Agradecemos seu apoio técnico Monash Microimaging. Algumas cepas foram fornecidas pelo centro de genética Caenorhabditis , que é financiado pelo NIH escritório de programas de infra-estrutura de pesquisa (OD010440 P40). Este trabalho foi apoiado por Monash University biomedicina descoberta Fellowship, NHMRC Project Grant (GNT1105374), NHMRC Senior Research Fellowship (GNT1137645) e bolsa de inovação veski: 23-VIF Roger Pocock.

1. preparação e criação de minhoca
Nota: Consulte a Tabela de materiais para todas as informações do produto.
<ol><li>Cultura de Escherichia coli OP50: cultura OP50 bactérias em caldo lisogenia (LB) (triptona 1%, 0,5% de fermento, 0,5% de NaCl, pH 7.0) durante a noite a 37 ° C, sem antibióticos.</li>
	<li>Semente 400 µ l de bactérias OP50 para placas de mídia (NGM) de crescimento de nematoides (1,5 g de NaCl, 8,5 g de ágar-ágar, 1,25 g de peptona, 1 mL de 1 M CaCl2, 1ml de colesterol de 5 mg/mL em etanol, 1ml de 1m MgSO4 e 25 mL de tampão de4 de KPO 1 M) e o ar seco as bactérias por 48 h.</li>
	<li>Pegar vermes nas placas NGM semeadas e incubar a 15 ° C ou 20 ° C.<ol>
<li>Para a análise do germline adulto hermafrodita, escolher bem alimentados vermes L4 para o gramado bacteriano e incubar durante uma noite a 20 ° C.</li>
		<li>Para marcar o número de espermatozoides em hermafroditas, incube L4 vermes a 20 ° C, durante 12 h até os vermes atinjam o molt L4/adulto. Para sincronizar os vermes para a fase de L4, prepare ovos escolhendo vermes adultos com um monte de ovos em solução de água sanitária (1 M de NaOH e água sanitária na proporção 1:1). Permitir que os ovos eclodem e escolher animais de L4 para o experimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare lâminas de microscópio de Teflon colocando 25 µ l de solução de poli-L-lisina no slide e espalhar a solução, usando a ponta da pipeta. Depois de retirar o excesso poli-L-lisina com toalha de papel, permitir que os slides secar ao ar e a incubar a 65 ° C por 15-20 min.</li>
</ol>2. Germline dissecção e coloração6,13
<ol><li>Spot 10 µ l de tetramisole 0,01% (anestésico) sobre uma lamela de 22 × 22 mm e escolher um dias de idade vermes adultos dentro dele.</li>
	<li>Dissecar o verme na cauda, como torna-se sedado usando uma seringa (5 mL) e uma agulha (24 "x 1") e certifique-se de que a linha germinativa não está danificada. Nota: A dissecação deve ser efectuada antes o verme torna-se totalmente paralisado para que a pressão negativa no verme e o movimento de verme ajuda a ejeção da da linha germinal. Para marcar o esperma, devem ser tomadas precauções para não danificar a espermateca pela agulha durante a dissecção. Evite tocar o germline com a agulha, exceto o ponto de dissecação após a espermateca. Se não há quebra no compartimento do germline ou qualquer descarga do germline é observada, o germline não deve ser usado para análise.</li>
	<li>Coloca a lamela invertida em um slide revestido de poli-L-lisina, mantendo o germline dissecado no slide.</li>
	<li>Remova o excesso de líquido sob a lamínula colocando uma torre de papel em um canto da lamela, então lugar o slide em nitrogênio líquido para 1 min. remover rapidamente a lamela usando uma agulha com a germlines no slide.</li>
	<li>Transferir os slides em metanol de-20 ° C por 30-60 s numa câmara e, em seguida, incube durante 30 min em solução recentemente preparada de fixação (1x tamponado fosfato salino (PBS) contendo 0,08 M HEPES pH 6,9, 1,6 mM de MgSO4, 0,8 mM. o glicol de etileno-bis(beta-aminoethyl éter)-N, N, N', N'-tetraacetic ácido (EGTA) e 3,7% paraformaldeído) à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave as lâminas, colocando em uma câmara contendo 1X PBS, pH 7,4 com 0.1% Tween-20 por 10 min. Repita este passo uma vez.</li>
	<li>Bloquear o germlines com 30 µ l de solução de bloqueio (30% de soro de cabra preparado pela adição de 900 µ l de soro de cabra em 1700 µ l de água destilada H2O e 300 µ l de PBS de x 10) em uma câmara húmida preparada colocando toalha de papel molhada em uma caixa de plástico em temperatura ambiente por 30 min.</li>
	<li>Adicione 50 µ l de solução-anticorpo REC-8 em 30% de soro de cabra em uma proporção 1: 300 para cada amostra. Incubar durante uma noite a 4° C.</li>
	<li>Lave as lâminas, colocando em uma câmara contendo 1X PBS com 0.1% Tween-20 por 10 min. Repita a etapa uma vez e retire o excesso de líquido, colocando uma toalha de papel no canto do slide.</li>
	<li>Prepare a solução de anticorpo secundário diluindo fluoróforo verde (488 nm de emissão de onda) anticorpo secundário conjugado (1: 1000), faloidina (mancha de actina, 1:4000) e DAPI (DNA mancha, 1:4000) em 30% de soro de cabra normal.</li>
	<li>Adicione 50 µ l de solução anticorpo secundário para o slide.</li>
	<li>Encube por 1h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavar as lâminas duas vezes, colocando em uma câmara contendo 1X PBS com 0.1% Tween-20 por 10 min. Limpe o excesso de líquido.</li>
	<li>Adicionar 30 µ l de reagente para o slide de fixação e coloque um de 12 mm2 x 1,5 µm lamela em cima e secar as lâminas a 4 ° C durante a noite.</li>
</ol>3. Confocal da microscopia
<ol><li>Ligue o microscópio confocal, laser, scanner de ressonância e software microscópio confocal. Coloque os slides com germlines manchado no suporte do slide acima o objetivo X 63.</li>
	<li>Localize uma linha germinativa, foco na parte superior da linha germinativa e marcá-lo usando o software do microscópio confocal. Da mesma forma, concentrar-se na parte inferior do germline e marcá-lo para estabelecer a espessura total da linha germinal.</li>
	<li>O germline inteira definindo a espessura de cada fatia até 0,5 µm. Mark o germline completa e iniciar a aquisição de imagem. Digitalizar cada fatia 8 vezes e a média de valores para melhorar a qualidade de imagem. O scanner de ressonância permitirá a verificação rápida para evitar o branqueamento durante a imagem latente. Se o microscópio não tem um scanner de ressonância, reduzir o número de exames a quatro para evitar descoramento.</li>
</ol>4. post análise de núcleos de imagem número e distribuição
Nota: Referem-se a complementar a Figura 1 para screenshots do software ferramentas e botões usados.
<ol><li>Importe a imagem para hottie 8.4.1 ou versões posteriores do software.</li>
	<li>Defina região mitótica, zona de transição, região meiótica, região do oócito e espermateca do germline, identificando a morfologia nuclear em cada região.</li>
	<li>Use o botão de função de superfície (Figura complementar 1A) do software para selecionar a região de interesse.</li>
	<li>Cancelar o assistente de criação de superfície automática e manualmente, desenhar a região de interesse, o primeiro e o último pedaço da imagem da pilha tridimensional.</li>
	<li>Clique em criar superfície. Nota: O software automaticamente irá desenvolver as pilhas entre a primeira e a última pilha.</li>
	<li>Máscara de todos os canais exceto DAPI clicando o botão de canal de máscara (Complementar a figura 1B-C).</li>
	<li>Defina parâmetros de tamanho nuclear usando o botão de ponto de função (complementar figura 1A). Para a região mitótica, defina um diâmetro XY de 2 µm, deixando o diâmetro Z indefinido. Para a zona de transição, defina o diâmetro XY de 2 µm de diâmetro de Z como 1,5 µm. (complementar a Figura 1). Nota: Solucione os diâmetros de acordo com a ampliação e especificações do microscópio. Para o protocolo atual, o objetivo utilizado foi 63 X e forneceu um extra de ampliação de 1,70 vezes durante a imagem latente. Se o objetivo for alterado, por exemplo 40 X, os diâmetros devem ser alterados em conformidade. Solução de problemas deve ser realizada com sua germlines para estabelecer os parâmetros corretos. A região mitótica de um braço do germline de tipo selvagem tem aproximadamente 250 núcleos. O diâmetro deve ser modificado para alcançar esse valor. Use pelo menos 15 germlines para determinar o valor ideal para o diâmetro. Uma abordagem semelhante deve ser usada para calibrar a zona de transição (núcleos de 150-170) e a região meiótica (núcleos de 600-700).</li>
	<li>Limite a detecção de manchas, definindo o limite mínimo (complementar figura 1E). Uso DAPI manchados tipo selvagem germlines para estabelecer o limite mínimo, aumentando o limiar mínimo de renderização tridimensional até que a mancha aparece fora da linha germinativa.</li>
	<li>Salve a imagem e obter o número de núcleos da tabela gerada automaticamente pelo software. Exporte as imagens como arquivos TIF.</li>
</ol>5. publicar a análise de imagem para marcar o esperma e o número de cromossomos
<ol><li>Execute a renderização tridimensional, selecionando a espermateca como a região de interesse. Para detectar cada espermatozoide, definir o diâmetro do ponto entre 0,75 - 1,0 µm para X e Y-eixo, enquanto o diâmetro Z permanece indefinido. Use o botão de função de pontos, como mostrado na Figura complementar 1.</li>
	<li>Subtrair o fundo marcando fundo subtraia caixa e usando valores de correção de fundo calculados pelo software (complementar a Figura 1). Nota: O software de hottie escolhe pontos de alta intensidade primeiro, portanto, o efeito de fundo é mínimo, enquanto não há diferença significativa entre a região de interesse e o fundo. Um segundo método é definir a correção de fundo manualmente, se for caso disso, valores pode ser dado para o plano de fundo. Correção de fundo manual será adequada se a intensidade de amostras independentes precisa de comparação.</li>
	<li>Ajuste o limite de renderização tridimensional para detectar todos os DAPI manchado de esperma na espermateca (complementar figura 1E).</li>
	<li>Para a contagem de cromossomas, definir o diâmetro do ponto < 0,75 µm para X e Y-eixo antes de desenvolver modelos tridimensionais.</li>
	<li>Salve a imagem e exportar como arquivo TIF.</li>
</ol>6. análise de imagem para a reconstrução do citoesqueleto do Germline de postar
<ol><li>Identificar a região de interesse no germline e mascarar todos os canais exceto faloidina clicando botão máscara canais .</li>
	<li>Defina um detalhes da superfície de 0,25 µm usando o botão de função de superfície (complementar a Figura 1). Nota: Isto significa que cada 0,25 µm será processado em modelos tridimensionais. Detalhes da superfície podem ser constante para qualquer região do germline onde um modelo de superfície tridimensional será criado para cada 0,25 µm. No entanto, para a região do oócito, detalhes da superfície podem ser aumentada para 0,35 - 0,5 µm, devido à presença de fibras de actina bem definidas nesta região.</li>
	<li>Subtrair o fundo marcando fundo subtraia caixa e usando valores de correção de fundo calculados pelo software (complementar a Figura 1).</li>
	<li>Ajuste o limite de renderização tridimensional dependendo da estrutura que exigem análise (complementar figura 1E).</li>
	<li>Salve a imagem tridimensional desenvolvida e exportar como um arquivo TIF.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hubbard, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+germ+line:+a+model+for+stem+cell+biology.">Caenorhabditis elegans germ line: a model for stem cell biology.</a> Dev Dyn. 236 (12), 3343-3357 (2007).</li><li>Joshi, P. M., Riddle, M. R., Djabrayan, N. J., Rothman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+model+for+stem+cell+biology.">Caenorhabditis elegans as a model for stem cell biology.</a> Dev Dyn. 239 (5), 1539-1554 (2010).</li><li>Kershner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+stem+cells+and+their+regulation+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Germline stem cells and their regulation in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Adv Exp Med Biol. 786, 29-46 (2013).</li><li>Byrd, D. T., Knobel, K., Affeldt, K., Crittenden, S. L., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DTC+niche+plexus+surrounds+the+germline+stem+cell+pool+in+Caenorhabditis+elegans.">A DTC niche plexus surrounds the germline stem cell pool in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 9 (2), 88372 (2014).</li><li>Kimble, J., Crittenden, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controls+of+germline+stem+cells,+entry+into+meiosis,+and+the+sperm/oocyte+decision+in+Caenorhabditis+elegans.">Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the sperm/oocyte decision in Caenorhabditis elegans.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 405-433 (2007).</li><li>Hansen, D., Hubbard, E. J., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-pathway+control+of+the+proliferation+versus+meiotic+development+decision+in+the+Caenorhabditis+elegans+germline.">Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline.</a> Dev Biol. 268 (2), 342-357 (2004).</li><li>Crittenden, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+RNA-binding+protein+controls+germline+stem+cells+in+Caenorhabditis+elegans.">A conserved RNA-binding protein controls germline stem cells in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 417 (6889), 660-663 (2002).</li><li>Eckmann, C. R., Crittenden, S. L., Suh, N., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLD-3+and+control+of+the+mitosis/meiosis+decision+in+the+germline+of+Caenorhabditis+elegans.">GLD-3 and control of the mitosis/meiosis decision in the germline of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 168 (1), 147-160 (2004).</li><li>Schumacher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+repression+of+C.+elegans+p53+by+GLD-1+regulates+DNA+damage-induced+apoptosis.">Translational repression of C. elegans p53 by GLD-1 regulates DNA damage-induced apoptosis.</a> Cell. 120 (3), 357-368 (2005).</li><li>McMullen, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macro-level+modeling+of+the+response+of+C.+elegans+reproduction+to+chronic+heat+stress.">Macro-level modeling of the response of C. elegans reproduction to chronic heat stress.</a> PLoS Comput Biol. 8 (1), 1002338 (2012).</li><li>Hubbard, E. J., Korta, D. Z., Dalfo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+control+of+germline+development.">Physiological control of germline development.</a> Adv Exp Med Biol. 757, 101-131 (2013).</li><li>Wolke, U., Jezuit, E. A., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-dependent+cytoplasmic+streaming+in+C.+elegans+oogenesis.">Actin-dependent cytoplasmic streaming in C. elegans oogenesis.</a> Development. 134 (12), 2227-2236 (2007).</li><li>Jones, A. R., Francis, R., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLD-1,+a+cytoplasmic+protein+essential+for+oocyte+differentiation,+shows+stage-+and+sex-specific+expression+during+Caenorhabditis+elegans+germline+development.">GLD-1, a cytoplasmic protein essential for oocyte differentiation, shows stage- and sex-specific expression during Caenorhabditis elegans germline development.</a> Dev Biol. 180 (1), 165-183 (1996).</li><li>Hasegawa, E., Karashima, T., Sumiyoshi, E., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+CPB-3+interacts+with+DAZ-1+and+functions+in+multiple+steps+of+germline+development.">C. elegans CPB-3 interacts with DAZ-1 and functions in multiple steps of germline development.</a> Dev Biol. 295 (2), 689-699 (2006).</li><li>Austin, J., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=glp-1+is+required+in+the+germ+line+for+regulation+of+the+decision+between+mitosis+and+meiosis+in+C.+elegans.">glp-1 is required in the germ line for regulation of the decision between mitosis and meiosis in C. elegans.</a> Cell. 51 (4), 589-599 (1987).</li><li>Berry, L. W., Westlund, B., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ-line+tumor+formation+caused+by+activation+of+glp-1,+a+Caenorhabditis+elegans+member+of+the+Notch+family+of+receptors.">Germ-line tumor formation caused by activation of glp-1, a Caenorhabditis elegans member of the Notch family of receptors.</a> Development. 124 (4), 925-936 (1997).</li><li>Fox, P. M., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Germline+Stem+Cell+Differentiation+Following+Loss+of+GLP-1+Notch+Activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201 (1), 167-184 (2015).</li><li>Pasierbek, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Caenorhabditis+elegans+cohesion+protein+with+functions+in+meiotic+chromosome+pairing+and+disjunction.">A Caenorhabditis elegans cohesion protein with functions in meiotic chromosome pairing and disjunction.</a> Genes and Development. 15 (11), 1349-1360 (2001).</li><li>Klass, M., Wolf, N., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+male+reproductive+system+and+sexual+transformation+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Development of the male reproductive system and sexual transformation in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 52 (1), 1-18 (1976).</li><li>Korta, D. Z., Tuck, S., Hubbard, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S6K+links+cell+fate,+cell+cycle+and+nutrient+response+in+C.+elegans+germline+stem/progenitor+cells.">S6K links cell fate, cell cycle and nutrient response in C. elegans germline stem/progenitor cells.</a> Development. 139 (5), 859-870 (2012).</li><li>Laband, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+segregation+occurs+by+microtubule+pushing+in+oocytes.">Chromosome segregation occurs by microtubule pushing in oocytes.</a> Nat Commun. 8 (1), 1499 (2017).</li></ol>

Os autores declaram não há conflito de interesses.

O objetivo do presente protocolo é melhorar a precisão e reduzir o tempo necessário para a análise da linha germinal. Após preparação padrão de germlines dissecado, um modelo tridimensional do germline núcleos é preparado por processamento computacional. Permitindo a observação da distribuição de núcleos germline no espaço, renderização tridimensional calcula o número de núcleos em regiões específicas da da linha germinal. O aspecto crítico do nosso método é uma definição precisa dos parâmetros de tamanho e forma dos núcleos. Isso depende da clareza de coloração e ampliação usado a imagem. Nós confirmamos a precisão do método, comparando a publicado dados analisados manualmente1. Para confirmar ainda mais a precisão do nosso método, usamos vários mutantes em diferentes condições e confirmou os resultados com a literatura publicada. Também confirmou a capacidade do método para detectar fenótipos sutis e fortes - mutantes cpb-3 e glp-1 , respectivamente. Além disso, este método mostra capacidade de adaptação às mudanças em núcleos de tamanho e forma dentro do germline ou mesmo entre cepas. Esta propriedade também permite a identificação e a Pontuação das estruturas menores do germline como cromossomos e esperma. O método também permite resolução de problemas futuros para os parâmetros de tamanho e forma, se necessário. Nossa análise foi capaz de elucidar a distribuição dos núcleos no germline e mostrou que núcleos em mitótica e regiões paquíteno organizam-se em diferentes padrões. Aplicando a renderização tridimensional para REC-8 e DAPI coloração, mostramos também a distribuição de REC-8 em núcleos da região mitótica.
Renderização tridimensional de actina coloração habilitado exame pormenorizado do germline estruturas do citoesqueleto. O germline parece ter duas estruturas separadas de actina, embora eles mantém contato físico. Enquanto a reconstrução do citoesqueleto para o germline inteira é possível como uma entidade única, os melhores resultados podem ser obtidos se as regiões de interesse são pré-selecionados em mitótica, transição e regiões meióticas. O citoesqueleto germline distal tem uma forma indefinida e evolui para uma estrutura filamentosa na extremidade proximal. Nosso protocolo, portanto, permite a reconstrução tridimensional do citoesqueleto de actina germline definindo parâmetros específicos para acomodar as diferenças na distribuição de actina. O aspecto mais importante da análise é a definição de parâmetros como tamanho de núcleos e exigência de detalhes da superfície. Reduzir o tamanho de núcleos abaixo o tamanho real correrá o risco do software para pegar pontos brilhantes dentro dos núcleos como objetos separados. Da mesma forma, valores altos detalhes superficiais levará à perda de estruturas tridimensionais precisas. O método proposto baseia-se na precisão de dissecção e a qualidade de coloração da linha germinativa. Um germline danificado pode levar à liberação de núcleos do germline, causando a numeração imprecisa. Fundo elevado da coloração também fará com que a contagem de núcleos impreciso e inadequada renderização tridimensional.
Nosso método se estende anteriormente conhecidos métodos automatizados de análise germline onde somos capazes de analisar o número de núcleos e distribuição/expressão das proteínas do germline no espaço com um único protocolo20. Em segundo lugar, nosso método permite marcar de estruturas menores como cromossomos dentro da linha germinativa. Segregação do cromossomo é um aspecto importante do desenvolvimento de oócito21. Usando nosso método, é possível detectar o número e posição dos cromossomos, onde a distância pode ser definida por calibrando contra oócitos de tipo selvagem. Qualquer mutação afetando a separação do cromossomo pode ser estudada usando esta ferramenta. Além disso, o método pode ser estendido para estudar os cromossomos em embriões no estágio de 2 células. A análise computacional também fornece o número de espermatozoides na espermateca, número de cromossomos em um oócito e germline estruturas do citoesqueleto. Tomados em conjunto, o método fornece uma análise abrangente do c. elegans germline usando um único protocolo, reduzindo consideravelmente o tempo de análise. O método elimina a necessidade de várias ferramentas para cada análise (número de núcleos, distribuição da proteína e estrutura do citoesqueleto) e remove o tempo de codificação necessário em qualquer software específico. Finalmente, esse método pode ser efetivamente estendido para outros estudos de worm, incluindo a análise tridimensional de vermes vivos sedados.

A conservação de sinalização com mamíferos vias faz c. elegans , um excelente modelo para o estudo de vários processos biológicos1,2. Em nosso laboratório, usamos o c. elegans germline para estudar o desenvolvimento de células-tronco, apoptose e expressão gênica. Enquanto o germline é uma estrutura tridimensional, muitos estudos são duas dimensões devido à natureza demorada e trabalhosa de análise tridimensional. É altamente provável que a análise bidimensional pode deturpar na vivo eventos no germline. O hermafrodita de adultos de c. elegans tem dois braços da linha germinal, cada um deles abriga uma célula somática ponta distal (DTC) que mantém distais células germinativas num estado indiferenciado3,4. Estas células germinativas começam a diferenciar como movem-se longe do DTC, escapar de sua influência e tornar-se oócitos e esperma como atingem a extremidade proximal da da linha germinal. Durante este processo, núcleos de células germinativas sofrem mitose, antes de fazer a transição para a meiose5,6. Produção de espermatozoides é completada pelo estágio larval 4 (L4) do desenvolvimento, após o qual os oócitos são produzidos durante a idade adulta. Os espermatozoides são armazenados na espermateca onde eles fertilizam oócitos para gerar embriões.
Existem vários fatores genéticos e ambientais que podem influenciar o desenvolvimento do germline em c. elegans , resultando em mudanças no número de núcleos, o número de eventos de apoptotic, dinâmica do cromossoma e expressão de proteínas e/ou localização7 ,8,9,10,11. A análise desses eventos requer a identificação de cada etapa de diferenciação com base na distribuição e morfologia nuclear. Para analisar com precisão esses parâmetros manualmente com um tamanho de amostra grande é trabalhosa e demorada. Para contornar estes inconvenientes e permitir a consistência da análise, desenvolvemos um método automatizado para análise tridimensional do c. elegans germline para núcleos contando, distribuição de núcleos, expressão de proteínas e do citoesqueleto estrutura. Combinando a microscopia confocal com renderização tridimensional, geramos parâmetros de tamanho e forma, para a identificação de cada estágio da diferenciação de células germinativas. Além disso, esse método permite a contagem de esperma e de núcleos de células germinativas, mais Pontuação do número de cromossomos em cada oócito.
Uma estrutura crucial do germline é o citoesqueleto, que fornece a estabilidade para o compartimento da linha germinal, SIDA a ciclose e proteção germline núcleos12. Usando processamento computacional, realizamos a reconstrução tridimensional do citoesqueleto germline e identificado características distintas do citoesqueleto, dentro da linha germinativa. Aqui, descrevemos um protocolo passo a passo para ilustrar a análise computacional como combinado com confocal de imagem permite uma análise abrangente do germline c. elegans .
Propomos um método rápido de análise tridimensional de c. elegans germline (Figura 1). Usando a análise tridimensional, é possível estudar a distribuição tridimensional do germline núcleos (Figura 2 e Figura 3), automatizada contagem de células (Figura 2), reconstrução do germline citoesqueleto ( Figura 3), distribuição de proteínas (Figura 4) e marcar o número de espermatozoides na espermateca e cromossomos em oócitos (Figura 5). O método não só permite a quantificação fácil e precisa do germline mas identifica fenótipos fisiologicamente relevantes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:933px;" width="934">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">C. elegans strains: wild type (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III&#160;</td>
			<td style="width:264px;">Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OP50 Escherichia coli bacteria</td>
			<td style="width:264px;">Homemade</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nematode Growth Media (NGM) plates</td>
			<td style="width:264px;">Homemade</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">polyclonal rabbit anti-REC-8&#160;</td>
			<td>SDIX</td>
			<td>29470002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa 488 conjugated antibody raised in goat</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A-21236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytoskeletal dye phalloidin&#160;</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:168px;">A-12380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI&#160;</td>
			<td>Thermofisher Scientific&#160;</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-L-lysine&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetramisol&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgSO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:168px;">M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1M HEPES buffer, pH 7.4&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:168px;">G0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10X PBS pH 7.4&#160;</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">37% Paraformaldehyde solution</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1040031000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal goat serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluoroshield fixing reagent&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F6182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol&#160;</td>
			<td>Millipore&#160;</td>
			<td>1009832511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20&#176;C &#38; 25&#176;CIncubator&#160;</td>
			<td>Any brand</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Light microscope</td>
			<td style="width:264px;">Any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope&#160;&#160;</td>
			<td style="width:264px;">Any brand (Leica, Zeiss)</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Computer equipped with Imaris suit 8.4.1 or later version, full licence to use the software and Matlab software.</td>
			<td style="width:264px;">Bitplane</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Phospho buffered saline, pH 7.4</td>
			<td style="width:264px;">Homemade</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Teflon microscope slides&#160;</td>
			<td style="width:264px;">Tekdon&#160;</td>
			<td style="width:168px;">&#160;941-322-8288</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

computational analysis of the caenorhabditis elegans germline to study the distribution of nuclei, proteins, and the cytoskeleton

O germline Caenorhabditis elegans (c. elegans) é usada para estudar vários processos biologicamente importantes, incluindo a dinâmica de desenvolvimento, apoptose e cromossomo de células-tronco. Enquanto o germline é um excelente modelo, a análise é frequentemente duas dimensões devido ao tempo e o trabalho necessário para análise tridimensional. Grandes leituras em tais estudos são a posição/número de núcleos e distribuição da proteína dentro da linha germinativa. Aqui, apresentamos um método para executar a análise automatizada do germline usando microscopia confocal e abordagens computacionais para determinar o número e posição dos núcleos em cada região do germline. Nosso método também analisa a distribuição de proteína germline que permite o exame tridimensional da expressão da proteína em diferentes origens genéticas. Além disso, nosso estudo mostra variações na arquitetura do citoesqueleto em distintas regiões do germline que podem acomodar requisitos específicos de desenvolvimento espaciais. Finalmente, nosso método permite que a contagem automatizada do esperma na espermateca de cada linha germinativa. Tomados em conjunto, nosso método permite a análise fenotípica rápida e reprodutível do germline c. elegans .

Figura 1 indica o tempo necessário para análise tridimensional da linha germinal. Hermafroditas L4 incubadas a 20 ° C foram dissecadas para isolar germlines e coradas com DAPI, faloidina e anticorpos contra as proteínas da linha germinal. Germlines são fotografadas usando microscopia confocal. Microscopia confocal e coloração requer aproximadamente 24 h. análise computacional para o germline completa exige 10-15 min para contar o número e a posição dos núcleos, identificar a distribuição de proteína, analisar a estrutura do citoesqueleto e Pontuação do número de espermatozoides. Análise completa manual requer mais de 2h por germline e está sujeito à influência do operador, portanto, nosso método automatizado do elevado-throughput reduz o tempo de análise e aumenta a reprodutibilidade.
Automatizado de núcleos marcando revela que um braço do germline abriga aproximadamente 1.000-1.200 núcleos (Figura 2C), correspondendo bem anteriormente publicado manual marcando dados1. Para confirmar que a exatidão de marcar um gol, vários mutantes e condições diferentes são utilizados (Figura 2D-G). Por exemplo, comparamos, rnp-8(tm435), cpb-3(bt17)e glp-1(e2141) vermes mutantes para animais do tipo selvagem. Contagem automatizada reproduzida a conhecida redução do número de núcleos em cpb-3 e glp-1 mutante germlines14,15,16,17. Uma severa redução no número de núcleos observou-se também nos mutantes sensíveis à temperatura de glp-1(e2141) quando incubados a 25 ° C. A distribuição dos núcleos é dependente do estágio de diferenciação. A região mitótica, que contém aproximadamente 250 núcleos no tipo selvagem, é hermeticamente embalados com núcleos em comparação com o resto do germline (Figura 3)1. O espaçamento entre os núcleos mitóticos é mínimo e núcleos estão localizados em toda a região mitótica. No entanto, como os núcleos se move longe da extremidade distal, eles aparecem mais no sentido da circunferência do germline (Figura 3). A mudança na distribuição começa na zona de transição e completa como os núcleos entram meiose/paquíteno.
O germline tem estruturas cytoskeletal específicas em diferentes estágios de diferenciação. Nós visualizado F-Actina manchando o germline com faloidina. A distribuição de F-Actina do distal à extremidade proximal do germline foi distinta em cada região (Figura 3 e Figura 5). Em geral, existem duas estruturas separadas que aparecem como um cilindro dentro do cilindro. Na região mitótica, actina interna aparece como uma massa sólida com uma forma específica (Figura 3). Como o germline atinge a zona de transição, a actina interna pressupõe uma estrutura mais cilíndrica e torna-se um cilindro oco como chegar tarde paquíteno. A segunda camada de actina cobre a camada interna, dando forma à linha germinativa. Essa estrutura de actina 'cilindro dentro do cilindro' desaparece em relação à região do oócito (Figura 5). Na região do oócito, actina aparece como fibras grossas. Os oócitos são separados por um ráquis de actina, embora parece ser dinâmico para permitir a circulação de oócitos para a espermateca. Finalmente, actina na espermateca também forma grossos feixes de fibras de actina. No entanto, as fibras parecem ser embalado mais perto do que na região do oócito. A estrutura do citoesqueleto aparece complementar os padrões de distribuição dos núcleos (Figura 3). Na região mitótica, os núcleos aparecem colocados ao redor da estrutura interna de actina. Como eles chegam a meiose/paquíteno, os núcleos organizam entre os dois cilindros de actina, deixando o meio do germline principalmente desprovido de núcleos (Figura 3). Isto provavelmente poderia ajuda ininterrupta a ciclose no germline. Germlines foram corados com um anticorpo contra a proteína REC-8 e analisadas por microscopia confocal. REC-8 é distribuído homogeneamente em torno de núcleos iniciais do germline e mais tarde é clivada e degradado durante a meiose18. Distribuição de REC-8 em análise transversal tridimensional do germline mostra a distribuição de proteína na região mitótica (Figura 4).
Renderização tridimensional da extremidade proximal do germline inclui a espermateca e três primeiros oócitos distais para a espermateca. Nossa análise reconhecido uma média de 151 esperma em cada espermateca (n = 18). Isso corresponde a literatura publicada, indicando a confiabilidade do método (Figura 5F)19. Esta análise pode ser realizada juntamente com o do citoesqueleto ou estudos de distribuição de proteína. O genoma de c. elegans é distribuído entre seis cromossomos. Em oócitos totalmente desenvolvido tipo selvagem, esses cromossomos são visíveis em podem ser contados. Esta separação do cromossomo pode ser usada para estudar a estabilidade do cromossoma ou outros defeitos associados com o desenvolvimento do oócito. Por renderização tridimensional, pode ser visualizado o número de cromossomos, e se os cromossomos são separados corretamente, o número pode ser obtido (Figura 5) com precisão.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57702/57702fig1.jpg"> Figura 1 . Cronograma para análise automatizada. Comparação de tempo entre a análise manual e computacional do germline c. elegans . <a href="/files/ftp_upload/57702/57702fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57702/57702fig2.jpg"> Figura 2 . Distribuição de núcleos no germline. (A) DAPI manchado germline mostrando mitótica, transição e regiões paquíteno/meiótica. (B) computacional modelo tridimensional do germline. (C) a pontuação para o número total de núcleos em germlines do tipo selvagem. (D-F) Marcando para o número de núcleos no mitótica, transição e meióticas regiões de tipo selvagem, rnp-8, 3-cpbe glp-1 germlines mutante. (G) a comparação do número total de núcleos no mutante de glp-1 a 20 ° C e 25 ° C. Barra de erro representa o erro padrão. Teste de Student. n < 0,0001, * * *n < 0,001, * *n < 0,01, *n < 0,05. <a href="/files/ftp_upload/57702/57702fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57702/57702fig3.jpg"> Figura 3 . Estrutura do citoesqueleto do germline. (A-B) Organização do citoesqueleto interno actina (vermelho) do germline na região mitótica. A actina interna tem uma estrutura difusa em relação ao exterior actina na região mitótica. (C-D) Na região de paquíteno, o citoesqueleto assume uma estrutura cilíndrica, formando dois cilindros, entre os quais são organizados os núcleos (azuis). (E-F) Organização dos núcleos do germline em regiões mitóticas e paquíteno. A distribuição dos núcleos é mais no sentido da circunferência do 'germtube' na região de paquíteno comparada a região mitótica (verde) e meio do germline a tornar-se desprovida de núcleos. <a href="/files/ftp_upload/57702/57702fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57702/57702fig4.jpg"> Figura 4 . Expressão REC-8 na região mitótica. (A) Micrografia mostrando a extremidade distal de uma REC-8-manchado da linha germinal. (B-C) Renderização tridimensional de REC-8 coloração (mostrado em azul) e a distribuição de proteína entre os núcleos mitóticos (em verde). REC-8 coloração é menos abundante proximal à região mitótica (marcada por pontos brancos que representam núcleos). <a href="/files/ftp_upload/57702/57702fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57702/57702fig5.jpg"> Figura 5 . Estrutura do germline na extremidade proximal. (A) DAPI coloração do germline na extremidade proximal. (B) tridimensional renderização de DAPI coloração apresentando esperma na espermateca (amarela) e cromossomos em oócitos (branco). (C-E) Estrutura tridimensional do citoesqueleto na extremidade proximal da linha germinativa. Marcas vermelhas na extremidade proximal completa e verde marca a espermateca. Análise de secional transversal mostra que o citoesqueleto constitui não só uma estrutura filamentosa de actina em torno de oócitos, mas também separa entre oócitos. (F) gráfico mostrando o número de espermatozoides em cada espermateca e média obtidos de vários espermateca (n = 18). Barra de erro representa o erro padrão. <a href="/files/ftp_upload/57702/57702fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/57702/57702supfig1.jpg"> Complementar Figura 1 . Descrição de ferramentas de software de. (A) as manchas e ferramentas de superfície para a detecção de núcleos e coloração de proteínas. (B-C) A seleção da região tridimensional de interesse usando a ferramenta de superfície. (D) definir o XY-diâmetro, usando a ferramenta de pontos, para a deteção de núcleos. Dependendo da região de interesse e coloração, correção de diâmetro e fundo o eixo z pode ser usada. (E) mínimo e deteção de limiar de intensidade máxima. Uma abordagem semelhante pode ser usada para a função superfície onde em vez de definir o diâmetro, e os detalhes de superfície podem ser definidos. <a href="/files/ftp_upload/57702/57702supfig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Análise computacional do Germline Caenorhabditis elegans , para estudar a distribuição de núcleos, as proteínas e o citoesqueleto

Apresentamos um método automatizado para reconstrução tridimensional do germline Caenorhabditis elegans . Nosso método determina o número e a posição de cada núcleo dentro da linha germinativa e distribuição de proteína germline análises e estrutura do citoesqueleto.

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

computational-analysis-caenorhabditis-elegans-germline-to-study

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

6.2K visualizações.  Monash University. Apresentamos um método automatizado para reconstrução tridimensional do germline Caenorhabditis elegans . Nosso método determina o número e a posição de cada núcleo dentro da linha germinativa e distribuição de proteína germline análises e estrutura do citoesqueleto.

Vídeo: Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the field of environmental health. This is due in part to the paucity of model systems that can (1) accurately recapitulate keys features of reproductive processes and (2) do so in a medium- to high-throughput fashion, without the need for a high number of vertebrate animals.
We describe here an assay in the nematode C. elegans that allows the rapid identification of germline toxicants by monitoring the induction of aneuploid embryos. By making use of a GFP reporter line, errors in chromosome segregation resulting from germline disruption are easily visualized and quantified by automated fluorescence microscopy. Thus the screening of a particular set of compounds for its toxicity can be performed in a 96- to 384-well plate format in a matter of days. Secondary analysis of positive hits can be performed to determine whether the chromosome abnormalities originated from meiotic disruption or from early embryonic chromosome segregation errors. Altogether, this assay represents a fast first-pass strategy for the rapid assessment of germline dysfunction following chemical exposure.

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

Avaliação Compreensiva de Germline Chemical Toxicity Usando o Nemátodo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Biologia do Desenvolvimento

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

Utilizando Análise de confocal<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Para Investigar moduladores de Wnt e Shh morfogénio gradientes

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize mammalian adaptive immunity. Drosophila and mammalian hematopoiesis occur in spatially and temporally distinct phases to produce several blood cell lineages. Both systems maintain reservoirs of blood cell progenitors with which to expand or replace mature lineages. The hematopoietic system allows Drosophila and mammals to respond to and to adapt to immune challenges. Importantly, the transcriptional regulators and signaling pathways that control the generation, maintenance, and function of the hematopoietic system are conserved from flies to mammals. These similarities allow Drosophila to be used to genetically model hematopoietic development and disease.
Here we detail assays to examine the hematopoietic system of Drosophila larvae. In particular, we outline methods to measure blood cell numbers and concentration, visualize a specific mature lineage in vivo, and perform immunohistochemistry on blood cells in circulation and in the hematopoietic organ. These assays can reveal changes in gene expression and cellular processes including signaling, survival, proliferation, and differentiation and can be used to investigate a variety of questions concerning hematopoiesis. Combined with the genetic tools available in Drosophila, these assays can be used to evaluate the hematopoietic system upon defined genetic alterations. While not specifically outlined here, these assays can also be used to examine the effect of environmental alterations, such as infection or diet, on the hematopoietic system.

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Drosophila and mammalian hematopoietic systems share many common features, making Drosophila an attractive genetic model to study hematopoiesis. Here we demonstrate dissection and mounting of the major larval hematopoietic organ for immunohistochemistry. We also describe methods to assay various larval hematopoietic compartments including circulating hemocytes and sessile crystal cells.

Métodos para examinar a linfa Gland e Hemócitos em<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple cellular and developmental processes principally via activation of ERK, the terminal kinase of the pathway. Tight regulation of ERK activity is essential for normal development and homeostasis; overly active ERK results in excessive cellular proliferation, while underactive ERK causes cell death. C. elegans is a powerful model system that has helped characterize the function and regulation of RTK-RAS-ERK signaling pathway during development. In particular, the RTK-RAS-ERK pathway is essential for C. elegans germline development, which is the focus of this method. Using antibodies specific to the active, diphosphorylated form of ERK (dpERK), the stereotypical localization pattern can be visualized within the germline. Because this pattern is both spatially and temporally controlled, the ability to reproducibly assay dpERK is useful to identify regulators of the pathway that affect dpERK signal duration and amplitude and thus germline development. Here we demonstrate how to successfully dissect, stain, and image dpERK within the C. elegans gonad. This method can be adapted for spatial localization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided an antibody compatible with immunofluorescence is available.

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

We present an immunofluorescence&#160;imaging-based method for spatial and temporal localization of active ERK in the dissected C. elegans gonad. The protocol described here can be adapted for visualization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided a suitable antibody reagent is available.

Espaciais e temporais Análise do Active ERK na<em&gt; C. elegans</em&gt; germinativa

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein are molecular motors that regulate anterograde and retrograde transport, respectively. These motors use microtubule networks as rails. Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful model organism to study axonal transport and IFT in vivo. Here, I describe a protocol to observe axonal transport and IFT in living C. elegans. Transported cargo can be visualized by tagging cargo proteins using fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP). C. elegans is transparent and GFP-tagged cargo proteins can be expressed in specific cells under cell-specific promoters. Living worms can be fixed by microbeads on 10% agarose gel without killing or anesthetizing the worms. Under these conditions, cargo movement can be directly observed in the axons and cilia of living C. elegans without dissection. This method can be applied to the observation of any cargo molecule in any cells by modifying the target proteins and/or the cells they are expressed in. Most basic proteins such as molecular motors and adaptor proteins that are involved in axonal transport and IFT are conserved in C. elegans. Compared to other model organisms, mutants can be obtained and maintained more easily in C. elegans. Combining this method with various C. elegans mutants can clarify the molecular mechanisms of axonal transport and IFT.

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a good model to study axonal and intracellular transport. Here, I describe a protocol for in vivo recording and analysis of axonal and intraflagellar transport in C. elegans.

Imobilização de Caenorhabditis elegans , para analisar o transporte intracelular nos neurônios

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain and protect cellular identities. The conversion of germ cells into specific neurons in the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful tool for performing genetic screens in order to dissect regulatory pathways that safeguard established cell identities. Reprogramming of germ cells to a specific type of neurons termed ASE requires transgenic animals that allow broad over-expression of the Zn-finger transcription factor (TF) CHE-1. Endogenous CHE-1 is expressed exclusively in two head neurons and is required to specify the glutamatergic ASE neurons fate, which can easily be visualized by the gcy-5prom::gfp reporter. A trans gene containing the heat-shock promoter-driven che-1 gene expression construct allows broad mis-expression of CHE-1 in the entire animal upon heat-shock treatment. The combination of RNAi against the chromatin-regulating factor LIN-53 and heat-shock-induced che-1 over-expression leads to reprogramming of germ cell into ASE neuron-like cells. We describe here the specific RNAi procedure and appropriate conditions for heat-shock treatment of transgenic animals in order to successfully induce germ cell to neuron conversion.

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

This protocol describes how to study cellular processes during cell fate conversion in Caenorhabditis elegans in vivo. Using transgenic animals, allowing heat-shock promoter-driven overexpression of the neuron fate-inducing transcription factor CHE-1 and RNAi-mediated depletion of the chromatin-regulating factor LIN-53 germ cell to neuron reprogramming can be observed in vivo.

Aplicação de RNAi e calor-choque-induzida expressão de fator de transcrição para reprogramar as células germinativas de neurônios em c. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that makes up much of the parenchyma of the human placenta. The distal villous capillary network is the terminus of the fetal blood supply after several generations of branching of vessels extending out from the umbilical cord. This network has a contiguous cellular sheath, the syncytial trophoblast barrier layer, which prevents mixing of fetal blood and the maternal blood in which it is continuously bathed. Insults to the integrity of the placental capillary network, occurring in disorders such as maternal diabetes, hypertension and obesity, have consequences that present serious health risks for the fetus, infant, and adult. To better define the structural effects of these insults, a protocol was developed for this study that captures capillary network structure on the order of 1 - 2 mm3 wherein one can investigate its topological features in its full complexity. To accomplish this, clusters of terminal villi from placenta are dissected, and the trophoblast layer and the capillary endothelia are immunolabeled. These samples are then clarified with a new tissue clearing process which makes it possible to acquire confocal image stacks to z- depths of ~1 mm. The three-dimensional renderings of these stacks are then processed and analyzed to generate basic capillary network measures such as volume, number of capillary branches, and capillary branch end points, as validation of the suitability of this approach for capillary network characterization.

This study presents a protocol for the reversible tissue clearing, immunostaining, 3D-rendering and analysis of vascular networks in human placenta villi samples on the order of 1 - 2 mm3.

Renderização tridimensional e análise de Immunolabeled, esclareceu humana da placenta vilosa redes vasculares

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are facilitated by the transparency of the animal, the ability to do forward and reverse genetic assays, the relative ease of generating fluorescently labeled proteins, and the use of fluorescent dyes that can either be microinjected into the early embryo or incorporated into its food (E. coli strain OP50) to label cellular organelles (e.g. 9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1&#39;H-2,2&#39;-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Here, we present the use of a fluorescent pH-sensitive dye that stains intestinal lysosomes, providing a visual readout of dynamic, physiological changes in lysosomal acidity in live worms. This protocol does not measure lysosomal pH, but rather aims to establish a reliable method of assessing physiological relevant variations in lysosomal acidity. cDCFDA is a cell-permeant compound that is converted to the fluorescent fluorophore 5-(and-6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein (cDCF) upon hydrolysis by intracellular esterases. Protonation inside lysosomes traps cDCF in these organelles, where it accumulates. Due to its low pKa of 4.8, this dye has been used as a pH sensor in yeast. Here we describe the use of cDCFDA as a food supplement to assess the acidity of intestinal lysosomes in C. elegans. This technique allows for the detection of alkalinizing lysosomes in live animals, and has a broad range of experimental applications including studies on aging, autophagy, and lysosomal biogenesis.

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

A step-by-step guide to probe loss of lysosomal acidity in the intestine of C. elegans using the pH-sensitive vital dye 5(6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein diacetate (cDCFDA)

Avaliação dos lisossomos Alkalinization no intestino de viver elegans de Caenorhabditis

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases of the cell cycle, or the incorporation of nucleoside analogs. During S-phase, DNA polymerases incorporate thymidine analogs such as EdU or BrdU into chromosomal DNA, marking the cells for analysis. For C. elegans, the nucleoside analog EdU is fed to the worms during regular culture and is compatible with immunofluorescent techniques. The germline of C. elegans is a powerful model system for the studies of signaling pathways, stem cells, meiosis, and cell cycle because it is transparent, genetically facile, and meiotic prophase and cellular differentiation/gametogenesis occur in a linear assembly-like fashion. These features make EdU a great tool to study dynamic aspects of mitotically cycling cells and germline development. This protocol describes how to successfully prepare EdU bacteria, feed them to wild-type C. elegans hermaphrodites, dissect the hermaphrodite gonad, stain for EdU incorporation into DNA, stain with antibodies to detect various cell cycle and developmental markers, image the gonad and analyze the results. The protocol describes the variations in the method and analysis for the measurement of S-phase index, M-phase index, G2 duration, cell cycle duration, rate of meiotic entry, and rate of meiotic prophase progression. This method can be adapted to study the cell cycle or cell history in other tissues, stages, genetic backgrounds, and physiological conditions.

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

An imaging-based method is described that can be used to identify S-phase and analyze cell cycle dynamics in the C. elegans hermaphrodite germline using the thymidine analog EdU. This method requires no transgenes and is compatible with immunofluorescent staining.

Análise de ciclo celular no Germline de c. elegans com o EdU analógico de timidina

Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases ...

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented protocol uses this model to determine the pathogenicity caused by the mitis group streptococci via the production of H2O2. The mitis group streptococci are an emerging threat that cause many human diseases such as bacteremia, endocarditis, and orbital cellulitis. Described here is a protocol to determine the survival of these worms in response to H2O2 produced by this group of pathogens. Using the gene skn-1 encoding for an oxidative stress response transcription factor, it is shown that this model is important for identifying host genes that are essential against streptococcal infection. Furthermore, it is shown that activation of the oxidative stress response can be monitored in the presence of these pathogens using a transgenic reporter worm strain, in which SKN-1 is fused to green fluorescent protein (GFP). These assays provide the opportunity to study the oxidative stress response to H2O2 derived by a biological source as opposed to exogenously added reactive oxygen species (ROS) sources.

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is an excellent model to dissect host-pathogen interactions. Described here is a protocol to infect the worm with members of the mitis group streptococci and determine activation of the oxidative stress response against H2O2 produced by this group of organisms.