Выделение энтомопатогенных грибов имеет важное значение для разработки биопестицида и может быть полезно для изучения разнообразия, распространения и экологии этой конкретной группы. Использование приманок от насекомых для выделения энтомопатогенных грибов считается недорогим и высокоэффективным методом. хлорамфеникол, тиабендазол, циклогексимид, искусственные среды не используют додин и требуют меньше места в процессе отбора проб почвы.
Критические шаги включают исследование пластин CTC через одну и две недели, чтобы предотвратить сужение других грибов и развитие энтомопатогенных грибов, а затем идентификацию колоний энтомопатогенных грибов на основе их макроморфологии и микроморфологии. Начните со сбора 800 граммов грунта на глубину 10 сантиметров с помощью небольшой лопаты. Храните образцы в полипропиленовых мешках при комнатной температуре до начала эксперимента.
Небольшие корни также могут быть собраны, поскольку энтомопатогенные грибы, как известно, обладают ризосферной компетенцией. Для выделения грибов с использованием хлорамфеникола, тиабендазола, циклогексимида или селективной искусственной среды CTC взвесьте 0,35 г образца почвы с корнями или без них. Поместите этот образец в микропробирку размером 1,5 миллилитра.
Во время работы в шкафу биобезопасности добавьте один миллилитр стерильного 0,01 объемного процента полиоксиэтиленсорбитана моноолеатной водной суспензии в микротрубку, содержащую почву, и вихрь трубки в течение 30 секунд. Когда это будет сделано, снимите и пипетку 50 микролитров супернатанта на центр пластин Петри со средой CTC. Затем используйте стерильный дригальский шпатель диаметром шесть миллиметров для равномерного рассеивания суспензий по поверхности среды.
Инкубируйте плиты в климатических камерах при температуре 25 градусов цельсия и минимальной относительной влажности 80% в темноте. После семи, 14 и 21 дня инкубации наблюдайте за пластинами для роста колоний грибов. Для выделения грибов используют в качестве приманок для насекомых дезинфицируемые поверхностные Galleria mellonella и Tenebrio molitor поздней стадии личинок.
Погрузите личинку в 0,5% гипохлорит натрия на одну минуту для стерилизации. Затем дважды промыть личинок стерильной водой. Соберите приманки в пластиковые горшки с 10 небольшими отверстиями диаметром 10 миллиметров в крышке, содержащей 250 грамм собранного грунта.
Гомогенизируйте почву через день, чтобы обеспечить максимальный контакт личинок с почвой и ежедневно анализируйте горшки, ища мертвых насекомых. После удаления мертвых насекомых из горшка поверхностно стерилизуйте насекомых 0,5% гипохлорита натрия в течение одной минуты. Чтобы облегчить микоз, поместите стерильных насекомых во влажную камеру при относительной влажности 80% и 25 градусах Цельсия на семь дней.
При микозе собирают конидии с поверхности насекомого и с помощью микробиологической петли помещают конидии на среду агара декстрозы картофеля, содержащую 0,05% хлорамфеникола или среду PDAC под стереоскопическим микроскопом. В качестве альтернативы поместите целых инфицированных личинок в среду PDAC. И инкубируйте культурные пластины в климатической камере, как объяснялось ранее.
После 14 дней инкубации определите виды EPF, проанализировав макроморфологические характеристики грибковых культур на пластинах, как описано в рукописи. Далее перекладывают воздушные конидии на скользящие культуры в течение трех суток при относительной влажности 80% и температуре 25 градусов Цельсия. Через три дня окрашивают горку лактофенолом в синий цвет, чтобы наблюдать микроскопические особенности.
Под оптическим микроскопом наблюдайте грибковые структуры, такие как расположение, конидиофоры, форма и размер конидий в 400 раз и подтвердите идентификацию EPF. В ходе исследования 51 штамм EPF видов Metarhizium и Beaveria был выделен из 524 образцов почвы. Репрезентативный анализ показывает микроморфологические характеристики нескольких изолятов видов Metarhizium и Beaveria.
Встречаемость EPF в 24 образцах почвы была изучена с использованием трех различных методов изоляции. Приманка Galleria mellonella оказалась более эффективной в изоляции, за ней следуют приманка Tenebrio molitor и среда CTC. Те же 24 образца почвы не показали восстановления видов Beaveria, а только Metarhizium.
Наиболее важными вещами, которые следует помнить, являются перенос воздушных конидий на скользящее покрытие, наблюдение за особенностями микроскопа и подтверждение идентификации энтомопатогенных грибов с помощью морфологических ключей. Дополнительные методы включают использование других селективных искусственных сред со специфическими химическими веществами для уменьшения роста загрязняющих веществ, таких как додин. Поиск новых грибковых изолятов с выдающимися чертами биоконтроля имеет решающее значение для повышения эффективности грибов в борьбе с членистоногими и вредителями и изучения дальнейших вопросов в области патологии беспозвоночных.
