يصف هذا البروتوكول إجراء تنقية كامل لبروتين ربط الكالسيوم البشري ، S100A12 ، وعلى وجه الخصوص ، لأنه مختلف القلايغومات الناجمة عن الأيونات للآثار البحثية في المصب. مع هذه التقنية، ونحن قادرون على الحفاظ على غلة عالية من البروتين النقي جدا وineotoxin خالية. الكيميائية عبر ربط وفصل على حجم استبعاد العمود الكروماتوغرافيا هو وسيلة مقنعة لتوليد البروتينات المثلية oligomeric لمزيد من المقايسات الوظيفية.
يسمح لنا أسلوبنا بالجوانب الميكانيكية لـ S100A12 كـ رابطة مستقبلات التعرف على النمط والمعلومات الفنية لتطوير تدخلات مستهدفة جديدة وتحسين الفحوصات التشخيصية. بالإضافة إلى مشاهدة هذا الفيديو، نوصي بقراءة دقيقة للبروتوكول، كما وصفنا إجراءً معقدًا متعدد الخطوات. للبدء، قطع أنابيب غسيل الكلى إلى طول مناسب، حوالي 30 سم، مع مساحة إضافية للهواء.
نقع الغشاء في المياه ديونسيد لمدة 15 إلى 30 دقيقة لإزالة الجلسرين. للحد من اللزوجة من محلول البروتين تطهيرها، وتمييع الحل مع 25 ملليلتر من AIEX العازلة A.إرفاق الإغلاق الأول على الأنابيب. قم بتحميل العينة في الغشاء وإرفاق الإغلاق الثاني بسنتيمتر واحد على الأقل من الطرف العلوي من الأنبوب.
في غرفة مبردة عند أربع درجات مئوية، ضع الحاوية مع عازل AIEX A على لوحة تحريك، وأضف شريط التحريك، والغشاء المليء بمحلول البروتين. ضبط السرعة لتدوير العينة بحيث لا يكون هناك أي تدخل مع شريط اثارة الدورية. Dialyze لمدة 12 إلى 24 ساعة في أربع درجات مئوية ثم استبدال المخزن المؤقت dialyzed مع عازلة قبل التبريد مجانا و تستمر لمدة أربع ساعات إضافية على الأقل.
نقل محلول البروتين dialyzed من الأنابيب إلى أنبوب 50 ملليلتر من خلال وحدة مرشح 0.45 ميكرون. بدء تشغيل FPLC مع الصيانة العامة. ربط مخازن العمود AIEX A و AIEX B إلى صمامات المخزن المؤقت وراتنج تبادل anion يحتوي على عمود إلى منافذ العمود من FPLC.
ضبط المعلمات الكروماتوغرافية العامة وفقا لذلك. بدء تشغيل برنامج AIEX في برنامج FPLC واختيار وحدة التخزين توازن للمخزن A.لاحقاً، تحميل العينة على العمود وeute البروتينات مع تدرج خطي من 0٪ إلى 100٪ عالى العازلة الملح. جمع اثنين من الكسور ملليلتر أثناء elution.
تحليل الكسور مائل بعد الانتهاء من تشغيل. لهذا، تحميل 10 ميكرولترات من كل كسر على Coomassie ملطخة 15٪ SDS الصفحة وتحديد الكسور التي تحتوي على S100A12. تجمع هذه S100A12 تحتوي على كسور لغسيل الكلى في المالحة TRIS المخزن.
لمواصلة تنقية البروتين، بعد غسيل الكلى البروتين، إضافة كلوريد الكالسيوم إلى العينة إلى تركيز النهائي من 25 ملليمتر، والتي سوف تسهل ربط S100A12 إلى الراتنج في الخطوة التالية. ثم، تصفية العينة من خلال مرشح مع حجم صب من 0.45 ميكرون. اكويريبرات HIC مخازن وعينات إلى أربع درجات مئوية.
بعد ذلك، قم بتوصيل مخازن العمود HIC A و B والعمود بالنظام وضبط المعلمات. ابدأ الأسلوب لتكبيل العمود بأحجام أعمدة إلى عمودين من المخزن المؤقت HIC A وتحميل العينة وكتلة عينة الغسيل غير المنضمة مع إشارة الأشعة فوق البنفسجية تصل إلى مستوى خط الأساس مرة أخرى. ثم ابدأ الاستلليس مع chelator الكالسيوم التي تحتوي على EDTA العازلة.
جمع مليلترين من الكسور الذروة خلال elution. بعد تحليل 10 ميكروليتر من كل كسر على Coomassie ملطخة 15٪ SDS صفحة تحديد كسور S100A12 نقية. تجمع هذه الكسور و dialyze ضد HBS.
أولاً، قم بتحميل 15 ملليلتر من العينة على وحدة تصفية طردية 50 كيلودالون. أجهزة الطرد المركزي في 3200 مرة ز في 10 درجة مئوية لمدة 10 دقائق تقريبا. نقل تدفق الترشيح من خلال إلى وعاء جديد، على الجليد.
الآن، استخدام ملليلتر واحد من HBS لشطف غشاء التصفية ولتخفيف من الحل المركز في طرف التصفية. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى لاسترداد أكبر قدر ممكن من البروتين في تدفق من خلال. لتصفية الحل، كرر نموذج التحميل والطرد المركزي كلما لزم الأمر.
بعد ذلك، لتركيز S100A12 التي تحتوي على تدفق من خلال، وتحميله في مرشح الطرد المركزي ثلاثة كيلودالون والطرد المركزي في 3200 مرات ز، 10 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة تقريبا. الآن يتم تقليل حجم إلى 1/5 حتى 1/10 من حجم التحميل الأولي. نقل الحل المركز إلى أنبوب جديد.
كرر خطوة التركيز كلما لزم الأمر. بعد الربط الكيميائي، وفقا للمخطوطة، قم بإجراء تصوير اللوني استبعاد الحجم. قم بتكدير العمود في HBS، ثم قم بتحميل العينة، ثم قم بتجميع كسور الذروة من ملليلتر واحد إلى ملليلتر أثناء التشغيل.
بعد تحليل هذه الكسور على صفحة SDS متدرجة من أربعة إلى 20٪، تجمع الكسور مع عصابات رئيسية من مجمع البروتين المطلوب. ثم ركز الحلول كما فعلت سابقا. لعزل monocytes من المعاطف بافي الإنسان من قبل كثافة القذف الانحدار، أولاً توازن حل الفصل لدرجة حرارة الغرفة.
نقل 20 ملليلتر في أنابيب أجهزة الطرد المركزي 15 ملليلتر، اثنين من الأنابيب لكل معطف برتقالي. تخفيف الدم من معطف بافي الإنسان مع HBSS إلى حجم إجمالي 60 ملليلتر وطبقة 30 ملليلتر من هذا الخليط بعناية على رأس وسيط الفصل. أجهزة الطرد المركزي عند 550 مرة ز لمدة 35 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
أطفئ مكبح جهاز الطرد المركزي. بعد الطرد المركزي، تقع خلايا الدم الطرفية أحادية النوى مباشرة فوق وسط الفصل. مع ماصة، ونقل هذه الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي 50 ملليلتر الطازجة.
املأ الأنبوب بـ HBSS إلى 50 ملليلتر وطاردة مركزية بمعدل 170 ضعف غرام لمدة 10 دقائق. التعرق وssuspend بيليه الخلية في حجم صغير من HBSS عن طريق الأنابيب. ثم، تعبئة أنبوب يصل إلى 50 ملليلتر والطرد المركزي في 290 مرات ز لمدة 10 دقائق.
استلهموا المُتفوّه مجدداً إعادة تعليق الخلايا في 50 ملليلتر من HBSS والطرد المركزي في 170 مرة ز لمدة 10 دقائق. اضمب اطالة و resuspend بيليه الخلية في حجم صغير من ملليلتر واحد من العازلة الفصل، عد الخلايا، وإضافة العازلة إلى تركيز من خمسة أضعاف 10 إلى الخلايا السبع لكل ملليلتر.
بالنسبة لعزلة أحادية الخلايا من خلايا الدم الطرفية أحادية النواة، استخدم مجموعة عزل الخلايا السالبة المغناطيسية واتبع بروتوكول الشركة المصنعة. استخدام عداد خلية مؤتمتة لحساب أحادية و resuspend في متوسطة أحادية التركيز من مرتين 10 إلى الخلايا الست لكل ملليلتر. لثقافة أحادية، وضع طبق ثقافة الخلية مع فيلم الغاز نفاذية المياه مناسبة للخلايا المعلقة.
ضع اللوحات تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة تقريباً للتعقيم. نقل 15 إلى 25 ملليلتر من تعليق الخلية إلى هذه اللوحات الثقافة والسماح لهم الراحة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية وثاني أكسيد الكربون 5٪. بعد ما قبل تنقية على عمود AIEX والكالسيوم المعتمد على الكالسيوم اللاحق، تم الحصول على بروتين نقي للغاية.
كتحكم إضافي، تم تحفيز أحاديات الإنسان مع LPS وأنتجت بروتين من النوع البري. ينتج عن التعرض للبروتين للأيونات المختلفة ترتيب أُزهِم S100A12 oligomers المختلفة. زيادة تركيزات الزنك تحفز ترتيب S100A12 في رباعيات و hexamers عند الفصل على أربعة إلى 20٪ Coomassie صفحة SDS الملون.
وعندما يُطبَّق فائض من الأيونات قبل الربط المتبادل، فإن ذلك يحدث تحولاً واضحاً في توازن القلة. S100A12 كانت مرتبطة عبر في وجود إما 25 ملليمولار الكالسيوم أو 25 ملليمولار الكالسيوم والزنك ميليمولار واحد. بعد الربط المتبادل في العازلة HBS مع كلوريد الكالسيوم 25 ملليمولر وكلوريد الزنك ميليمولار واحد، تم فصل الهيكسمر ورباعيمر.
تم فصل رباعية التمرس واليمدر في عازلة HBS مع كلوريد الكالسيوم 25 ملليمولر. مثال على oligomers المجمعة والمركزة بعد الانفصال على Coomassie الملون من أربعة إلى 15 ٪ صفحة SDS التدرج يظهر أكثر خافت ، tetramer ، والهيكسمر. أدى التحفيز أحادية مع سداسية S100A12 في وضوحا TNF ألفا الافراج.
بعد إزالة السمية endotoxin، من المهم عدم إعادة إدخال التلوث في العينات أثناء توليد وتنقية القلة اللاحقة. يمكن تصور تحليل المراحل النهائية لأي عملية تتعلق بـ S100A12 oligomerization. وبالمثل، يمكن تحليل الأحماض الأمينية والظروف الأيونية التي تؤثر على عملية oligomerization نفسها.
نحن حاليا باستخدام oligomers S100A12 فصل وفقا للبروتوكول الموصوف لتطوير يغاندات الببتيد محددة والأجسام المضادة لمنع إشارات البروتين من خلال TLF4 وتطوير وتحسين التشخيص المقايسة.
