O isolamento de fungos entomopatômicos é significativo para o desenvolvimento de um biopesticida e pode ser útil para estudar a diversidade, a distribuição e a ecologia desse grupo em particular. O uso de iscas de insetos para isolar fungos entomopatômicos é considerado um método de baixo custo e altamente eficiente. clorofenicol, thiabendazole, cicloheximida, mídia artificial não usa dodine e requer menos espaço no processo de amostra do solo.
As etapas críticas incluem investigar placas de CTC após uma e duas semanas para evitar que outros fungos se estreitam e fungos entomopatômicos em desenvolvimento e, em seguida, identifiquem colônias de fungos entomopatômicos com base em sua macrofófologia e micro morfologia. Comece coletando 800 gramas de solo a uma profundidade de 10 centímetros usando uma pequena pá. Armazene as amostras em sacos de polipropileno à temperatura ambiente até o início do experimento.
Pequenas raízes também podem ser coletadas, uma vez que fungos entomopatômicos são conhecidos por terem competência de rizosfera. Para o isolamento de fungos que utilizam clorofenicol, thiabendazol, cicloheximida ou meio artificial seletivo CTC, pesam 0,35 gramas da amostra do solo com ou sem raízes. Coloque esta amostra em um microtubo de 1,5 mililitro.
Enquanto trabalha em um armário de biossegurança, adicione um mililitro de 0,01 volume por cento de polioxyetileno sorbitan monoolenato aquose suspensão aquosa ao microtubo contendo solo e vórtice do tubo por 30 segundos. Quando feito remova e pipeta 50 microliters do supernatante no centro das placas de Petri com meio CTC. Em seguida, use uma espátula drigalski estéril de um diâmetro de seis milímetros para dispersar homogêneamente as suspensões na superfície do meio.
Incubar as placas em câmaras climáticas a 25 graus Celsius e um mínimo de 80% de umidade relativa no escuro. Após sete, 14 e 21 dias de incubação, observe as placas para o crescimento das colônias fúngicas. Para isolar os fungos usando superfície desinfetada Galleria mellonella e Tenebrio molitor larvas de estágio tardio como iscas de insetos.
Mergulhe a larva em hipoclorito de sódio de 0,5% por um minuto para esterilização. Em seguida, lave as larvas duas vezes com água estéril. Monte as iscas em potes plásticos com 10 pequenos orifícios de 10 milímetros de diâmetro na tampa contendo 250 gramas do solo coletado.
Homogeneize o solo a cada dois dias para permitir o máximo contato das larvas com o solo e analisar os vasos diariamente, buscando insetos mortos. Depois de remover insetos mortos da panela, esterilize superficialmente insetos com hipoclorito de sódio de 0,5% por um minuto. Para favorecer a micose, coloque os insetos estéreis em uma câmara úmida a 80% de umidade relativa e 25 graus Celsius por sete dias.
Na micose, retire a conidia da superfície do inseto e com a ajuda do laço microbiológico, coloque a conidia no meio de ágar de dextrose de batata contendo 0,05% clorofenicol ou meio PDAC sob um microscópio estereoscópico. Como alternativa, coloque toda a larva infectada no meio PDAC. E incubar as placas de cultura em uma câmara climática, como explicado anteriormente.
Após 14 dias de incubação, identifique as espécies de EPF analisando as características macrofóicas das culturas fúngicas nas placas descritas no manuscrito. Em seguida, transfira a conidia aérea para deslizar culturas por três dias a 80% de umidade relativa e 25 graus Celsius. Após três dias, colori o slide com azul lactofenol para observar as características microscópicas.
Sob um microscópio óptico, observe as estruturas fúngicas como arranjo, conidioforos, forma e tamanho de conidia em 400 vezes e confirme a identificação do EPF. No estudo, 51 cepas de EPF das espécies Metarhizium e Beaveria foram isoladas de 524 amostras de solo. A análise representativa mostra as características micromorfológicas de alguns isolados das espécies de Metarhizium e Beaveria.
A ocorrência de EPF nas 24 amostras de solo foi estudada utilizando-se três diferentes métodos de isolamento. A isca galleria mellonella mostrou-se mais eficiente no isolamento, seguida pela isca molitor de Tenebrio e meio CTC. As mesmas 24 amostras de solo não mostraram recuperação das espécies de Beaveria, mas apenas Metarhizium.
As coisas mais importantes a se lembrar são transferir a conidia aérea para deslizar a camada observando as características do microscópio e confirmando a identificação de fungos entomopatômicos usando teclas morfológicas. Métodos adicionais incluem o uso de outras mídias artificiais seletivas com produtos químicos específicos para reduzir o crescimento de contaminantes como dodine. Buscar novos isolados fúngicos com excelentes traços de biocontrole é crucial para aumentar a eficácia dos fungos no controle artrópode-praga e explorar mais questões no campo da patologia invertebrada.
