntemler, dodin gibi kirleticilerin büyümesini azaltmak için belirli bir kimyasal maddeyle diğer seçici yapay ortamların kullanılmasını içerir. Olağanüstü biyo kontrol özelliklerine sahip yeni mantar izolatlarının aranması, eklembacaklı-haşere kontrolünde mantar etkinliğini arttırmak ve omurgasız patoloji alanındaki diğer soruları araştırmak için çok önemlidir.
