Bu protokol, insan kalsiyum bağlayıcı protein, S100A12 için tam bir arıtma prosedürü açıklar, ve özellikle, downstream araştırma etkileri için farklı iyon kaynaklı oligomerler için. Bu teknikle, çok saf ve endotoksiniçermeyen proteinin yüksek verimini koruyabiliyoruz. Boyut dışlama kromatografisi sütununda kimyasal çapraz bağlanma ve ayırma, daha işlevsel tahliller için homo-oligomerik proteinler üretmek için ikna edici bir yöntemdir.
Tekniğimiz, ideal olarak yeni hedefli müdahaleler geliştirmek ve tanısal tahlilleri geliştirmek için desen tanıma reseptör ligand ve sanat bilgileri olarak S100A12'nin mekanistik yönlerine gitmemizi sağlar. Bu videoyu izlemenin yanı sıra, karmaşık, çok aşamalı bir yordamı tanımladığımız gibi protokolün dikkatli bir şekilde okunmasını öneririz. Başlamak için, uygun bir uzunlukta, yaklaşık 30 santimetre, hava için ek alan ile bir diyaliz boru kesti.
Gliserol kaldırmak için 15 ila 30 dakika deiyonize suda membran ıslatın. Temizlenmiş protein çözeltisinin viskozitesini azaltmak için çözeltiyi 25 mililitre AIEX tamponu a.ekle ile seyreltin. Numuneyi membrana yükleyin ve ikinci kapatmayı borunun üst ucundan en az bir santimetre takın.
Dört santigrat derece de soğutulmuş bir odada, bir karıştırma plakası üzerine AIEX tampon A ile konteyner yerleştirin, bir karıştırma çubuğu ekleyin, ve protein çözeltisi ile dolu membran. Döndürme çubuğuna müdahale olmayacak şekilde numuneyi döndürmek için hızı ayarlayın. Diyaliz 12 ila 24 saat boyunca dört santigrat derece sonra ücretsiz önceden soğutulmuş arabellek A ile diyaliz tampon değiştirin ve en az dört ek saat devam edin.
Diyaliz protein çözeltisini borudan 0,45 mikron filtre ünitesinden 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. FPLC'yi genel bakımla başlatın. AIEX A ve AIEX B kolon arabelleklerini tampon vanalarına ve kolon içeren aniyon değişim reçinesini FPLC'nin kolon bağlantı noktalarına bağlayın.
Genel kromatografik parametreleri buna göre ayarlayın. FPLC yazılımında AIEX programını başlatın ve tampon A.Subsequenta için denge hacmini seçin, örneği sütuna yükleyin ve proteinleri %0 ile %100 arasında yüksek tuz tamponu ile eritin. Elution sırasında iki mililitre kesirler toplamak.
Çalıştırmayı bitirdikten sonra eluted kesirleri analiz edin. Bunun için, coomassie lekeli 15% SDS sayfasına her fraksiyonun 10 mikrolitre yük ve S100A12 içeren kesirleri belirlemek. Tris-tamponlu tuzlu içine diyaliz için fraksiyonları içeren bu S100A12 havuzu.
Protein arınmasını devam ettirebilmek için, protein diyalizinden sonra, numuneye 25 milimolar'lık son konsantrasyona kalsiyum klorür ekleyin, bu da s100A12'nin bir sonraki adımda resenin bağlanmasını kolaylaştıracaktır. Ardından, numuneyi 0,45 mikron lik bir dökme boyutuna sahip bir filtreden geçirin. HIC tamponlarını ve örneklerini dört santigrat dereceye kadar dengeleyin.
Ardından, hic A ve B sütununa ve sütunu sisteme bağlayın ve parametreleri ayarlayın. Kolonu bir ila iki sütun luk tampon HIC A ile dengelemek ve numuneyi yüklemek ve uv sinyali ile yıkama sınırtanımaz numune bloğunu tekrar taban çizgisi seviyesine getirmek için yöntemi başlatın. Sonra tampon EDTA içeren bir kalsiyum şelatör ile elütion başlar.
Elüsyon sırasında pik kesirler iki mililitre toplayın. Bir Coomassie lekeli 15% SDS sayfasında her fraksiyonun 10 mikrolitre analiz ettikten sonra saf S100A12 fraksiyonları tanımlar. Bu kesirleri birleştirin ve HBS'ye karşı diyalize gir.
İlk olarak, 50 kilodalton santrifüj filtre ünitesiüzerine 15 mililitre numune yükleyin. Yaklaşık 10 dakika boyunca 10 santigrat derecede 3200 kez g santrifüj. Filtratlı akışı buz üzerinde yeni bir gemiye aktarın.
Şimdi, filtre zarını durulamak ve filtre ucundaki konsantre çözeltinin seyreltilmesi için bir mililitre HBS kullanın. Santrifüj tekrar akış yoluyla mümkün olduğunca çok protein kurtarmak için. Çözeltiyi filtrelemek için, numune yüklemesini ve santrifüjunu gerektiği sıklıkta tekrarlayın.
Daha sonra, akış içeren S100A12 konsantre, yaklaşık 30 dakika boyunca 3200 kez g, 10 derece santigrat üç kilodalton santrifüj filtre ve santrifüj içine yükleyin. Şimdi hacim, ilk yükleme hacminin 1/5'ine kadar 1/10'a düşürülür. Konsantre çözeltiyi yeni bir tüpe aktarın.
Konsantrasyon adımını gerektiği sıklıkta tekrarlayın. Kimyasal çapraz bağlama dan sonra, el yazmasına göre, boyut dışlama kromatografisi gerçekleştirin. HBS'deki sütunu dengeleyin, örneği yükleyin ve çalışma sırasında bir ila iki mililitrelik en yüksek kesirleri toplayın.
Bu kesirleri %4-20 degradeli SDS sayfasında analiz ettikten sonra, istenilen protein kompleksinin ana bantları ile havuz fraksiyonları. Daha sonra daha önce yapılan çözümleri konsantre. Monositleri insan buffy coats'dan yoğunluk gradyan santrifüjü ile izole etmek için, önce ayırma çözeltisini oda sıcaklığına dengeleyin.
15 mililitre lik centrifuge tüpler, buffy ceket başına iki tüp içine 20 mililitre aktarın. HBSS ile insan buffy ceket kan seyreltmek 60 mililitre toplam hacmi ve katman 30 bu karışımın mililitre ayırma ortamının üstüne dikkatlice. Oda sıcaklığında 35 dakika 550 kez g santrifüj.
Santrifüjün frenini kapatın. Santrifüjden sonra mononükleer periferik kan hücreleri ayırma ortamının hemen üstünde yer alır. Bir pipet ile, taze, 50 mililitrelik santrifüj tüp içine bu hücreleri aktarın.
Tüpü HBSS ile 50 mililitreye ve santrifüjile 10 dakika boyunca 170 kez g olarak doldurun. Supernatant aspirate ve borulama ile HBSS küçük bir hacimde hücre pelet resuspend. Daha sonra tüpü 50 mililitreye kadar doldurun ve 290 kez g'de 10 dakika santrifüj edin.
Supernatant'ı tekrar aspire edin. 10 dakika boyunca 170 kez g HBSS ve santrifüj 50 mililitre hücreleri yeniden askıya. Süpernatant aspire ve ayırma tampon bir mililitre küçük bir hacimde hücre pelet resuspend, hücreleri saymak ve mililitre başına yedi hücreye beş kez 10 konsantrasyoniçin tampon ekleyin.
Mononükleer periferik kan hücrelerinden monosit izolasyonu için manyetik negatif hücre izolasyon kiti kullanın ve üreticinin protokolüne uyun. Monositleri saymak ve mililitre başına altı hücreye iki kez 10 konsantrasyonmonosit ortamda resuspend için otomatik bir hücre sayacı kullanın. Kültür monositler için, süspansiyon hücreleri için uygun bir hidrofobik gaz geçirilebilir film ile bir hücre kültürü çanak ortaya koymak.
Sterilizasyon için plakaları UV ışığı altında yaklaşık 30 dakika yerleştirin. Hücre süspansiyonunun 15 ila 25 mililitresini bu kültür plakalarına aktarın ve bir gece boyunca 37 santigrat derece ve %5 karbondioksit le dinlenmelerine izin verin. AIEX kolonve sonraki kalsiyuma bağımlı HIC'de ön arıtma sonrasında yüksek saf protein elde edildi.
Ek bir kontrol olarak, insan monositler LPS ile uyarılmış ve yabani tip protein üretti. Farklı iyonlara protein maruziyeti farklı S100A12 oligomerlerinin düzenlenmesiyle sonuçlanır. Artan çinko konsantrasyonları, %4-20 Coomassie lekeli SDS sayfasında ayrılması üzerine Tetramer ve hexamer'lara S100A12'nin düzenlenmesine neden olur.
Çapraz bağlanmadan önce fazla iyon lar uygulandığında, oligomer dengesinin belirgin bir değişimine neden oldu. S100A12, 25 milimoler kalsiyum veya 25 milimoler kalsiyum ve bir milimolar çinko varlığında çapraz bağlıydı. HBS tamponunda 25 milimolar kalsiyum klorür ve bir milimolar çinko klorür ile çapraz bağlantı yapıldıktan sonra hexamer ve tetramer ayrıldı.
Tetramer ve dimer HBS tamponunda 25 milimoler kalsiyum klorür ile ayrıldı. Coomassie lekeli bir Coomassie% dört ila 15 gradyan SDS sayfasında ayrıldıktan sonra havuzlu ve konsantre oligomerbir örnek dimer, tetramer ve hexamer gösterir. Hexameric S100A12 ile monosit stimülasyonu tnf alfa salınımı ile sonuçlandı.
Endotoksin çıkarıldıktan sonra, sonraki nesil ve oligomerlerin saflaştırılması sırasında numunelere kontaminasyonu yeniden sokmamak önemlidir. S100A12 oligomerizasyonu ile ilgili herhangi bir sürecin downstream analizi düşünülebilir. Benzer şekilde, oliomerizasyon işlemini etkileyen amino asitler ve iyon koşulları analiz edilebilir.
Şu anda, proteinin TLF4 üzerinden sinyalini engellemek ve tanısal tahlilleri geliştirmek ve geliştirmek için spesifik peptit ligandları ve antikorlar geliştirmek için tanımlanan protokole göre ayrılmış S100A12 oligomerleri kullanıyoruz.
