Monash Microimaging onların teknik destek için teşekkür ederiz. Bazı suşları NIH ofisi araştırma altyapı programları (P40 OD010440) tarafından finanse edilen Caenorhabditis genetik Merkezi tarafından temin edilmiştir. Bu eser bir Monash Üniversitesi Biyomedikal keşif Bursu, NHMRC proje desteği (GNT1105374), NHMRC üst düzey araştırma bursu (GNT1137645) ve veski yenilik bursu tarafından desteklenmiştir: Roger Pocock VIF 23.

1. hazırlık ve solucan yetiştiriciliği
Not: Tüm ürün bilgileri için Malzemeler tablo bakın.
<ol><li>OP50 Escherichia coli kültür: Lysogeny suyu (LB) (% 1'tryptone, % 0.5 Maya, %0,5 NaCl, pH 7,0) gecede 37 ° C'de Antibiyotikler olmadan OP50 bakteri kültürü.</li>
	<li>400 µL OP50 bakterilerin nematodunun büyüme medya (NGM) levhalar (1,5 gr NaCl, agar, pepton, 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL etanol, 1 mL 1 M MgSO4 5 mg/mL kolesterol 1,25 g 8.5 gram tohum ve 1 M KPO4 arabellek 25 mL) ve hava kuru bakteri 48 h için.</li>
	<li>Solucanlar numaralı seribaşı NGM plakaları almak ve 15 ° C veya 20 ° c kuluçkaya<ol>
<li>Yetişkin hermafrodit germline analizi için iyi beslenmiş L4 solucanlar bakteriyel çim için almak ve bir gecede 20 ° C'de kuluçkaya</li>
		<li>Solucanlar L4/yetişkin tüy dökme ulaşana kadar sperm sayı hünsa içinde puanlama için L4 solucanlar için 12 h 20 ° C'de kuluçkaya. Solucanlar L4 sahneye eşitlemeye, çamaşır suyu çözüm (1 M NaOH ve çamaşır suyu 1:1 oranında) yumurta bir sürü yetişkin solucanlar seçerek yumurta hazırlamak. Yumurta yumurtadan ve L4 hayvan deney için almak izin verir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Teflon mikroskop slaytlar poly-L-lizin çözüm 25 µL slaytta yerleştirerek ve çözüm de, bir pipet ucu kullanarak yayılan hazırlayın. Kağıt havlu ile Poli-L-lizin aşırı kaldırdıktan sonra kurutma ve slaytlar için 15-20 dk 65 ° C'de kuluçkaya slaytların izin.</li>
</ol>2. Germline diseksiyon ve boyama6,13
<ol><li>10 µL % 0,01 (anestezik) tetramisole 22 mm × 22 mm coverslip üzerinde bir nokta ve o içine bir - gün eski yetişkin solucanlar seçin.</li>
	<li>Bir şırınga (5 mL) ve bir iğne (24 "x 1") kullanarak sakin olur gibi kuyruk, solucan teşrih ve germline zarar görmediğinden emin olun. Not: negatif basınç solucan ve kurt hareketi yardım germline çýkartýlmasýný böylece solucan tamamen felç olur önce diseksiyon yapılmalıdır. Sperm puanlama için önlemler spermatheca zarar vermemesi için iğne tarafından diseksiyon sırasında alınması gerekir. Spermatheca sonra diseksiyon noktası dışındaki iğne ile germline dokunmaktan kaçının. Germline kompartımanda kırmak veya herhangi bir deşarj germline görülmektedir varsa germline analiz için kullanılmamalıdır.</li>
	<li>Ters coverslip disseke germline slayt üzerinde tutmak bir Poli-L-lizin kaplamalı slayt üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Coverslip altında aşırı sıvı 1 dk. hızlı bir şekilde kaldırmak için slayt üzerinde germlines ile bir iğne kullanarak coverslip bir kağıt Kulesi coverslip sonra yer slayt köşesinde sıvı azot yerleştirerek kaldırın.</li>
	<li>Slaytları-20 ° C metanol için 30-60 s bir odasında içine, daha sonra 30 dk içinde taze hazırlanmış sabitleme çözüm (1 fosfat tamponlu tuz (PBS) içeren 0,08 M HEPES pH 6,9, 1.6 mM MgSO4, 0.8 mM etilen glikol bis(beta-aminoethyl x için kuluçkaya eter)-N, N, N', N'-tetraacetic asit (EGTA) ve % 3.7 paraformaldehyde) oda sıcaklığında.</li>
	<li>1 x PBS, pH 7.4 içeren bir odaya yerleştirerek slaytları yıkama %0,1 ile ara-20 10 dakika süreyle tekrarlamak bu adım bir kez.</li>
	<li>Germlines ile 30 µL çözüm engelleme engellemek (keçi serum 1700 µL içinde keçi serum 900 µL ekleyerek hazırlanan % 30'u H2O distile ve 10 x PBS 300 µL), oda sıcaklığında 30 dk için plastik bir kutu içinde ıslak kağıt havlu koyarak hazırlanan bir nemli odasında.</li>
	<li>REC-8 antikor çözüm olarak her örnek için bir oranı %1:300 30 keçi Serumda hazırlanan 50 µL ekleyin. Gecede 4 ° C'de kuluçkaya</li>
	<li>Slaytları yıkayın 1 x PBS % 0.1 ile içeren bir odasında yerleştirerek ara-20 10 dk. için bir kez yineleyin ve aşırı sıvı slayt köşesinde bir kağıt havlu koyarak kaldırmak.</li>
	<li>İkincil antikor çözüm yeşil fluorophore (488 nm emisyon dalga boyları) konjuge ikincil antikor (1: 1000), phalloidin (aktin leke, 1:4000) ve DAPI (DNA leke, 1:4000) % 30 normal keçi serum içinde sulandrarak hazırlayın.</li>
	<li>İkincil antikor çözüm 50 µL slayda ekleyin.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Slaytları yıkama iki kez 1 x PBS % 0.1 ile içeren bir odaya yerleştirerek ara-20 10 dakika süreyle silin aşırı sıvı.</li>
	<li>Reaktif bir slayda sabitleme 30 µL ekleyin ve 12 mm2 x 1,5 µm coverslip üstüne yerleştirin ve slaytlar 4 ° C'de gecede kuru.</li>
</ol>3. confocal mikroskobu
<ol><li>Confocal mikroskop, lazerler, rezonans tarayıcı ve confocal mikroskop bilgisayar yazılımı açın. Lekeli germlines ile slaytlar slayt sahibi 63 X amaç yukarıda yerleştirin.</li>
	<li>Bir germline, odak üstünde germline bulun ve confocal mikroskop bilgisayar yazılımı kullanarak işaretler. Benzer şekilde germline dibinde odaklanmak ve toplam germline kalınlığı kurmak için işaretler.</li>
	<li>Görüntü en çok 0,5 µm. Mark tam germline ve başlangıç Alım her dilim kalınlığı tanımlayarak tüm germline. Her dilimin 8 kere tarama ve görüntü kalitesini artırmak için değerlerin ortalamasını. Rezonans tarayıcı tarama hızlı görüntüleme sırasında ağartma önlemek için izin verir. Mikroskop bir rezonans tarayıcı varsa, tarama sayısı dört ağartma önlemek için azaltmak.</li>
</ol>4. mesaj çekirdeği analiz görüntüleme numarasını ve dağıtım
Not: Ekran görüntüleri kullanılan düğmeler ve yazılım araçları için ek resim 1 bakın.
<ol><li>Görüntü Imaris 8.4.1 veya yazılımın sonraki sürümleri için alın.</li>
	<li>Mitotik bölge, geçiş bölgesi, segregasyonun bölge, oosit bölge ve germline spermatheca her bölgede nükleer Morfoloji belirleyerek tanımlayın.</li>
	<li>Belgili tanımlık bilgisayar yazılımı yüzey function butonu (ek şekil 1A) ilgi bölgeyi seçmek için kullanın.</li>
	<li>Otomatik yüzey oluşturma Sihirbazı iptal etmek ve el ile görüntünün ilk ve son dilim ilgi bölge üç boyutlu yığın çizin.</li>
	<li>Oluştur yüzey' i tıklatın. Not: Yazılım otomatik olarak ilk ve son yığını arasında yığınları gelişecektir.</li>
	<li>DAPI hariç tüm kanallar maskesi kanalı düğmesini (Ek şekil 1B-C) maske.</li>
	<li>Spot function butonu (ek şekil 1A) kullanarak nükleer boyutu parametreleri tanımlayın. Mitotik bölgesi için Z çapı tanımsız bırakarak bir XY çapı 2 µm tanımlayın. Geçiş bölgesi için bir XY çapı 2 µm ve Z çapı 1,5 µm. (ek şekil 1 d) tanımlayın. Not: büyütme ve belirtme-in mikroskop göre çapları ile ilgili sorunları giderme. Geçerli protokol için kullanılan objektif 63 X yapıldı ve fazladan 1,70 kez büyütme görüntüleme sırasında sağlanan. Amaç, örneğin 40 X, değişirse çapları buna göre değiştirilmelidir. Sorun giderme doğru parametreleri kurmak için wildtype germlines ile yapılmalıdır. Bir vahşi tipi germline kolu Mitotik bölgesi yaklaşık 250 çekirdeği vardır. Çapı bu değer elde etmek için değiştirilmesi gerekir. En az 15 germlines çapı en uygun değerini belirlemek için kullanın. Benzer bir yaklaşım geçiş bölgesi (150-170 çekirdeği) ve segregasyonun bölge (600-700 çekirdeği) kalibre için kullanılır.</li>
	<li>Noktalar tespiti minimum eşik (ek şekil 1E) tanımlayarak sınırlayın. Kullanım DAPI ilk nokta dışında germline görünene kadar en az üç boyutlu işleme eşik artırarak minimum eşiği belirlemek için vahşi türü germlines lekeli.</li>
	<li>Görüntü kaydetmek ve çekirdek sayısı otomatik olarak yazılım tarafından oluşturulan tablo elde etmek. Görüntüler TIF dosyaları olarak dışa aktarma.</li>
</ol>5. analiz Sperm ve kromozom sayısı puanlama için Imaging post
<ol><li>Faiz bölgesi olarak spermatheca seçerek üç boyutlu işleme gerçekleştirin. Her sperm tespit, spot çapı 0,75 arasında-tanımlamak için 1.0 µm x ve Y-ekseni Z çapı tanımsız kalır iken,. Noktalar function butonu ek şekil 1' de gösterildiği gibi kullanın.</li>
	<li>Yanında tıkırtı arka plan arka plan çıkarmak kutusu ve yazılım (ek şekil 1 d) tarafından hesaplanan arka plan düzeltme değerlerini kullanarak çıkarın. Not: Imaris yazılım ilk yüksek yoğunluklu puan alır, bölgenin ilgi ve arka plan arasında anlamlı bir fark var olduğu sürece bu nedenle arka plan etkisi en az düzeydedir. Arka plan düzeltme tanımlarken, burada uygun değerleri için arka plan için verilebilir bir ikinci yöntemdir. El ile arka plan düzeltme bağımsız örnekleri yoğunluğunu karşılaştırma ihtiyacı varsa uygun olacaktır.</li>
	<li>Tüm lekeli DAPI sperm spermatheca (tamamlayıcı şekil 1E) tespit etmek için üç boyutlu işleme eşik ayarlayın.</li>
	<li>Kromozom sayımı için spot çapı tanımla < x 0,75 µm ve üç boyutlu modelleri geliştirmeden önce Y-eksen.</li>
	<li>Görüntü kaydetmek ve TIF dosyası olarak verin.</li>
</ol>6. post Germline hücre iskeleti yeniden inşası için analiz görüntüleme
<ol><li>İlgi germline bölge tanımlamak ve phalloidin dışında tüm kanallar tıklayarak kanal maskesi maske.</li>
	<li>0.25 µm yüzey detayını yüzey function butonu (ek şekil 1) kullanarak tanımlayın. Not: Bu üç boyutlu modelleri içine her 0.25 µm işlenip anlamına gelir. Yüzey ayrıntı germline nerede üç boyutlu yüzey manken-ecek var olmak mahluk her 0.25 µm için herhangi bir bölge için sabit olabilir. Ancak, oosit bölgesi için yüzey ayrıntı için 0,35 - artırılabilir iyi tanımlanmış aktin iplikleri bu bölgedeki varlığı nedeniyle 0.5 µm.</li>
	<li>Yanında tıkırtı arka plan arka plan çıkarmak kutusu ve yazılım (ek şekil 1 d) tarafından hesaplanan arka plan düzeltme değerlerini kullanarak çıkarın.</li>
	<li>Üç boyutlu işleme eşik analizi (ek şekil 1E) gerektiren yapısına bağlı olarak ayarlayın.</li>
	<li>Gelişmiş üç boyutlu görüntü kaydetmek ve TIF dosyası olarak verin.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hubbard, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+germ+line:+a+model+for+stem+cell+biology.">Caenorhabditis elegans germ line: a model for stem cell biology.</a> Dev Dyn. 236 (12), 3343-3357 (2007).</li><li>Joshi, P. M., Riddle, M. R., Djabrayan, N. J., Rothman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+model+for+stem+cell+biology.">Caenorhabditis elegans as a model for stem cell biology.</a> Dev Dyn. 239 (5), 1539-1554 (2010).</li><li>Kershner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+stem+cells+and+their+regulation+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Germline stem cells and their regulation in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Adv Exp Med Biol. 786, 29-46 (2013).</li><li>Byrd, D. T., Knobel, K., Affeldt, K., Crittenden, S. L., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DTC+niche+plexus+surrounds+the+germline+stem+cell+pool+in+Caenorhabditis+elegans.">A DTC niche plexus surrounds the germline stem cell pool in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 9 (2), 88372 (2014).</li><li>Kimble, J., Crittenden, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controls+of+germline+stem+cells,+entry+into+meiosis,+and+the+sperm/oocyte+decision+in+Caenorhabditis+elegans.">Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the sperm/oocyte decision in Caenorhabditis elegans.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 405-433 (2007).</li><li>Hansen, D., Hubbard, E. J., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-pathway+control+of+the+proliferation+versus+meiotic+development+decision+in+the+Caenorhabditis+elegans+germline.">Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline.</a> Dev Biol. 268 (2), 342-357 (2004).</li><li>Crittenden, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+RNA-binding+protein+controls+germline+stem+cells+in+Caenorhabditis+elegans.">A conserved RNA-binding protein controls germline stem cells in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 417 (6889), 660-663 (2002).</li><li>Eckmann, C. R., Crittenden, S. L., Suh, N., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLD-3+and+control+of+the+mitosis/meiosis+decision+in+the+germline+of+Caenorhabditis+elegans.">GLD-3 and control of the mitosis/meiosis decision in the germline of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 168 (1), 147-160 (2004).</li><li>Schumacher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+repression+of+C.+elegans+p53+by+GLD-1+regulates+DNA+damage-induced+apoptosis.">Translational repression of C. elegans p53 by GLD-1 regulates DNA damage-induced apoptosis.</a> Cell. 120 (3), 357-368 (2005).</li><li>McMullen, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macro-level+modeling+of+the+response+of+C.+elegans+reproduction+to+chronic+heat+stress.">Macro-level modeling of the response of C. elegans reproduction to chronic heat stress.</a> PLoS Comput Biol. 8 (1), 1002338 (2012).</li><li>Hubbard, E. J., Korta, D. Z., Dalfo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+control+of+germline+development.">Physiological control of germline development.</a> Adv Exp Med Biol. 757, 101-131 (2013).</li><li>Wolke, U., Jezuit, E. A., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-dependent+cytoplasmic+streaming+in+C.+elegans+oogenesis.">Actin-dependent cytoplasmic streaming in C. elegans oogenesis.</a> Development. 134 (12), 2227-2236 (2007).</li><li>Jones, A. R., Francis, R., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLD-1,+a+cytoplasmic+protein+essential+for+oocyte+differentiation,+shows+stage-+and+sex-specific+expression+during+Caenorhabditis+elegans+germline+development.">GLD-1, a cytoplasmic protein essential for oocyte differentiation, shows stage- and sex-specific expression during Caenorhabditis elegans germline development.</a> Dev Biol. 180 (1), 165-183 (1996).</li><li>Hasegawa, E., Karashima, T., Sumiyoshi, E., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+CPB-3+interacts+with+DAZ-1+and+functions+in+multiple+steps+of+germline+development.">C. elegans CPB-3 interacts with DAZ-1 and functions in multiple steps of germline development.</a> Dev Biol. 295 (2), 689-699 (2006).</li><li>Austin, J., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=glp-1+is+required+in+the+germ+line+for+regulation+of+the+decision+between+mitosis+and+meiosis+in+C.+elegans.">glp-1 is required in the germ line for regulation of the decision between mitosis and meiosis in C. elegans.</a> Cell. 51 (4), 589-599 (1987).</li><li>Berry, L. W., Westlund, B., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ-line+tumor+formation+caused+by+activation+of+glp-1,+a+Caenorhabditis+elegans+member+of+the+Notch+family+of+receptors.">Germ-line tumor formation caused by activation of glp-1, a Caenorhabditis elegans member of the Notch family of receptors.</a> Development. 124 (4), 925-936 (1997).</li><li>Fox, P. M., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Germline+Stem+Cell+Differentiation+Following+Loss+of+GLP-1+Notch+Activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201 (1), 167-184 (2015).</li><li>Pasierbek, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Caenorhabditis+elegans+cohesion+protein+with+functions+in+meiotic+chromosome+pairing+and+disjunction.">A Caenorhabditis elegans cohesion protein with functions in meiotic chromosome pairing and disjunction.</a> Genes and Development. 15 (11), 1349-1360 (2001).</li><li>Klass, M., Wolf, N., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+male+reproductive+system+and+sexual+transformation+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Development of the male reproductive system and sexual transformation in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 52 (1), 1-18 (1976).</li><li>Korta, D. Z., Tuck, S., Hubbard, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S6K+links+cell+fate,+cell+cycle+and+nutrient+response+in+C.+elegans+germline+stem/progenitor+cells.">S6K links cell fate, cell cycle and nutrient response in C. elegans germline stem/progenitor cells.</a> Development. 139 (5), 859-870 (2012).</li><li>Laband, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+segregation+occurs+by+microtubule+pushing+in+oocytes.">Chromosome segregation occurs by microtubule pushing in oocytes.</a> Nat Commun. 8 (1), 1499 (2017).</li></ol>

Yazarlar hiçbir çatışma bildirin.

Bu iletişim kuralı doğruluğunu geliştirmek ve germline analiz için gereken süreyi azaltmak için hedeftir. Disseke germlines standart hazırlanması sonra germline çekirdeği üç boyutlu bir model Hesaplamalı işleme tarafından hazırlanmıştır. Germline çekirdeği dağıtım uzay gözlem izin verirken, üç boyutlu işleme germline belirli bölgelerinde, çekirdeği sayısını hesaplar. Önemli bir özelliği, bizim yöntemi çekirdek boyutu ve şekli parametreleri doğru tanımıdır. Bu boyama ve kullan...

Yollar memeliler ile sinyal koruma C. elegans birden çok biyolojik süreçlerin1,2eğitim için mükemmel bir model yapar. Bizim laboratuarımızda kök hücre gelişimi, Apoptozis ve gen ekspresyonu çalışmaya C. elegans germline kullanın. Germline üç boyutlu bir yapıdır, birçok çalışma iki boyutlu üç boyutlu analiz zaman alıcı ve emek yoğun doğası gereği vardır. İki boyutlu analiz germline vivo içinde olayları yanlış muhtemeldir. C. elegans yetişkin hermafrodit iki germline kolu, her biri bir farklılaşmamış devlet3,4distal germ hücreleri korur somatik distal ucu hücre (DTC) evler vardır. Bu germ hücreleri nüfuzunu, kaçan DTC'yi uzak hareket olarak ayırt etmek başlar ve germline proksimal sonuna ulaşmak yumurta ve sperm hale gelir. Bu işlem sırasında germ hücre çekirdeği mitoz, mayoz5,6için geçiş önce tabi. Sperm üretimini geçmesi sırasında yetişkinlik yumurta üretilmektedir gelişiminin larva aşamasında 4 (L4) tarafından tamamlanır. Sperm yumurta embriyo oluşturmak için nereye gübreliyorlar spermatheca içinde depolanır.
C. elegans değişiklikler çekirdek sayısı, apoptotik olaylar, kromozom dinamikleri ve protein ifade ve/veya Yerelleştirme7 sayısı sonuçlanan germline geliştirme etkileyebilir birden çok genetik ve çevresel faktörler ,8,9,10,11. Bu olayların analizi her aşamasında nükleer morfoloji ve dağıtım göre farklılaşma tanımlaması gerekir. Doğru bir şekilde bu parametreler büyük örnek boyutu ile el ile çözümlemek için emek ve zaman alıcı. Bu sakıncaları engelleyecek ve analiz tutarlılığını sağlamak için otomatik yöntemi C. elegans germline sayma çekirdekleri, çekirdek dağıtım, protein ifade, üç boyutlu incelenmesi için geliştirdiğimiz ve hücre iskeleti yapısı. Confocal mikroskobu ile üç boyutlu render birleştirerek, boyutu ve şekli parametreleri her aşamasında germ hücre farklılaşma tanımlanması için oluşturulan. Ayrıca, bu yöntem germ hücre çekirdeği ve sperm sayım artı kromozom sayısı her yumurta içinde Puanlama sağlar.
Bir çok önemli germline germline yuvası, AIDS sitoplazmik akarsu ve koruma germline çekirdeği12istikrar sağlar sitoiskeleti yapıdır. Hesaplamalı işlemesini kullanan, biz germline sitoiskeleti üç boyutlu rekonstrüksiyon uygulandı ve farklı hücre iskeleti özellikle germline içinde teşhis etti. Burada, biz nasıl sayısal analiz confocal görüntüleme sağlar kapsamlı analiz C. elegans germline ile kombine göstermek için adım adım bir protokol tanımlamak.
C. elegans germline (şekil 1) üç boyutlu analizi için hızlı bir yöntem öneriyorum. Üç boyutlu analizi kullanılarak, otomatik germline çekirdeği (Şekil 2 ve şekil 3), üç boyutlu dağılımı hücreleri (Resim 2), ( germline sitoiskeleti yeniden inşası sayma çalışma olanağı vardır Şekil 3), proteinler (şekil 4) ve spermatheca sperm ve yumurta (şekil 5) kromozom sayısı puanlama dağıtımını. Yöntem sadece germline kolay ve doğru miktar sağlar ama fizyolojik ilgili fenotipleri tanımlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:933px;" width="934">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">C. elegans strains: wild type (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III&#160;</td>
			<td style="width:264px;">Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OP50 Escherichia coli bacteria</td>
			<td style="width:264px;">Homemade</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nematode Growth Media (NGM) plates</td>
			<td style="width:264px;">Homemade</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">polyclonal rabbit anti-REC-8&#160;</td>
			<td>SDIX</td>
			<td>29470002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa 488 conjugated antibody raised in goat</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A-21236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytoskeletal dye phalloidin&#160;</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:168px;">A-12380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI&#160;</td>
			<td>Thermofisher Scientific&#160;</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-L-lysine&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetramisol&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgSO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:168px;">M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1M HEPES buffer, pH 7.4&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:168px;">G0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10X PBS pH 7.4&#160;</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">37% Paraformaldehyde solution</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1040031000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal goat serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluoroshield fixing reagent&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F6182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol&#160;</td>
			<td>Millipore&#160;</td>
			<td>1009832511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20&#176;C &#38; 25&#176;CIncubator&#160;</td>
			<td>Any brand</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Light microscope</td>
			<td style="width:264px;">Any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope&#160;&#160;</td>
			<td style="width:264px;">Any brand (Leica, Zeiss)</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Computer equipped with Imaris suit 8.4.1 or later version, full licence to use the software and Matlab software.</td>
			<td style="width:264px;">Bitplane</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Phospho buffered saline, pH 7.4</td>
			<td style="width:264px;">Homemade</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Teflon microscope slides&#160;</td>
			<td style="width:264px;">Tekdon&#160;</td>
			<td style="width:168px;">&#160;941-322-8288</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

computational analysis of the caenorhabditis elegans germline to study the distribution of nuclei, proteins, and the cytoskeleton

Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline kök hücre geliştirme, Apoptozis ve kromozom dinamikleri dahil olmak üzere çeşitli biyolojik olarak önemli işlemleri incelemek için kullanılır. Germline mükemmel bir model olsa da, genellikle iki boyutlu zaman ve emek üç boyutlu analiz için gerekli nedeniyle analizidir. Bu tür çalışmalarda önemli dökümanları numarası/konumunu çekirdeği ve protein dağıtım germline içinde vardır. Burada, otomatik sayı ve germline her bölgede çekirdeği konumunu belirlemek için confocal mikroskobu ve Hesaplamalı yaklaşımları kullanarak germline analizini gerçekleştirmek için bir yöntem mevcut. Bizim yöntem da farklı genetik geçmişleri protein ifade üç boyutlu incelenmesi sağlar germline protein dağıtım analiz eder. Ayrıca, bizim çalışma belirli kayma gelişimsel gereksinimleri karşılamak germline farklı bölgelerinde hücre iskeleti mimaride varyasyonlar gösterir. Son olarak, bizim yöntemi otomatik her germline spermatheca Sperm sayımı etkinleştirir. Birlikte ele alındığında, bizim yöntemi C. elegans germline hızlı ve tekrarlanabilir fenotipik analizini etkinleştirir.

Şekil 1 üç boyutlu germline analiz için gereken süreyi gösterir. 20 ° C'de inkübe L4 hünsa germlines yalıtmak için disseke ve DAPI, phalloidin ve germline proteinler karşı antikor lekeli. Germlines kullanarak confocal mikroskobu görüntüsü. Boyama ve confocal mikroskobu gerektirir yaklaşık 24 h sayısal analiz için tam germline sayısını ve konumunu çekirdeği saymak, protein dağıtım tanımlamak, puan ve hücre iskeleti yapısını an...

Watch this Scientific Journal Video about Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton at JoVE.com

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Çekirdeklerin dağıtım, proteinler ve sitoiskeleti çalışmaya Caenorhabditis elegans Germline sayısal analizi

Biz üç boyutlu Caenorhabditis elegans germline. inşası için otomatik yöntemi mevcut Bizim yöntem sayısını ve her çekirdek germline ve analizleri germline protein dağıtım ve hücre iskeleti yapısı içindeki konumunu belirler.

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

computational-analysis-caenorhabditis-elegans-germline-to-study

Microsoft Bing

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

6.2K Görüntüleme.  Monash University. Biz üç boyutlu Caenorhabditis elegans germline. inşası için otomatik yöntemi mevcut Bizim yöntem sayısını ve her çekirdek germline ve analizleri germline protein dağıtım ve hücre iskeleti yapısı içindeki konumunu belirler.

Video: Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the field of environmental health. This is due in part to the paucity of model systems that can (1) accurately recapitulate keys features of reproductive processes and (2) do so in a medium- to high-throughput fashion, without the need for a high number of vertebrate animals.
We describe here an assay in the nematode C. elegans that allows the rapid identification of germline toxicants by monitoring the induction of aneuploid embryos. By making use of a GFP reporter line, errors in chromosome segregation resulting from germline disruption are easily visualized and quantified by automated fluorescence microscopy. Thus the screening of a particular set of compounds for its toxicity can be performed in a 96- to 384-well plate format in a matter of days. Secondary analysis of positive hits can be performed to determine whether the chromosome abnormalities originated from meiotic disruption or from early embryonic chromosome segregation errors. Altogether, this assay represents a fast first-pass strategy for the rapid assessment of germline dysfunction following chemical exposure.

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

Nematod kullanma Germline Kimyasal zehirlilik Kapsamlı Değerlendirme<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Gelişim Biyolojisi

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

Konfokal Analizi Kullanımı<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Wnt ve Shh morfogen Gradyanların modülyatorlar Soruşturma

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple cellular and developmental processes principally via activation of ERK, the terminal kinase of the pathway. Tight regulation of ERK activity is essential for normal development and homeostasis; overly active ERK results in excessive cellular proliferation, while underactive ERK causes cell death. C. elegans is a powerful model system that has helped characterize the function and regulation of RTK-RAS-ERK signaling pathway during development. In particular, the RTK-RAS-ERK pathway is essential for C. elegans germline development, which is the focus of this method. Using antibodies specific to the active, diphosphorylated form of ERK (dpERK), the stereotypical localization pattern can be visualized within the germline. Because this pattern is both spatially and temporally controlled, the ability to reproducibly assay dpERK is useful to identify regulators of the pathway that affect dpERK signal duration and amplitude and thus germline development. Here we demonstrate how to successfully dissect, stain, and image dpERK within the C. elegans gonad. This method can be adapted for spatial localization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided an antibody compatible with immunofluorescence is available.

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

We present an immunofluorescence&#160;imaging-based method for spatial and temporal localization of active ERK in the dissected C. elegans gonad. The protocol described here can be adapted for visualization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided a suitable antibody reagent is available.

Aktif ERK Mekansal ve Zamansal Analizi<em&gt; C. elegans</em&gt; Germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein are molecular motors that regulate anterograde and retrograde transport, respectively. These motors use microtubule networks as rails. Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful model organism to study axonal transport and IFT in vivo. Here, I describe a protocol to observe axonal transport and IFT in living C. elegans. Transported cargo can be visualized by tagging cargo proteins using fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP). C. elegans is transparent and GFP-tagged cargo proteins can be expressed in specific cells under cell-specific promoters. Living worms can be fixed by microbeads on 10% agarose gel without killing or anesthetizing the worms. Under these conditions, cargo movement can be directly observed in the axons and cilia of living C. elegans without dissection. This method can be applied to the observation of any cargo molecule in any cells by modifying the target proteins and/or the cells they are expressed in. Most basic proteins such as molecular motors and adaptor proteins that are involved in axonal transport and IFT are conserved in C. elegans. Compared to other model organisms, mutants can be obtained and maintained more easily in C. elegans. Combining this method with various C. elegans mutants can clarify the molecular mechanisms of axonal transport and IFT.

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a good model to study axonal and intracellular transport. Here, I describe a protocol for in vivo recording and analysis of axonal and intraflagellar transport in C. elegans.

Caenorhabditis elegans nöron hücre içi taşıma analiz immobilizasyon

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain and protect cellular identities. The conversion of germ cells into specific neurons in the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful tool for performing genetic screens in order to dissect regulatory pathways that safeguard established cell identities. Reprogramming of germ cells to a specific type of neurons termed ASE requires transgenic animals that allow broad over-expression of the Zn-finger transcription factor (TF) CHE-1. Endogenous CHE-1 is expressed exclusively in two head neurons and is required to specify the glutamatergic ASE neurons fate, which can easily be visualized by the gcy-5prom::gfp reporter. A trans gene containing the heat-shock promoter-driven che-1 gene expression construct allows broad mis-expression of CHE-1 in the entire animal upon heat-shock treatment. The combination of RNAi against the chromatin-regulating factor LIN-53 and heat-shock-induced che-1 over-expression leads to reprogramming of germ cell into ASE neuron-like cells. We describe here the specific RNAi procedure and appropriate conditions for heat-shock treatment of transgenic animals in order to successfully induce germ cell to neuron conversion.

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

This protocol describes how to study cellular processes during cell fate conversion in Caenorhabditis elegans in vivo. Using transgenic animals, allowing heat-shock promoter-driven overexpression of the neuron fate-inducing transcription factor CHE-1 and RNAi-mediated depletion of the chromatin-regulating factor LIN-53 germ cell to neuron reprogramming can be observed in vivo.

Uygulama için yeniden programlamak Germ hücreleri için C. elegans nöronlarda RNAi ve transkripsiyon faktörü ifade ısı şok bağlı

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that makes up much of the parenchyma of the human placenta. The distal villous capillary network is the terminus of the fetal blood supply after several generations of branching of vessels extending out from the umbilical cord. This network has a contiguous cellular sheath, the syncytial trophoblast barrier layer, which prevents mixing of fetal blood and the maternal blood in which it is continuously bathed. Insults to the integrity of the placental capillary network, occurring in disorders such as maternal diabetes, hypertension and obesity, have consequences that present serious health risks for the fetus, infant, and adult. To better define the structural effects of these insults, a protocol was developed for this study that captures capillary network structure on the order of 1 - 2 mm3 wherein one can investigate its topological features in its full complexity. To accomplish this, clusters of terminal villi from placenta are dissected, and the trophoblast layer and the capillary endothelia are immunolabeled. These samples are then clarified with a new tissue clearing process which makes it possible to acquire confocal image stacks to z- depths of ~1 mm. The three-dimensional renderings of these stacks are then processed and analyzed to generate basic capillary network measures such as volume, number of capillary branches, and capillary branch end points, as validation of the suitability of this approach for capillary network characterization.

This study presents a protocol for the reversible tissue clearing, immunostaining, 3D-rendering and analysis of vascular networks in human placenta villi samples on the order of 1 - 2 mm3.

Üç boyutlu görüntü oluşturma ve çözümleme-in Immunolabeled, açıklık insan plasental Villous damar ağları

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are facilitated by the transparency of the animal, the ability to do forward and reverse genetic assays, the relative ease of generating fluorescently labeled proteins, and the use of fluorescent dyes that can either be microinjected into the early embryo or incorporated into its food (E. coli strain OP50) to label cellular organelles (e.g. 9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1&#39;H-2,2&#39;-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Here, we present the use of a fluorescent pH-sensitive dye that stains intestinal lysosomes, providing a visual readout of dynamic, physiological changes in lysosomal acidity in live worms. This protocol does not measure lysosomal pH, but rather aims to establish a reliable method of assessing physiological relevant variations in lysosomal acidity. cDCFDA is a cell-permeant compound that is converted to the fluorescent fluorophore 5-(and-6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein (cDCF) upon hydrolysis by intracellular esterases. Protonation inside lysosomes traps cDCF in these organelles, where it accumulates. Due to its low pKa of 4.8, this dye has been used as a pH sensor in yeast. Here we describe the use of cDCFDA as a food supplement to assess the acidity of intestinal lysosomes in C. elegans. This technique allows for the detection of alkalinizing lysosomes in live animals, and has a broad range of experimental applications including studies on aging, autophagy, and lysosomal biogenesis.

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

A step-by-step guide to probe loss of lysosomal acidity in the intestine of C. elegans using the pH-sensitive vital dye 5(6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein diacetate (cDCFDA)

Bağırsak hayatın Caenorhabditis elegans lizozomal Alkalinization değerlendirilmesi

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases of the cell cycle, or the incorporation of nucleoside analogs. During S-phase, DNA polymerases incorporate thymidine analogs such as EdU or BrdU into chromosomal DNA, marking the cells for analysis. For C. elegans, the nucleoside analog EdU is fed to the worms during regular culture and is compatible with immunofluorescent techniques. The germline of C. elegans is a powerful model system for the studies of signaling pathways, stem cells, meiosis, and cell cycle because it is transparent, genetically facile, and meiotic prophase and cellular differentiation/gametogenesis occur in a linear assembly-like fashion. These features make EdU a great tool to study dynamic aspects of mitotically cycling cells and germline development. This protocol describes how to successfully prepare EdU bacteria, feed them to wild-type C. elegans hermaphrodites, dissect the hermaphrodite gonad, stain for EdU incorporation into DNA, stain with antibodies to detect various cell cycle and developmental markers, image the gonad and analyze the results. The protocol describes the variations in the method and analysis for the measurement of S-phase index, M-phase index, G2 duration, cell cycle duration, rate of meiotic entry, and rate of meiotic prophase progression. This method can be adapted to study the cell cycle or cell history in other tissues, stages, genetic backgrounds, and physiological conditions.

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

An imaging-based method is described that can be used to identify S-phase and analyze cell cycle dynamics in the C. elegans hermaphrodite germline using the thymidine analog EdU. This method requires no transgenes and is compatible with immunofluorescent staining.

C. elegans Germline timidin Analog EdU ile hücre döngüsü analizi

Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases ...

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented protocol uses this model to determine the pathogenicity caused by the mitis group streptococci via the production of H2O2. The mitis group streptococci are an emerging threat that cause many human diseases such as bacteremia, endocarditis, and orbital cellulitis. Described here is a protocol to determine the survival of these worms in response to H2O2 produced by this group of pathogens. Using the gene skn-1 encoding for an oxidative stress response transcription factor, it is shown that this model is important for identifying host genes that are essential against streptococcal infection. Furthermore, it is shown that activation of the oxidative stress response can be monitored in the presence of these pathogens using a transgenic reporter worm strain, in which SKN-1 is fused to green fluorescent protein (GFP). These assays provide the opportunity to study the oxidative stress response to H2O2 derived by a biological source as opposed to exogenously added reactive oxygen species (ROS) sources.

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is an excellent model to dissect host-pathogen interactions. Described here is a protocol to infect the worm with members of the mitis group streptococci and determine activation of the oxidative stress response against H2O2 produced by this group of organisms.

Oksidatif stres nedeniyle Mitis grubu streptokok Caenorhabditis elegans içinde eğitim

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous system can be observed, with single cell resolution, in vivo. Here, we present an integrated protocol for the examination of neurodevelopment in C. elegans embryos. Our protocol combines imaging, lineaging and neuroanatomical tracing of single cells in developing embryos. We achieve long-term, four-dimensional (4D) imaging of living C. elegans&#160;embryos with nearly isotropic spatial resolution through the use of Dual-view Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM). Nuclei and neuronal structures in the nematode embryos are imaged and isotropically fused to yield images with resolution of ~330 nm in all three dimensions. These minute-by-minute high-resolution 4D data sets are then analyzed to correlate definitive cell-lineage identities with gene expression and morphological dynamics at single-cell and subcellular levels of detail. Our protocol is structured to enable modular implementation of each of the described steps and enhance studies on embryogenesis, gene expression, or neurodevelopment.

Here, we present a combinatorial approach using high-resolution microscopy, computational tools, and single-cell labeling in living C. elegans embryos to understand single cell dynamics during neurodevelopment.

İzotropik hafif levha mikroskobu ve otomatik hücre Lineage analizleri kataloğa Caenorhabditis elegans Embriyogenesis Subcellular çözünürlük ile

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...