אנו מודים Microimaging מונש לתמיכה טכנית שלהם. זנים מסוימים נמסרו על ידי המרכז גנטיקה Caenorhabditis , אשר ממומן על ידי משרד NIH תוכניות תשתית מחקר (P40 OD010440). עבודה זו נתמכה על ידי מלגת גילוי וההתערבות של אוניברסיטת מונש, גרנט פרויקט NHMRC (GNT1105374), מלגת מחקר בכיר NHMRC (GNT1137645), וסקי חדשנות מלגת: 23 ערנית על רוג'ר Pocock.

1. גידול תולעת והכנה
הערה: עיין טבלה של חומרים עבור כל מוצר המידע.
<ol><li>OP50 Escherichia coli תרבות: התרבות חיידקים OP50 Lysogeny מרק בשר (ליברות) (טריפטון 1% 0.5% שמרים, 0.5% NaCl, pH 7.0) בן לילה ב 37 ° C ללא אנטיביוטיקה.</li>
	<li>זרע µL 400 של חיידקים OP50 ללוחות מדיה (NGM) צמיחה נמטודות (1.5 גר' NaCl, 8.5 גר' אגר, 1.25 גרם peptone, 1 מ"ל של CaCl 1 מ'2, 1 מ"ל של כולסטרול 5 מ"ג/מ"ל אתנול, 1 מ"ל של 1 מ' MgSO4 ו- 25 מ של 1 מ' KPO4 מאגר) אוויר יבש החיידקים במשך 48 שעות.</li>
	<li>לבחור תולעים על צלחות NGM הזריעה, דגירה 15 ° C או 20 º C.<ol>
<li>לניתוח של germline אנדרוגינוס למבוגרים, לאסוף מוזן היטב תולעים L4 לדשא חיידקי ואת דגירה בין לילה ב 20 º C.</li>
		<li>בשביל הניקוד זרע מספר אנדרוגינוסים, דגירה L4 תולעים ב 20 מעלות צלזיוס במשך 12 שעות עד התולעים מגיעים את הנשירה L4/למבוגרים בלבד. כדי לסנכרן את התולעים לבמה L4, להכין ביצים על-ידי בחירת תולעים בוגרות עם הרבה ביצים בפתרון אקונומיקה (1 M NaOH ואקונומיקה ביחס 1:1). לאפשר את הביצים בוקעות ולקחת L4 חיות בשביל הניסוי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכן שקופיות מיקרוסקופ טפלון על ידי הצבת µL 25 של פולי-L-ליזין פתרון בשקופית והפצת הפתרון, באמצעות טיפ פיפטה. לאחר הסרת העודפים פולי-L-ליזין עם מגבת נייר, לאפשר שהשקופיות אוויר יבש, דגירה השקופיות ב 65 מעלות צלזיוס למשך 15-20 דקות.</li>
</ol>2. Germline לנתיחה,6,מכתימים13
<ol><li>ספוט µL 10 של 0.01% tetramisole (הרדמה) ב- coverslip 22 מ"מ × 22 מ"מ ולבחור אחד - בן יום תולעים בוגרות לתוכו.</li>
	<li>לנתח את התולעת בזנב כמו זה הופך להיות מורדם באמצעות מזרק (5 מ"ל) ומחט (24" פרק 1"), ולוודא כי germline אינו פגום. הערה: הקרע צריך להתבצע לפני התולעת הופך משותק לחלוטין כך הלחץ השלילי התולעת ואת תנועת תולעת סיוע של הוצאה של germline. הבקיע זרע, עבור לנקוט שלא יגרמו נזק את spermatheca על ידי המחט במהלך ניתוח. להימנע מלגעת את germline עם המחט למעט הנקודה לנתיחה לאחר spermatheca. אם יש לשבור בתא germline או הפרשות germline נצפית, אמור germline לא לשמש לניתוח.</li>
	<li>מקם את coverslip הפוכה בשקופית מצופה פולי-L-ליזין, שמירה על ביתור germline בשקופית.</li>
	<li>להסיר עודפי נוזלים תחת coverslip על ידי הצבת מגדל נייר בפינה של coverslip, ולאחר מכן המקום השקופית של חנקן נוזלי עבור מינימלית 1 להסיר במהירות את coverslip באמצעות מחט עם germlines על השקופית.</li>
	<li>להעביר את השקופיות-20 ° C מתנול עבור 30-60 s בחדר ולאחר מכן תקופת דגירה של 30 דקות בתמיסה תיקון המוכנים באופן טרי (1 x פוספט buffered מלוחים (PBS) המכיל מ' 0.08 HEPES pH 6.9, 1.6 מ מ MgSO4, מ מ 0.8 אתילן גליקול-bis(beta-aminoethyl אתר)-N, N, N', N'-paraformaldehyde חומצה (EGTA) ו- 3.7% tetraacetic) בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לשטוף את השקופיות על-ידי הצבת בחדר המכיל 1 x PBS, pH 7.4 עם 0.1% Tween-20 במשך 10 דקות חזור על שלב זה פעם אחת.</li>
	<li>לחסום את germlines עם µL 30 של חסימת פתרון (30% של נסיוב עז שהוכנו על ידי הוספת µL 900 של עז נסיוב 1700 µL של מזוקקים H2O ו- 300 µL של 10 x PBS) בחדר לחים שהוכנו על ידי הנחת מגבת נייר רטובה בתוך קופסת פלסטיק בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.</li>
	<li>הוסף µL 50 של REC-8 נוגדן פתרון מוכן בנסיוב עז 30% ב- 1:300 יחס אל כל דגימה. דגירה בין לילה ב 4 º C.</li>
	<li>לשטוף את השקופיות על-ידי הצבת בחדר המכיל PBS x 1 עם 0.1% Tween-20 במשך 10 דקות חזור על השלב פעם ולהסיר עודפי נוזלים על ידי הנחת מגבת נייר בפינה של השקופית.</li>
	<li>להכין נוגדן משני פתרון על ידי דילול fluorophore ירוק (488 ננומטר פליטה אורך גל) מצומדת נוגדנים משניים (1:1000), phalloidin (אקטין הכתם, בקני) ודאפי (DNA הכתם, בקני) 30% עז נורמלית בסרום.</li>
	<li>הוסף µL 50 של נוגדנים משניים פתרון לשקופית.</li>
	<li>תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לשטוף את השקופיות פעמיים על-ידי הצבת בחדר המכיל PBS x 1 עם 0.1% Tween-20 במשך 10 דקות תנגבי עודף נוזלים.</li>
	<li>להוסיף 30 µL של תיקון ריאגנט אותן לשקופית במקום 12 מ מ2 x 1.5 מיקרומטר coverslip על העליונה, לייבש את השקופיות ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
</ol>3. מיקרוסקופיה קונפוקלית
<ol><li>הפעל את מיקרוסקופ קונפוקלי, לייזרים, סורק תהודה ותוכנות מיקרוסקופ קונפוקלי. במקום את השקופיות עם germlines מוכתם על המחזיק שקופית מעל המטרה X 63.</li>
	<li>לאתר של germline, להתמקד בחלק העליון germline ולסמן אותו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי תוכנה. באופן דומה להתמקד בתחתית germline ולסמן אותו כדי לקבוע את עובי germline הכולל.</li>
	<li>תמונה germline כולו על-ידי הגדרת עובי כל פרוסה עד 0.5 מיקרומטר. לסמן את רכישת germline ולהתחיל להשלים. לסרוק כל פרוסה 8 פעמים, ממוצע של הערכים לשיפור איכות התמונה. בסורק התהודה יאפשר סריקה מהירה כדי למנוע הלבנת במהלך דימות. אם לא קיים המיקרוסקופ סורק תהודה, להפחית את מספר סריקות עד ארבע כדי למנוע הלבנת.</li>
</ol>4. post Imaging ניתוח של גרעינים מספר והפצה
הערה: עיין משלים איור 1 לקבלת צילומי מסך של כלי תוכנה, לחצני המשמשים.
<ol><li>ייבאו את התמונה Imaris 8.4.1 או גירסאות מאוחרות יותר של התוכנה.</li>
	<li>הגדרת אזור mitotic אזור המעבר, באזור meiotic, אזור oocyte, spermatheca של germline על-ידי זיהוי המורפולוגיה גרעיני בכל אזור.</li>
	<li>השתמש בלחצן פונקציה פני השטח (איור משלים 1A) של התוכנה כדי לבחור את האזור של ריבית.</li>
	<li>לבטל את אשף יצירת משטח אוטומטי וצייר ידנית האזור של ריבית על הפרוסה הראשונה והאחרונה של התמונה מתוך ערימה תלת מימדי.</li>
	<li>לחץ על משטח יצירה. הערה: התוכנה באופן אוטומטי יפתחו את המחסן בין הראשונים והאחרונים מחסנית.</li>
	<li>להסוות כל הערוצים למעט דאפי על-ידי לחיצה על לחצן מסכת ערוץ (איור משלים 1B-C).</li>
	<li>להגדיר פרמטרים גודל הגרעין באמצעות לחצן function ספוט (איור משלים 1A). עבור האזור mitotic, הגדרה של XY בקוטר של 2 מיקרומטר תוך השארת קוטר Z מוגדר. עבור אזור המעבר, להגדיר XY בקוטר של 2 מיקרומטר, קוטר Z כמו 1.5 מיקרומטר. (1D איור משלים). הערה: פתרון בעיות על הקוטר בהתאם רמת ההגדלה ואת המפרט של המיקרוסקופ. עבור פרוטוקול הנוכחי, המטרה בשימוש היה בן 63 X וסיפק נוסף ההגדלה 1.70 פעמים במהלך דימות. אם המטרה משתנה, למשל 40 X, הקוטר צריך להשתנות בהתאם. פתרון בעיות צריכה להתבצע עם wildtype germlines להקים הפרמטרים הנכונים. האזור mitotic של זרוע germline פראי סוג יש כ 250 גרעינים. הקוטר צריך לשנות כדי להשיג ערך זה. השתמש germlines לפחות 15 כדי לקבוע את ערך אופטימלי עבור הקוטר. בגישה דומה אמור לשמש לכיול אזור המעבר (150-170 גרעינים) ואזור meiotic (600-700 גרעינים).</li>
	<li>להגביל את הגילוי של כתמים על-ידי הגדרת את הסף המינימלי (איור משלים 1E). שימוש דאפי מוכתם פראי סוג germlines להקים את הסף המינימלי על ידי הגדלת את הסף המינימלי עיבוד תלת מימדי עד המקום הראשון מופיע מחוץ germline.</li>
	<li>לשמור את התמונה, לקבל את מספר גרעינים מטבלת שנוצר באופן אוטומטי על ידי התוכנה. ייצוא התמונות כמו קבצים TIF.</li>
</ol>5. post Imaging ניתוח הבקיע הזרע ואת מספר כרומוזום
<ol><li>לבצע עיבוד תלת-ממדית על-ידי בחירה spermatheca את אזור בעל עניין. כדי לזהות כל זרע, להגדיר את קוטר הנקודה בין 0.75 - מיקרומטר 1.0 עבור X ו- Y-ציר, בעוד קוטר Z נשאר לא מוגדר. השתמש בלחצן פונקציה כתמים כמוצג באיור1 משלים.</li>
	<li>להחסיר את הרקע על ידי מתקתק רקע לחסר תיבת ושימוש רקע תיקון ערכים המחושבים על-ידי התוכנה (1D איור משלים). הערה: התוכנה Imaris בוחר נקודות בעוצמה גבוהה קודם, לכן השפעת הרקע הוא מינימלי כל עוד אין הבדל משמעותי בין האזור עניין ואת הרקע. השיטה השנייה היא כדי להגדיר באופן ידני את התיקון רקע, במידת הצורך ערכים שניתן לתת את הרקע. תיקון ידני הרקע יהיה הולם אם האינטנסיביות של דגימות עצמאי צריך השוואה.</li>
	<li>התאם את הסף עיבוד תלת מימדי לזהות כל זרע דאפי צבעונית spermatheca (איור משלים 1E).</li>
	<li>לספירת כרומוזום, להגדיר את קוטר הנקודה < מיקרומטר 0.75 עבור X ו- Y-ציר לפני פיתוח מודלים תלת מימדיים.</li>
	<li>שמור את התמונה וייצא כקובץ TIF.</li>
</ol>6. post Imaging ניתוח עבור שחזור Cytoskeletal של Germline
<ol><li>לזהות את האזור עניין ב germline, להסוות כל הערוצים למעט phalloidin על-ידי לחיצה על לחצן מסיכה ערוצים .</li>
	<li>הגדרת יחידת השטח של 0.25 מיקרומטר באמצעות לחצן פונקציה פני השטח (איור 1 משלים). הערה: פירוש כל מיקרומטר 0.25 יעובד לתוך מודלים תלת מימדיים. פרטי המשטח יכול להיות קבועה עבור כל אזור germline שבו ייווצר מודל פני שטח תלת-ממדי עבור כל מיקרומטר 0.25. עם זאת, עבור האזור oocyte, פרטי המשטח ניתן להגדיל עד 0.35 - 0.5 מיקרומטר בשל הנוכחות של סיבי אקטין מוגדרים היטב באזור זה.</li>
	<li>להחסיר את הרקע על ידי מתקתק רקע לחסר תיבת ושימוש רקע תיקון ערכים המחושבים על-ידי התוכנה (1D איור משלים).</li>
	<li>להתאים את הסף עיבוד תלת מימדיים בהתאם למבנה הדורשים ניתוח (איור משלים 1E).</li>
	<li>שמור את תמונת תלת מימדי מפותחת וייצא כקובץ TIF.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hubbard, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+germ+line:+a+model+for+stem+cell+biology.">Caenorhabditis elegans germ line: a model for stem cell biology.</a> Dev Dyn. 236 (12), 3343-3357 (2007).</li><li>Joshi, P. M., Riddle, M. R., Djabrayan, N. J., Rothman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+model+for+stem+cell+biology.">Caenorhabditis elegans as a model for stem cell biology.</a> Dev Dyn. 239 (5), 1539-1554 (2010).</li><li>Kershner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+stem+cells+and+their+regulation+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Germline stem cells and their regulation in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Adv Exp Med Biol. 786, 29-46 (2013).</li><li>Byrd, D. T., Knobel, K., Affeldt, K., Crittenden, S. L., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DTC+niche+plexus+surrounds+the+germline+stem+cell+pool+in+Caenorhabditis+elegans.">A DTC niche plexus surrounds the germline stem cell pool in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 9 (2), 88372 (2014).</li><li>Kimble, J., Crittenden, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controls+of+germline+stem+cells,+entry+into+meiosis,+and+the+sperm/oocyte+decision+in+Caenorhabditis+elegans.">Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the sperm/oocyte decision in Caenorhabditis elegans.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 405-433 (2007).</li><li>Hansen, D., Hubbard, E. J., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-pathway+control+of+the+proliferation+versus+meiotic+development+decision+in+the+Caenorhabditis+elegans+germline.">Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline.</a> Dev Biol. 268 (2), 342-357 (2004).</li><li>Crittenden, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+RNA-binding+protein+controls+germline+stem+cells+in+Caenorhabditis+elegans.">A conserved RNA-binding protein controls germline stem cells in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 417 (6889), 660-663 (2002).</li><li>Eckmann, C. R., Crittenden, S. L., Suh, N., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLD-3+and+control+of+the+mitosis/meiosis+decision+in+the+germline+of+Caenorhabditis+elegans.">GLD-3 and control of the mitosis/meiosis decision in the germline of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 168 (1), 147-160 (2004).</li><li>Schumacher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+repression+of+C.+elegans+p53+by+GLD-1+regulates+DNA+damage-induced+apoptosis.">Translational repression of C. elegans p53 by GLD-1 regulates DNA damage-induced apoptosis.</a> Cell. 120 (3), 357-368 (2005).</li><li>McMullen, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macro-level+modeling+of+the+response+of+C.+elegans+reproduction+to+chronic+heat+stress.">Macro-level modeling of the response of C. elegans reproduction to chronic heat stress.</a> PLoS Comput Biol. 8 (1), 1002338 (2012).</li><li>Hubbard, E. J., Korta, D. Z., Dalfo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+control+of+germline+development.">Physiological control of germline development.</a> Adv Exp Med Biol. 757, 101-131 (2013).</li><li>Wolke, U., Jezuit, E. A., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-dependent+cytoplasmic+streaming+in+C.+elegans+oogenesis.">Actin-dependent cytoplasmic streaming in C. elegans oogenesis.</a> Development. 134 (12), 2227-2236 (2007).</li><li>Jones, A. R., Francis, R., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLD-1,+a+cytoplasmic+protein+essential+for+oocyte+differentiation,+shows+stage-+and+sex-specific+expression+during+Caenorhabditis+elegans+germline+development.">GLD-1, a cytoplasmic protein essential for oocyte differentiation, shows stage- and sex-specific expression during Caenorhabditis elegans germline development.</a> Dev Biol. 180 (1), 165-183 (1996).</li><li>Hasegawa, E., Karashima, T., Sumiyoshi, E., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+CPB-3+interacts+with+DAZ-1+and+functions+in+multiple+steps+of+germline+development.">C. elegans CPB-3 interacts with DAZ-1 and functions in multiple steps of germline development.</a> Dev Biol. 295 (2), 689-699 (2006).</li><li>Austin, J., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=glp-1+is+required+in+the+germ+line+for+regulation+of+the+decision+between+mitosis+and+meiosis+in+C.+elegans.">glp-1 is required in the germ line for regulation of the decision between mitosis and meiosis in C. elegans.</a> Cell. 51 (4), 589-599 (1987).</li><li>Berry, L. W., Westlund, B., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ-line+tumor+formation+caused+by+activation+of+glp-1,+a+Caenorhabditis+elegans+member+of+the+Notch+family+of+receptors.">Germ-line tumor formation caused by activation of glp-1, a Caenorhabditis elegans member of the Notch family of receptors.</a> Development. 124 (4), 925-936 (1997).</li><li>Fox, P. M., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Germline+Stem+Cell+Differentiation+Following+Loss+of+GLP-1+Notch+Activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201 (1), 167-184 (2015).</li><li>Pasierbek, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Caenorhabditis+elegans+cohesion+protein+with+functions+in+meiotic+chromosome+pairing+and+disjunction.">A Caenorhabditis elegans cohesion protein with functions in meiotic chromosome pairing and disjunction.</a> Genes and Development. 15 (11), 1349-1360 (2001).</li><li>Klass, M., Wolf, N., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+male+reproductive+system+and+sexual+transformation+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Development of the male reproductive system and sexual transformation in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 52 (1), 1-18 (1976).</li><li>Korta, D. Z., Tuck, S., Hubbard, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S6K+links+cell+fate,+cell+cycle+and+nutrient+response+in+C.+elegans+germline+stem/progenitor+cells.">S6K links cell fate, cell cycle and nutrient response in C. elegans germline stem/progenitor cells.</a> Development. 139 (5), 859-870 (2012).</li><li>Laband, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+segregation+occurs+by+microtubule+pushing+in+oocytes.">Chromosome segregation occurs by microtubule pushing in oocytes.</a> Nat Commun. 8 (1), 1499 (2017).</li></ol>

המחברים מצהירים ללא ניגוד אינטרסים.

המטרה של פרוטוקול זה נועד לשפר את הדיוק ולצמצם את משך הזמן הנדרש לצורך ניתוח germline. לאחר הכנת תקן germlines גזור, מודל תלת מימדי של גרעינים germline מוכן על ידי עיבוד חישובית. תוך מתן אפשרות התבוננות germline הפצה גרעינים בחלל, עיבוד תלת מימדי מחשבת את מספר גרעינים על אזורים ספציפיים של germline. היבט קריטי של השיטה שלנו היא הגדרה מדויקת של הפרמטרים הגודל והצורה של גרעין האטום. זה תלוי על בהירות של צביעת ואת ההגדלה המשמש את התמונה. נוכל לאשר את הדיוק של שיטת השוואת לאור נתונים מנותח באופן ידני1. לאשר עוד יותר את הדיוק של השיטה שלנו, אנו נעשה שימוש מוטציות מרובות בתנאים שונים, אישר את התוצאות עם ספרות שפורסמה. הוא גם אישר את היכולת של השיטה לזהות פנוטיפים עדין וחזק - משטרת שיקאגו-3 ו- glp-1 מוטציות, בהתאמה. בנוסף, שיטה זו מראה הסתגלות לשינויים גרעינים בגודל וצורה בתוך את germline או אפילו בין זנים. מאפיין זה מאפשר גם את הזיהוי והניקוד של מבנים קטנים יותר germline כגון כרומוזומים, זרע. השיטה מאפשרת גם להמשך פתרון בעיות עבור פרמטרים של גודל וצורה, אם נדרש. הניתוח שלנו הצליח להבהיר את ההפצה של גרעינים ב germline והראה את זה גרעינים ב mitotic אזורים pachytene הינם מאורגנים בתבניות שונות. על-ידי החלת עיבוד תלת-REC-8 ו דאפי מכתים, הראנו גם את ההתפלגות של REC-8 בתוך הגרעינים של האזור mitotic.
עיבוד תלת מימדי של אקטין מכתים איפשרה בדיקה מקיפה של מבני germline cytoskeletal. Germline נראה שני מבנים נפרדים אקטין, אבל הם שומרים על מגע פיזי. בעוד מחדש של שלד התא עבור germline כולו אפשרית כישות אחת, התוצאות הטובות ביותר ניתן להשיג אם האזורים של עניין הם בחר לתוך mitotic, מעבר מיגדרי, ואזורים meiotic. שלד התא germline דיסטלי יש צורה לא מוגדרת, מתפתח לתוך מבנה filamentous בסוף הפרוקסימלית. פרוטוקול שלנו ולכן מאפשר שחזור תלת מימדי של שלד התא אקטין germline על-ידי הגדרת פרמטרים ספציפיים כדי להתאים את הערכות להבדלים בחלוקה אקטין. הפן הקריטי ביותר של הניתוח זו ההגדרה פרמטרים כגון גודל הגרעינים ודרישת פרטי המשטח. הפחתת גודל הגרעינים מתחת הגודל הממשי יסכנו את התוכנה כדי לאסוף נקודות האור בתוך האטומים כאובייקטים נפרדים. באופן דומה, ערכים פרטים משטח גבוה יוביל ההפסד של מבנים תלת מימדי מדויק. השיטה המוצעת מסתמך על הדיוק של דיסקציה ואת איכות ההכתמה germline. Germline פגום עלול להוביל שחרורו של גרעינים מ germline, גורם מספור לא מדויק. רקע של ההכתמה יגרום גם את הגרעינים לא מדויק הספירה של עיבוד תלת מימדי פסולים.
השיטה שלנו מרחיב ידועים בשיטות אוטומטיות של ניתוח germline שבו אנו מסוגלים לנתח את מספר גרעינים ואת ההפצה/ביטוי של חלבונים germline בחלל עם פרוטוקול אחד20. שנית, שיטת שלנו מאפשרת בדיקה נוספת של מבנים קטנים יותר כגון כרומוזומים בתוך germline. סגרגציה כרומוזום היא היבט חשוב של פיתוח oocyte21. באמצעות השיטה שלנו, זה אפשרי לזהות את המספר ואת המיקום של כרומוזומים שבו המרחק יכולה להיות מוגדרת על ידי כיול נגד פראי סוג oocytes. כל מוטציה המשפיעים על ההפרדה כרומוזום שניתן ללמוד באמצעות כלי זה. בנוסף, ניתן להאריך את שיטת ללמוד הכרומוזומים העוברים בשלב 2-תא. הניתוח חישובית מספק גם המספר של זרע ב- spermatheca, מספר הכרומוזומים, oocyte ו germline cytoskeletal מבנים. יחדיו, השיטה מספקת ניתוח מקיף של germline C. elegans באמצעות נוהל בודדת תוך הפחתת זמן ניתוח במידה ניכרת. השיטה מבטלת את הדרישה של כלים מרובים עבור כל ניתוח (מספר גרעינים, חלבון הפצה ומבנה cytoskeletal) ומסירה את הזמן קידוד הנדרש של כל תוכנה ספציפית. לבסוף, בשיטה זו ניתן להרחיב באופן יעיל ללימודים תולעת השני כולל ניתוח תלת-ממדי של תולעים חיות מסומם.

שימור איתות המסלולים עם יונקים גורם C. elegans מודל מצויין ללמוד תהליכים ביולוגיים מספר1,2. במעבדה שלנו, אנו משתמשים germline C. elegans ללמוד תאי גזע, אפופטוזיס ופיתוח גנים. בעוד germline מבנה תלת מימדי, מחקרים רבים הם שניים בשל אופיו מהגידולים ועתירת של ניתוח תלת-ממדי. זה סביר מאוד כי ניתוח דו מימדי עלול לסלף ויוו אירועים ב germline. ההרמפרודיט למבוגרים C. elegans יש שתי זרועות germline, שכל אחד מהם בתים תא עצה דיסטלי סומאטית (DTC) המתחזק בתאי הנבט דיסטלי מצב וייעודים3,4. אלה בתאי הנבט מתחילים להבחין כאשר הם עוברים מן ה-DTC, בריחה השפעתה, ולהיות oocytes, זרע כפי שהם מגיעים לסוף הפרוקסימלית של germline. במהלך תהליך זה, גרעינים תא הנבט עוברים מיטוזה, לפני המעבר מיוזה5,6. ייצור הזרע מתבצעת באמצעות והעשים 4 (L4) של ההתפתחות, אחרי אשר oocytes מיוצרים במהלך הבגרות. הזרע נשמרות בתיקיה spermatheca שבו הם לדשן את oocytes כדי להפיק עוברי.
ישנם מספר גורמים גנטיים וסביבתיים יכולים להשפיע על התפתחות germline ב- C. elegans וכתוצאה מכך שינויים מספר גרעינים, מספר אירועים אפופטוטיים להיפגע, דינמיקה כרומוזום, ביטוי חלבונים ו/או לוקליזציה7 ,8,9,10,11. הניתוח של אירועים אלה דורש הזיהוי בכל שלב של בידול בהתבסס על מורפולוגיה גרעיני והפצה. לנתח במדויק את הפרמטרים הללו באופן ידני עם גודל מדגם גדולים הוא מהגידולים ולגזול. כדי לעקוף את החסרונות האלה ולאפשר את העקביות של ניתוח, פיתחנו שיטה אוטומטית בחינת תלת מימדי C. elegans germline לספור גרעינים, גרעינים הפצה, ביטוי חלבונים, ו cytoskeletal מבנה. על ידי שילוב מיקרוסקופיה קונפוקלית עם עיבוד תלת מימדי, יצרנו פרמטרים הגודל והצורה לצורך הזיהוי בכל שלב של בידול תא הנבט. יתרה מזאת, שיטה זו מאפשרת ספירת גרעיני תא נבט, זרע בתוספת ניקוד של כרומוזום מספר ב כל oocyte.
מבנה מכריע אחד ב germline הוא שלד התא, אשר מספק יציבות germline תא, איידס cytoplasmic streaming, הגנה germline הגרעינים12. באמצעות עיבוד חישובית, עלינו לבצע שחזור תלת מימדי של שלד התא germline, זיהה תכונות cytoskeletal שונות בתוך germline. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול צעד אחר צעד כדי להמחיש כיצד חישובית ניתוח בשילוב עם קונאפוקלית הדמיה מאפשר ניתוח מקיף של germline C. elegans .
אנו מציעים שיטה מהירה עבור ניתוח תלת-ממדי של C. elegans germline (איור 1). באמצעות ניתוח תלת-ממדי, זה אפשרי ללמוד תלת מימדי התפלגות אוטומטית germline גרעינים (איור 2 , איור 3), ספירת תאים (איור 2), שחזור של שלד התא germline ( איור 3), הפצה של חלבונים (איור 4), וניקוד מספר הזרע אצל spermatheca הכרומוזומים oocytes (איור 5). השיטה לא רק מאפשר כימות קל ומדויק germline אלא מזהה פנוטיפים רלוונטי מבחינה פיזיולוגית.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:933px;" width="934">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">C. elegans strains: wild type (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III&#160;</td>
			<td style="width:264px;">Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OP50 Escherichia coli bacteria</td>
			<td style="width:264px;">Homemade</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nematode Growth Media (NGM) plates</td>
			<td style="width:264px;">Homemade</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">polyclonal rabbit anti-REC-8&#160;</td>
			<td>SDIX</td>
			<td>29470002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa 488 conjugated antibody raised in goat</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A-21236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytoskeletal dye phalloidin&#160;</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:168px;">A-12380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI&#160;</td>
			<td>Thermofisher Scientific&#160;</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-L-lysine&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetramisol&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgSO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:168px;">M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1M HEPES buffer, pH 7.4&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:168px;">G0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10X PBS pH 7.4&#160;</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">37% Paraformaldehyde solution</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1040031000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal goat serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluoroshield fixing reagent&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F6182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol&#160;</td>
			<td>Millipore&#160;</td>
			<td>1009832511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20&#176;C &#38; 25&#176;CIncubator&#160;</td>
			<td>Any brand</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Light microscope</td>
			<td style="width:264px;">Any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope&#160;&#160;</td>
			<td style="width:264px;">Any brand (Leica, Zeiss)</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Computer equipped with Imaris suit 8.4.1 or later version, full licence to use the software and Matlab software.</td>
			<td style="width:264px;">Bitplane</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Phospho buffered saline, pH 7.4</td>
			<td style="width:264px;">Homemade</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Teflon microscope slides&#160;</td>
			<td style="width:264px;">Tekdon&#160;</td>
			<td style="width:168px;">&#160;941-322-8288</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

computational analysis of the caenorhabditis elegans germline to study the distribution of nuclei, proteins, and the cytoskeleton

Germline Caenorhabditis elegans (C. elegans) משמש כדי ללמוד מספר תהליכי ביולוגית חשובה כולל תאי גזע, אפופטוזיס ופיתוח כרומוזום דינמיקה. בעוד germline מודל מעולה, הניתוח הוא לעתים קרובות שני עקב זמן העבודה הנדרש לצורך ניתוח תלת-ממדי. המפרט הגדולות במחקרים כאלה הם המיקום/המספר של גרעינים והפצה חלבון בתוך germline. כאן, אנו מציגים שיטה לבצע ניתוח אוטומטיות של germline באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית וגישות חישובית כדי לקבוע את המספר והמיקום של גרעינים בכל אזור של germline... השיטה שלנו מנתחת גם הפצה חלבון germline המאפשרת בחינה תלת מימדי של חלבון ביטוי מרקע גנטי. יתר על כן, המחקר שלנו מראה וריאציות באדריכלות cytoskeletal באזורים שונים של germline עשוי להכיל דרישות ספציפיות מרחבי התפתחותית. לבסוף, השיטה שלנו מאפשר אוטומטיות ספירת הזרע ב spermatheca של כל germline. יחדיו, השיטה שלנו מאפשר ניתוח פנוטיפי מהיר ולא לשחזור germline C. elegans .

איור 1 מציין את משך הזמן הנדרש לצורך ניתוח germline תלת מימדי. אנדרוגינוסים L4 מודגרות ב- 20 ° C היו גזור כדי לבודד germlines, צבעונית עם דאפי, phalloidin נוגדנים נגד germline חלבונים. Germlines הם עם תמונה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. מיקרוסקופ מוכתמים, קונאפוקלית דורש כ 24 ה ניתוח חישובית עבור germline שלם דורש 10-15 דקות כדי לספור את מספר והמיקום של גרעינים, לזהות את התפלגות חלבון, לנתח את המבנה cytoskeletal ואת הציון מספר של זרע. ניתוח ידני מלא דורש מעל 2 h לכל germline ונתון מפעיל השפעה, ולכן השיטה האוטומטית שלנו תפוקה גבוהה מקצרת את זמן הניתוח, משפר את הפארמצבטית.
אוטומטי גרעינים הבקיע מגלה כי זרוע germline בתים כ 1,000-1,200 גרעינים (איור 2C), המתאימים היטב עם המדריך שפורסמו בעבר הבקיע נתונים1. כדי לאשר שאת הדיוק של הניקוד, מספר מוטציות ותנאים שונים הם משתמשים (איור 2D-G). למשל, אנחנו לעומת rnp-8(tm435), cpb-3(bt17)ותולעים glp-1(e2141) מוטנטים בעלי חיים פראי סוג. סופר אוטומטיות לשכפל צמצום ידוע מספר גרעינים משטרת שיקאגו-3 ו- glp-1 מוטציה germlines14,15,16,17. ירידה חמורה במספר גרעינים נצפתה גם ב glp-1(e2141) הרגיש החשבונאי כאשר מודגרות ב 25 º C. חלוקת הגרעינים תלויה השלב של בידול. האזור mitotic, המכיל כ 250 גרעינים בסוג הפרוע, הוא צמוד גדושות עם גרעינים בהשוואה לשאר germline (איור 3)1. המרווח בין הגרעינים mitotic הוא מינימאלי, הגרעינים ממוקמים בכל רחבי האזור mitotic. עם זאת, כמו הגרעינים תעבור הדיסטלי, הם מופיעים יותר ויותר אל עבר היקף germline (איור 3). השינוי בחלוקת מתחיל באיזור המעבר ומשלימה הגרעינים הזנת המיוזה/pachytene.
Germline יש מבנים cytoskeletal ספציפיים בשלבים שונים של בידול. אנו דמיינו F-אקטין ידי מכתימה את germline עם phalloidin. התפלגות F-אקטין מ דיסטלי proximal סוף germline שהיה נפרד בכל אזור (איור 3 ואיור 5). באופן כללי, ישנם שני מבנים נפרדים אשר מופיעות בתור 'גליל בתוך גליל'. -האזור mitotic, אקטין הפנימי נראה כמו גוש מוצק בצורת ספציפי (איור 3). Germline מגיע לאזור המעבר, אקטין הפנימי ההנחה היא מבנה גלילי יותר, היא תהפוך לגליל חלול כפי שהוא מגיע מאוחר pachytene. השכבה השנייה של אקטין מכסה השכבה הפנימית נותנת צורה germline. מבנה אקטין זה 'גליל בתוך גליל' נעלם לכיוון האזור oocyte (איור 5). -האזור oocyte, מופיע אקטין סיבי עבה. Oocytes מופרדים באמצעות rachis אקטין, למרות שהוא נראה דינמי כדי לאפשר את התנועה של oocytes כדי spermatheca. לבסוף, אקטין ב spermatheca גם צורות צרורות עבה של סיבי אקטין. עם זאת, סיבי מופיעים ארוז קרוב יותר מאשר באזור oocyte. המבנה cytoskeletal מופיעה כדי להשלים את דפוסי ההפצה של גרעינים (איור 3). האזור mitotic, הגרעינים מופיעים שימוקמו סביב המבנה הפנימי אקטין. כשהם מגיעים המיוזה/pachytene, הגרעינים לארגן בין שני הגלילים אקטין עוזב באמצע germline בעיקר ללא גרעינים (איור 3). זה כנראה יכול לסייע ללא הפרעה cytoplasmic streaming ב germline. Germlines היו מוכתמים נוגדן כנגד חלבון REC-8, נותחו על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. REC-8 homogeneously מופץ סביב הגרעינים הראשונים של germline מאוחר יותר ביקע ויש השפיל במהלך המיוזה18. התפלגות REC-8 בניתוח חתך תלת-ממדי germline מציג את ההתפלגות של חלבון באזור mitotic (איור 4).
עיבוד תלת מימדי של סוף הפרוקסימלית germline כוללת את spermatheca דיסטלי כדי spermatheca שלושת oocytes. הניתוח שלנו זיהה ממוצע של 151 הזרע אצל כל spermatheca (n = 18). זה מקביל שפורסמו בספרות, המציין את המהימנות של השיטה (איור 5F)19. ניתן לבצע ניתוח זה יחד עם cytoskeletal או חלבון הפצה לימודים. הגנום C. elegans מופץ בין כרומוזום 6. Oocytes מפותחת פראי סוג, כרומוזומים אלה גלויים, ניתן לספור. ההפרדה הזאת כרומוזום ניתן ללמוד יציבות כרומוזום או פגמים אחרים הקשורים oocyte פיתוח. על-ידי עיבוד תלת-ממדי, ניתן לאבחן את מספר הכרומוזומים, אם הכרומוזומים מופרדים כראוי, לקבל את המספר יכול להיות במדויק (איור 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57702/57702fig1.jpg"> איור 1 . ציר זמן עבור ניתוח אוטומטיות. זמן השוואה בין ניתוח ידנית וחישובית של germline C. elegans . <a href="/files/ftp_upload/57702/57702fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57702/57702fig2.jpg"> איור 2 . הפצת גרעינים ב germline. (א) דאפי מוכתם germline מציג mitotic, המעבר ואזורי pachytene/meiotic. (ב) חישובית מודל תלת מימדי של germline. (ג) רישום נקודות עבור המספר הכולל של גרעינים ב פראי סוג germlines. (D-F) הניקוד עבור מספר גרעינים ב mitotic, המעבר, ואזורי meiotic germlines מוטציה פראי סוג rnp-8, משטרת שיקאגו-3, glp-1 . (ז) השוואה במספר הכולל של גרעינים ב החשבונאי glp-1 ב- 20 ° C ו- 25 º C. קו שגיאה מייצג שגיאה סטנדרטית. המבחן של התלמיד. n < 0.0001, * * *n < 0.001, * *n < 0.01, *n < 0.05. <a href="/files/ftp_upload/57702/57702fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57702/57702fig3.jpg"> איור 3 . מבנה cytoskeletal germline. (A-B) ארגון של שלד התא הפנימי אקטין (אדום) של germline על האזור mitotic. אקטין הפנימית יש מבנה ' מאטום לשקוף ' לעומת אקטין החיצוני-האזור mitotic. (C-D) -האזור pachytene, שלד התא ההנחה היא מבנה גלילי על ידי יצירת שני צילינדרים שביניהן מאורגנים הגרעינים (כחול). (E-F) ארגון של גרעינים germline באזורים mitotic ו- pachytene. חלוקת גרעין האטום הוא יותר לכיוון ההיקף של 'germtube' על האזור pachytene בהשוואה לאזור mitotic (ירוק) ולהיות אמצע germline ללא גרעינים. <a href="/files/ftp_upload/57702/57702fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57702/57702fig4.jpg"> איור 4 . REC-8 ביטוי באזור mitotic. (א) מציג בקצה הדיסטלי של germline REC-8-צבעונית micrograph. (בג) עיבוד תלת מימדי של REC-8 מכתים (ראה בכחול) והפצה של חלבון בין האטומים mitotic (ירוק). צביעת REC-8 הוא שופע פחות קרובים לאזור mitotic (מסומן על-ידי נקודות לבנות המייצג את הגרעינים). <a href="/files/ftp_upload/57702/57702fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57702/57702fig5.jpg"> איור 5 . מבנה Germline בסוף מקורב. (א) דאפי כתמים germline בסוף הפרוקסימלית. (ב) עיבוד תלת ממדי של דאפי מכתים מראה זרע ב- spermatheca (צהוב) ו הכרומוזומים oocytes (לבן). (ג-ה) המבנה התלת-ממדי cytoskeletal בסוף germline הפרוקסימלית. האדום מציין את סיום proximal מלאה וסימון ירוק את spermatheca. ניתוח חתך צלב עולה כי שלד התא לא רק יוצרת מבנה filamentous של אקטין סביב oocytes, אך גם מפריד בין oocytes. (ו) גרף המציג את המספר של זרע כל spermatheca ואת הממוצע המתקבל spermatheca מרובים (n = 18). קו שגיאה מייצג שגיאה סטנדרטית. <a href="/files/ftp_upload/57702/57702fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/57702/57702supfig1.jpg"> משלים איור 1 . תיאור כלי תוכנה. (א) מקומות וכלים משטח לגילוי גרעינים, חלבון מכתים. (בג) בחירת אזור תלת מימדי עניין באמצעות הכלי משטח. (ד) הגדרת XY-הקוטר, בכלי של כתמים, לגילוי גרעינים. תלוי באזור של עניין מכתים, ניתן להשתמש התיקון קוטר ורקע ציר z. (ה) מינימום וזיהוי הסף העוצמה המקסימלית. בגישה דומה יכול לשמש עבור הפונקציה השטח שבו במקום להגדיר את הקוטר, ניתן להגדיר את פרטי המשטח. <a href="/files/ftp_upload/57702/57702supfig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton at JoVE.com

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

ניתוח חישובית של Germline Caenorhabditis elegans ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא

אנו מציגים שיטה אוטומטית עבור שחזור תלת מימדי של Caenorhabditis elegans germline. השיטה שלנו קובעת את המספר והמיקום של כל גרעין בתוך germline ו ניתוחים germline חלבון הפצה, מבנה cytoskeletal.

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

computational-analysis-caenorhabditis-elegans-germline-to-study

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

6.2K Views.  Monash University. אנו מציגים שיטה אוטומטית עבור שחזור תלת מימדי של Caenorhabditis elegans germline. השיטה שלנו קובעת את המספר והמיקום של כל גרעין בתוך germline ו ניתוחים germline חלבון הפצה, מבנה cytoskeletal.

Video: Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the field of environmental health. This is due in part to the paucity of model systems that can (1) accurately recapitulate keys features of reproductive processes and (2) do so in a medium- to high-throughput fashion, without the need for a high number of vertebrate animals.
We describe here an assay in the nematode C. elegans that allows the rapid identification of germline toxicants by monitoring the induction of aneuploid embryos. By making use of a GFP reporter line, errors in chromosome segregation resulting from germline disruption are easily visualized and quantified by automated fluorescence microscopy. Thus the screening of a particular set of compounds for its toxicity can be performed in a 96- to 384-well plate format in a matter of days. Secondary analysis of positive hits can be performed to determine whether the chromosome abnormalities originated from meiotic disruption or from early embryonic chromosome segregation errors. Altogether, this assay represents a fast first-pass strategy for the rapid assessment of germline dysfunction following chemical exposure.

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

הערכה מקיפה של תאי מין כימי רעילות שימוש נמטודות<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

באמצעות ניתוח של Confocal<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; לחקירת מאפננים של עירובים מורפוגן Wnt וששש

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple cellular and developmental processes principally via activation of ERK, the terminal kinase of the pathway. Tight regulation of ERK activity is essential for normal development and homeostasis; overly active ERK results in excessive cellular proliferation, while underactive ERK causes cell death. C. elegans is a powerful model system that has helped characterize the function and regulation of RTK-RAS-ERK signaling pathway during development. In particular, the RTK-RAS-ERK pathway is essential for C. elegans germline development, which is the focus of this method. Using antibodies specific to the active, diphosphorylated form of ERK (dpERK), the stereotypical localization pattern can be visualized within the germline. Because this pattern is both spatially and temporally controlled, the ability to reproducibly assay dpERK is useful to identify regulators of the pathway that affect dpERK signal duration and amplitude and thus germline development. Here we demonstrate how to successfully dissect, stain, and image dpERK within the C. elegans gonad. This method can be adapted for spatial localization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided an antibody compatible with immunofluorescence is available.

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

We present an immunofluorescence&#160;imaging-based method for spatial and temporal localization of active ERK in the dissected C. elegans gonad. The protocol described here can be adapted for visualization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided a suitable antibody reagent is available.

ניתוח במרחב ובזמן של ERK פעיל<em&gt; C. elegans</em&gt; germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein are molecular motors that regulate anterograde and retrograde transport, respectively. These motors use microtubule networks as rails. Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful model organism to study axonal transport and IFT in vivo. Here, I describe a protocol to observe axonal transport and IFT in living C. elegans. Transported cargo can be visualized by tagging cargo proteins using fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP). C. elegans is transparent and GFP-tagged cargo proteins can be expressed in specific cells under cell-specific promoters. Living worms can be fixed by microbeads on 10% agarose gel without killing or anesthetizing the worms. Under these conditions, cargo movement can be directly observed in the axons and cilia of living C. elegans without dissection. This method can be applied to the observation of any cargo molecule in any cells by modifying the target proteins and/or the cells they are expressed in. Most basic proteins such as molecular motors and adaptor proteins that are involved in axonal transport and IFT are conserved in C. elegans. Compared to other model organisms, mutants can be obtained and maintained more easily in C. elegans. Combining this method with various C. elegans mutants can clarify the molecular mechanisms of axonal transport and IFT.

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a good model to study axonal and intracellular transport. Here, I describe a protocol for in vivo recording and analysis of axonal and intraflagellar transport in C. elegans.

קיבעון של Caenorhabditis elegans לנתח להובלה תאיים בנוירונים

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain and protect cellular identities. The conversion of germ cells into specific neurons in the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful tool for performing genetic screens in order to dissect regulatory pathways that safeguard established cell identities. Reprogramming of germ cells to a specific type of neurons termed ASE requires transgenic animals that allow broad over-expression of the Zn-finger transcription factor (TF) CHE-1. Endogenous CHE-1 is expressed exclusively in two head neurons and is required to specify the glutamatergic ASE neurons fate, which can easily be visualized by the gcy-5prom::gfp reporter. A trans gene containing the heat-shock promoter-driven che-1 gene expression construct allows broad mis-expression of CHE-1 in the entire animal upon heat-shock treatment. The combination of RNAi against the chromatin-regulating factor LIN-53 and heat-shock-induced che-1 over-expression leads to reprogramming of germ cell into ASE neuron-like cells. We describe here the specific RNAi procedure and appropriate conditions for heat-shock treatment of transgenic animals in order to successfully induce germ cell to neuron conversion.

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

This protocol describes how to study cellular processes during cell fate conversion in Caenorhabditis elegans in vivo. Using transgenic animals, allowing heat-shock promoter-driven overexpression of the neuron fate-inducing transcription factor CHE-1 and RNAi-mediated depletion of the chromatin-regulating factor LIN-53 germ cell to neuron reprogramming can be observed in vivo.

היישום של RNAi חום-הלם-induced בביטוי פקטור שעתוק כדי לתכנת בתאי הנבט את הנוירונים C . elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that makes up much of the parenchyma of the human placenta. The distal villous capillary network is the terminus of the fetal blood supply after several generations of branching of vessels extending out from the umbilical cord. This network has a contiguous cellular sheath, the syncytial trophoblast barrier layer, which prevents mixing of fetal blood and the maternal blood in which it is continuously bathed. Insults to the integrity of the placental capillary network, occurring in disorders such as maternal diabetes, hypertension and obesity, have consequences that present serious health risks for the fetus, infant, and adult. To better define the structural effects of these insults, a protocol was developed for this study that captures capillary network structure on the order of 1 - 2 mm3 wherein one can investigate its topological features in its full complexity. To accomplish this, clusters of terminal villi from placenta are dissected, and the trophoblast layer and the capillary endothelia are immunolabeled. These samples are then clarified with a new tissue clearing process which makes it possible to acquire confocal image stacks to z- depths of ~1 mm. The three-dimensional renderings of these stacks are then processed and analyzed to generate basic capillary network measures such as volume, number of capillary branches, and capillary branch end points, as validation of the suitability of this approach for capillary network characterization.

This study presents a protocol for the reversible tissue clearing, immunostaining, 3D-rendering and analysis of vascular networks in human placenta villi samples on the order of 1 - 2 mm3.

תלת מימדי עיבוד וניתוח של Immunolabeled, מובהר היפרדות villous חלקית וסקולרית הרשתות האנושיות

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are facilitated by the transparency of the animal, the ability to do forward and reverse genetic assays, the relative ease of generating fluorescently labeled proteins, and the use of fluorescent dyes that can either be microinjected into the early embryo or incorporated into its food (E. coli strain OP50) to label cellular organelles (e.g. 9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1&#39;H-2,2&#39;-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Here, we present the use of a fluorescent pH-sensitive dye that stains intestinal lysosomes, providing a visual readout of dynamic, physiological changes in lysosomal acidity in live worms. This protocol does not measure lysosomal pH, but rather aims to establish a reliable method of assessing physiological relevant variations in lysosomal acidity. cDCFDA is a cell-permeant compound that is converted to the fluorescent fluorophore 5-(and-6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein (cDCF) upon hydrolysis by intracellular esterases. Protonation inside lysosomes traps cDCF in these organelles, where it accumulates. Due to its low pKa of 4.8, this dye has been used as a pH sensor in yeast. Here we describe the use of cDCFDA as a food supplement to assess the acidity of intestinal lysosomes in C. elegans. This technique allows for the detection of alkalinizing lysosomes in live animals, and has a broad range of experimental applications including studies on aging, autophagy, and lysosomal biogenesis.

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

A step-by-step guide to probe loss of lysosomal acidity in the intestine of C. elegans using the pH-sensitive vital dye 5(6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein diacetate (cDCFDA)

הערכת Alkalinization Lysosomal ב המעי של חיים Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases of the cell cycle, or the incorporation of nucleoside analogs. During S-phase, DNA polymerases incorporate thymidine analogs such as EdU or BrdU into chromosomal DNA, marking the cells for analysis. For C. elegans, the nucleoside analog EdU is fed to the worms during regular culture and is compatible with immunofluorescent techniques. The germline of C. elegans is a powerful model system for the studies of signaling pathways, stem cells, meiosis, and cell cycle because it is transparent, genetically facile, and meiotic prophase and cellular differentiation/gametogenesis occur in a linear assembly-like fashion. These features make EdU a great tool to study dynamic aspects of mitotically cycling cells and germline development. This protocol describes how to successfully prepare EdU bacteria, feed them to wild-type C. elegans hermaphrodites, dissect the hermaphrodite gonad, stain for EdU incorporation into DNA, stain with antibodies to detect various cell cycle and developmental markers, image the gonad and analyze the results. The protocol describes the variations in the method and analysis for the measurement of S-phase index, M-phase index, G2 duration, cell cycle duration, rate of meiotic entry, and rate of meiotic prophase progression. This method can be adapted to study the cell cycle or cell history in other tissues, stages, genetic backgrounds, and physiological conditions.

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

An imaging-based method is described that can be used to identify S-phase and analyze cell cycle dynamics in the C. elegans hermaphrodite germline using the thymidine analog EdU. This method requires no transgenes and is compatible with immunofluorescent staining.

ניתוח מחזור התא C. elegans Germline עם עידו אנלוגי תימידין

Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases ...

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented protocol uses this model to determine the pathogenicity caused by the mitis group streptococci via the production of H2O2. The mitis group streptococci are an emerging threat that cause many human diseases such as bacteremia, endocarditis, and orbital cellulitis. Described here is a protocol to determine the survival of these worms in response to H2O2 produced by this group of pathogens. Using the gene skn-1 encoding for an oxidative stress response transcription factor, it is shown that this model is important for identifying host genes that are essential against streptococcal infection. Furthermore, it is shown that activation of the oxidative stress response can be monitored in the presence of these pathogens using a transgenic reporter worm strain, in which SKN-1 is fused to green fluorescent protein (GFP). These assays provide the opportunity to study the oxidative stress response to H2O2 derived by a biological source as opposed to exogenously added reactive oxygen species (ROS) sources.

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is an excellent model to dissect host-pathogen interactions. Described here is a protocol to infect the worm with members of the mitis group streptococci and determine activation of the oxidative stress response against H2O2 produced by this group of organisms.

לימוד לחץ חימצוני נגרם על-ידי Streptococci קבוצה מיטיס ב Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous system can be observed, with single cell resolution, in vivo. Here, we present an integrated protocol for the examination of neurodevelopment in C. elegans embryos. Our protocol combines imaging, lineaging and neuroanatomical tracing of single cells in developing embryos. We achieve long-term, four-dimensional (4D) imaging of living C. elegans&#160;embryos with nearly isotropic spatial resolution through the use of Dual-view Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM). Nuclei and neuronal structures in the nematode embryos are imaged and isotropically fused to yield images with resolution of ~330 nm in all three dimensions. These minute-by-minute high-resolution 4D data sets are then analyzed to correlate definitive cell-lineage identities with gene expression and morphological dynamics at single-cell and subcellular levels of detail. Our protocol is structured to enable modular implementation of each of the described steps and enhance studies on embryogenesis, gene expression, or neurodevelopment.

Here, we present a combinatorial approach using high-resolution microscopy, computational tools, and single-cell labeling in living C. elegans embryos to understand single cell dynamics during neurodevelopment.

איזוטרופי מיקרוסקופ גיליון אור אוטומטי שושלת היוחסין ניתוח לקטלוג Caenorditis הEmbryogenesis עם רזולוציה Subcellular

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...