该协议描述了人类钙结合蛋白S100A12的完整纯化过程，特别是对于下游研究的影响，它具有不同的离子诱导的寡聚物。通过这项技术，我们能够保持高产量的非常纯净和无内毒素的蛋白质。大小排除色谱柱上的化学交链接和分离是生成同寡聚蛋白进行进一步功能测定的令人信服的方法。
我们的技术使我们能够将S100A12作为模式识别受体配体和艺术信息机械化，以理想地开发新的针对性干预措施并改进诊断分析。除了观看此视频之外，我们建议仔细阅读协议，因为我们描述了一个复杂的多步骤过程。首先，将透析管切成适当的长度，大约30厘米，并额外的空间供空气使用。
将膜浸泡在去电化水中 15 至 30 分钟，以去除甘油。为了降低清除蛋白溶液的粘度，用25毫升AIEX缓冲液 A.将第一个闭合附到油管上稀释溶液。将样品装入膜中，将第二个封口从管的顶端连接至少一厘米。
在四摄氏度的冷却室里，将装有AIEX缓冲液的容器放在搅拌盘上，加入搅拌棒，并填充充满蛋白质溶液的膜。调整旋转样品的速度，以便旋转搅拌杆没有干扰。在 4 摄氏度下，Dialyze 持续 12 至 24 小时，然后用免费的预冷缓冲器 A 更换拨号缓冲器，并至少再持续 4 小时。
通过 0.45 微米过滤装置将透析蛋白溶液从管中转移到 50 毫升管中。使用常规维护启动 FPLC。将列缓冲器 AIEX A 和 AIEX B 连接到包含柱的阀和 Anion 交换树脂到 FPLC 的柱端口。
相应地调整一般色谱参数。在FPLC软件中启动AIEX程序，然后选择缓冲液 A 的均衡体积。在洗脱过程中收集两毫升分数。
完成运行后分析洗小分数。为此，在 Coomassie 染色 15% SDS 页面上加载每个分数的 10 微升，并识别包含 S100A12 的分数。将这些 S100A12 中含透析分数的池到 TRIS 缓冲盐水中。
为了继续蛋白质纯化，在蛋白质透析后，在样品中加入氯化钙，最终浓度为25毫摩尔，这将有助于下一步将S100A12与树脂结合。然后，通过倾水尺寸为 0.45 微米的过滤器过滤样品。将 HIC 缓冲液和样品平衡到 4 摄氏度。
接下来，将列缓冲区 HIC A 和 B 以及列连接到系统并调整参数。开始方法，使用一到两列缓冲区 HIC A 的列进行平衡，并加载样本，并且具有 UV 信号的洗涤未绑定样本块再次达到基线级别。然后开始使用含有缓冲 EDTA 的钙溷合器进行洗脱。
在洗脱过程中收集两毫升的峰值分数。在分析 Coomassie 染色 15% SDS 页面上每个分数的 10 微升后，识别纯 S100A12 分数。将这些分数与 HBS 池起并拨号。
首先，将 15 毫升样品加载到 50 千吨离心过滤器单元上。在10摄氏度下以3200倍g离心约10分钟。将过滤过的流经转移到冰上的新鲜容器中。
现在，使用一毫升的HBS冲洗滤膜，并稀释过滤片尖中的浓缩溶液。再次离心，在流经中尽可能多地恢复蛋白质。要过滤溶液，请根据需要重复样品加载和离心。
接下来，将含有流经的S100A12浓缩，装入三千吨离心过滤器，以3200倍g、10摄氏度的离心机约30分钟。现在，音量减少到初始加载体积的 1/5 至 1/10。将浓缩溶液转移到新管中。
根据需要经常重复浓度步骤。化学交链接后，根据手稿，进行大小排除色谱。平衡 HBS 中的列，加载样品，并在运行过程中收集 1 到 2 毫升的峰值分数。
在 4 到 20% 梯度 SDS 页上分析这些分数后，将分数与所需蛋白质复合物的主要波段进行池化。然后像以前一样集中解决方案。通过密度梯度离心将单核细胞与人毛涂层分离，首先将分离溶液与室温平衡。
将 20 毫升转移到 15 毫升离心管中，每层两根管。用HSS稀释人体布衣中的血液，在分离介质上小心地将这种混合物的体积稀释到60毫升和30毫升。在室温下以 550 倍 g 离心 35 分钟。
关闭离心机的制动器。离心后，单核外周血细胞直接位于分离介质顶部。使用移液器，将这些细胞转移到一个50毫升的新鲜离心管中。
用HSSS填充管至50毫升，以170倍g离心10分钟。通过移液，吸进上一提液，并在少量HSSS中重新暂停细胞颗粒。然后，将管充满50毫升，以290倍g离心10分钟。
再次吸上一月。将细胞在50毫升的HSS中重新暂停，以170倍g的离心机，10分钟。吸升液，将细胞颗粒重新在一毫升分离缓冲液的小体积中，计算细胞数，并将缓冲液添加到每毫升七个细胞的浓度的五倍十分之一。
对于从单核外周血细胞分离的单核细胞，请使用磁性负细胞分离试剂盒，并遵循制造商的协议。使用自动细胞计数器计算单核细胞，并在单核介质中重新暂停，浓度为每毫升六个细胞的浓度为 2 倍 10。培养单核细胞，布置一个细胞培养皿与疏水气体渗透膜适合悬浮细胞。
将板在紫外线下放置约 30 分钟进行灭菌。将15至25毫升的细胞悬浮液转移到这些培养板，让它们在37摄氏度和5%的二氧化碳下过夜。在AIEX柱上预纯后，随后获得高纯蛋白。
作为一种额外的控制，人类单核细胞受到LPS的刺激，并产生野生型蛋白质。蛋白质暴露在不同的离子中会导致不同S100A12寡聚物的排列。增加锌浓度诱导S100A12排列成三角和六角板分离在四至20%库马西染色SDS页面。
当在交链接之前应用过量的离子时，它导致寡聚体平衡的显著转移。S100A12 在存在 25 毫摩尔钙或 25 毫摩尔钙和 1 毫摩尔锌的情况下是交叉链接的。在HS缓冲液中与25毫摩尔氯化钙和1毫拉氯化锌进行交对后，将六角体和四分之一分液分离。
利四甲和二丁二甲在HS缓冲液中与25毫摩尔氯化钙分离。在 Coomassie 染色的 4 到 15% 梯度 SDS 页上分离后，池和浓缩寡聚物的一个示例显示了二聚体、四边板和六角体。六核S100A12的单细胞刺激导致明显的TNFα释放。
去除内毒素后，在随后生成和纯化寡聚物时，不要将污染重新引入样品中。可想而知，任何与S100A12寡聚化相关的过程的下游分析。同样，可以分析影响寡聚化过程本身的氨基酸和离子条件。
我们目前使用S100A12寡聚物根据所述协议分离，以开发特定的肽配体和抗体，以阻止蛋白质通过TLF4的信号，并开发和改进诊断分析。
