Этот протокол описывает полную процедуру очистки кальция человека связывания белка, S100A12, и, в частности, для его различных ионных индуцированных олигомеров для вниз по течению исследований последствия. С помощью этой техники мы можем поддерживать высокий урожай очень чистого и без эндотоксина белка. Химическое перекрестное соединение и разделение на столбце хроматографии исключения размера является убедительным методом для генерации гомо-олигомерных белков для дальнейших функциональных анализов.
Наша техника позволяет нам механистические аспекты S100A12 в качестве рецептора распознавания образов лиганда и арт-информации для идеальной разработки новых целенаправленных мероприятий и улучшения диагностических анализов. В дополнение к просмотру этого видео, мы рекомендуем внимательно прочитать протокол, как мы описываем сложную, многоступенчатую процедуру. Для начала разрежьте диализную трубку на соответствующую длину, около 30 сантиметров, с дополнительным пространством для воздуха.
Замочите мембрану в деионизированной воде в течение 15-30 минут, чтобы удалить глицерол. Чтобы уменьшить вязкость очищенного белкового раствора, разбавьте раствор 25 миллилитров буфера AIEX A.Attach первого замыкания на трубу. Загрузите образец в мембрану и прикрепите второе замыкание по крайней мере на один сантиметр от верхнего конца трубки.
В охлажденной комнате при четырех градусах по Цельсию поместите контейнер с буфером AIEX A на тарелку для перемешивания, добавьте батончик и мембрану, наполненную белковым раствором. Отрегулируйте скорость, чтобы повернуть образец так, чтобы не было помех с вращающейся баром перемешивания. Диализ в течение 12-24 часов при четырех градусах Цельсия затем заменить диализированного буфера со свободным предварительно охлажденным буфером А и продолжать, по крайней мере четыре дополнительных часов.
Перенесите диализный белковый раствор из трубки в 50-миллилитровую трубку через блок фильтра 0,45 микрона. Начните FPLC с общего обслуживания. Подключите буферы столбца AIEX A и AIEX B к буферным клапанам и смоле обмена аниона, содержащей столбец, к портам столбца FPLC.
Соответствующим образом отрегулируйте общие хроматографические параметры. Запустите программу AIEX в программном обеспечении FPLC и выберите объем эквилибрации для буфера A.Subsequently, загрузите образец на столбец и уберите белки с линейным градиентом от 0%до 100%-ного буфера соли. Соберите две миллилитровые фракции во время элюции.
Проанализируйте элевируемые фракции после окончания пробега. Для этого загрузите 10 микролитров каждой фракции на окрашенных 15%SDS странице Coomassie и определите фракции, содержащие S100A12. Бассейн эти S100A12, содержащие фракции для диализа в TRIS-буферный солевой раствор.
Чтобы продолжить очищение белка, после белкового диализа добавьте хлорид кальция в образец к окончательной концентрации 25 миллимоля, что облегчит связывание S100A12 с смолой на следующем этапе. Затем отфильтруйте образец через фильтр размером с 0,45 микрона. Эквилибрировать буферы ИК ИК и образцы до четырех градусов по Цельсию.
Затем подключите буферы столбца HIC A и B и столбец к системе и отрегулируйте параметры. Запустите метод, чтобы уравночные столбец с одного до двух объемов столбца буфера HIC И загрузить образец и мытье несъединый блок образца с УФ-сигналом достигает базового уровня снова. Затем начните elution с хелатором кальция, содержащим буфер EDTA.
Соберите два миллилитров пиковых фракций во время элюции. После анализа 10 микролитров каждой фракции на coomassie окрашенных 15%SDS странице определить чистый S100A12 фракций. Бассейн эти фракции и диаслиза против HBS.
Во-первых, загрузите 15 миллилитров образца на 50-килодальтонный центробежный фильтр. Центрифуга при 3200 раз г при 10 градусах по Цельсию в течение примерно 10 минут. Перенесите фильтрированный поток в свежий сосуд, на лед.
Теперь используйте один миллилитр HBS для полоскания фильтровальной мембраны и для разбавления концентрированного раствора в кончике фильтра. Центрифуга снова восстановить как можно больше белка, как это возможно в потоке через. Чтобы отфильтровать раствор, повторите загрузку и центрифугирование образца так часто, как это необходимо.
Затем, чтобы сконцентрировать S100A12, содержащий поток через, загрузить его в трехкилограммовой центробежной фильтр и центрифугу в 3200 раз г, 10 градусов по Цельсию в течение примерно 30 минут. Теперь объем уменьшается до 1/5 до 1/10 от первоначального объема загрузки. Перенесите концентрированный раствор в новую трубку.
Повторите шаг концентрации так часто, как это необходимо. После химического перекрестного соединения, согласно рукописи, выполняются хроматографии исключения размера. Equilibrate столбец в HBS, загрузить образец, и собирать пиковые фракции от одного до двух миллилитров во время запуска.
После анализа этих фракций на странице SDS с градиентом от 4 до 20% можно объединить фракции с основными полосами желаемого белкового комплекса. Затем сосредоточьте решения, как это было сделано ранее. Чтобы изолировать моноциты от человеческого баффи пальто по плотности градиентной центрифугации, сначала уравночные решения разделения комнатной температуры.
Передача 20 миллилитров в 15 миллилитров центрифуг трубки, две трубки на баффи пальто. Разбавить кровь из человека баффи пальто с HBSS до общего объема 60 миллилитров и слой 30 миллилитров этой смеси тщательно поверх среды разделения. Центрифуга при температуре 550 раз г в течение 35 минут при комнатной температуре.
Выключите тормоз центрифуги. После центрифугации моноядерные периферические кровяные тельца расположены непосредственно на верхней части среды разделения. С помощью пипетки перенесите эти клетки в свежую, 50-миллилитровую центрифугу.
Заполните трубку HBSS до 50 миллилитров и центрифуги при 170 раз g в течение 10 минут. Аспирировать супернатант и повторно помыть клеточные гранулы в небольшом объеме HBSS путем пипетки. Затем заполните трубку до 50 миллилитров и центрифуг при 290 раз г в течение 10 минут.
Аспирировать супернатант снова. Переусердствов клетки в 50 миллилитров HBSS и центрифуги в 170 раз g в течение 10 минут. Аспирировать супернатант и повторно использовать клеточные гранулы в небольшом объеме одного миллилитра буфера разделения, подсчитать клетки, и добавить буфер к концентрации в пять раз 10 до семи клеток на миллилитр.
Для изоляции моноцитов от моноядерных периферических кровяных телец используйте комплект магнитной отрицательной изоляции клеток и следуйте протоколу производителя. Используйте автоматизированный счетчик клеток для подсчета моноцитов и повторного использования в моноцитов средней концентрации в два раза от 10 до шести клеток на миллилитр. Для культуры моноцитов выложить блюдо клеточной культуры с гидрофобной газоназной пленкой, пригодной для подвесных клеток.
Поместите пластины под ультрафиолетовым светом в течение примерно 30 минут для стерилизации. Перенесите от 15 до 25 миллилитров клеточной подвески на эти культурные пластины и дайте им отдохнуть на ночь при 37 градусах Цельсия и 5%углекислом газе. После предварительной очистки на колонке AIEX и последующего кальция зависит HIC, высоко чистый белок был получен.
В качестве дополнительного контроля моноциты человека стимулировались LPS и производили белок дикого типа. Воздействие белка на различные ионы приводит к расположению различных олигомеров S100A12. Увеличение концентрации цинка индуцирует расположение S100A12 в тетрамеры и шестиугольники при разделении на четыре-20%Coomassie окрашенных SDS странице.
Когда избыток ионов применялся до перекрестного соединения, это вызвало выраженный сдвиг олигомерского равновесия. S100A12 был взаимосвязан в присутствии 25 миллимолярского кальция или 25 миллимолярского кальция и одного миллимолярского цинка. После перекрестного соединения в буфере HBS с 25 миллимолярным хлоридом кальция и одним миллимолярным хлоридом цинка, гексамер и тетрамер были разделены.
Тетрамер и димер были разделены в буфере HBS с 25 миллимолярдным хлоридом кальция. Пример объединения и концентрированных олигомеров после разделения на Coomassie окрашенных от четырех до 15%gradient SDS страница показывает димер, тетрамер, и гексамер. Моноцитовая стимуляция с гексамерическим S100A12 привела к выраженному высвобождению альфа-версии TNF.
После удаления эндотоксина, важно не вводить загрязнения в образцах во время последующего поколения и очистки олигомеров. Ниже по течению анализ любого процесса, который относится к S100A12 олигомеризации можно себе представить. Аналогичным образом можно проанализировать аминокислоты и ионные условия, влияющие на сам процесс олигомеризации.
В настоящее время мы используем Олигомеры S100A12, разделенные в соответствии с описанным протоколом, для разработки специфических пептидных лигандов и антител для блокирования сигнализации белка через TLF4 и для разработки и улучшения диагностических анализов.
