Caenorhabditis genetik Merkezi suşları, Doğa Bilimleri ve mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) ve Kanada Vakfı için yenilik (finansmanı için CFI) teşekkür etmek istiyorum. Dr. Lizhen tüm C. elegans deneyler için onun laboratuar İmkanları sınırsız kullanımına izin veren için Chen (hücre sistemleri bölümü ve anatomi, UT sağlık San Antonio) yanı sıra Dr Exing Wang (müdür, optik görüntüleme tesis teşekkür etmek istiyorum UT sağlık San Antonio) confocal mikroskobu konusunda yardım almak için. Biz de doktor Myron Ignatius destek ve video çekimi kolaylaştırmak için cesaret verdiğiniz için teşekkür ederiz istiyorum.

1. leke ve bağırsak organellerin görüntü
<ol><li>Tohum nematodunun büyüme medya (NGM) ile OP50 tabaklar
	<ol>
<li>NGM tabak başı olarak önerilen protokolü19 hazırlamak ve oda sıcaklığında 2 gün kuru kapalı plakalara sağlar.</li>
		<li>OP50 bakteri steril Luria suyu (LB) suyu aşılamak ve titreyen bir inkübatöre veya su banyoda 37 ° c 36 h ya OD 0,2 0,4 aramda kadar büyür. Bir bakteri kültürü ile OD kullanmaktan kaçının > 1 veya OD < 0,2.</li>
		<li>NGM tabak kuru olduğunda, OP50 inoculum Merkezi plaka üzerine bir damla (~ 30 µL) yerde ve daha sonra yaklaşık 2 cm x 2 cm boyutunda bir yama içine damla yayılırlar. Not: Herhangi bir kalan OP50 inoculum 4 ° C'de için bir ay kadar saklanır.</li>
		<li>İnoculum (yaklaşık 10-15 dk) kuruduktan sonra OP50 plakaları ters çevir ve plakaları için 36 h 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>36 h sonra plakaları kuluçka ve mağaza 4 ° C'de daha sonra kullanmak kadar kaldırın. Not: Tabakları 4 ° C'de 1 ay için iyi olmalıdır</li>
	</ol></li>
	<li>CDCFDA OP50 için ilave
	<ol>
<li>CDCFDA OP50 plakalar üzerine ek 10 mM cDCFDA Dimetil sülfoksit (DMSO) içinde bir çalışma hazır hazır olun. Işık ve daha sonra kullanmak için-20 ° C'de mağaza korunuyorsunuz cDCFDA çözüm tutmak.</li>
		<li>Öyle ki tüm yama düzgün cDCFDA ile kaplıdır yavaşça 100 µL 10 mM cDCFDA çözüm 2 cm x 2 cm OP50 yama yüzeyine yerleştirin. Not: OP50 tüm yama cDCFDA ile kaplıdır çok önemlidir. Gerekirse, cDCFDA 150 µL her plaka için kullanın. OP50 yama dışarı akar herhangi bir cDCFDA yemek dahil değil ve azaltılmış boyama şiddeti neden olur bu yana cDCFDA çözüm OP50 yama, sınırların ötesinde kapsamaz zorunludur.</li>
		<li>Tüm cDCFDA çözüm absorbe kadar bakteriyel yama tezgah üstüne koyu bir kutu içinde OP50 tabak koyun (genellikle yaklaşık 25-30 dakika).</li>
	</ol></li>
	<li>Solucan cDCFDA kullanarak boyama
	<ol>
<li>Bir kez cDCFDA tamamen OP50 yama nüfuz, plaka başına 20'den fazla solucanlar yerleştirin ve en az 14 h 20 ° C'de ters plakaları kuluçkaya. Not: Bu cDCFDA plakaları yakmak için pozlandırmayı en aza indirmek için opak bir kutuya koyun önerilir.</li>
		<li>Deneyler arasındaki farklar alımı için kontrol etmek ve cDCFDA sinyalleri, normalize etmek (önerilen) 3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato) () ile ortak leke difluoro) Bor (bir taze yapılmış 1 mM çözüm 2.5 µL), kimin Floresans asidik pH spektrum üzerinde büyük ölçüde değişken olmayan olduğunu bir acidotropic zayıf Amin boya ( Malzemeler tablo bkz: reaktifler ortak adları için). Not: Bu yetersiz cDCFDA boyama yoğunluğunu sağlamak ve yanlış yorumun lizozomal pH vermek beri solucanlar az 14 h için leke değil.</li>
	</ol></li>
	<li>Slaytlar mikroskopi için hazırlanıyor
	<ol>
<li>Teyp yaklaşık 3 inç apart pürüzsüz düz bir yüzeye, bir ayna (şekil 1) gibi etiketleme iki paralel şeritler yerleştirin.</li>
		<li>Su geçirmez sprey ile ayna yüzeyine ceket ve fazla sıvı temizle.</li>
		<li>(Çözünmüş distile H2O) % 2 özel bir mikrodalga tamamen sıvılaşmış kadar erime sonra teyp iki şeritler arasında özel bir 50 µL damla koyun ve öyle ki slayt dikey şeritler için hızlı bir şekilde mikroskop kaydıraklı, açılan kapak kaset. Özel katılaşmış sonra oluşturan dairesel bir yastık altında slayt, slayt ters çevirin ve 5 mM sodyum azid (NaN3) özel yastık üzerine 10-15 µL ekleyebilirsiniz. Not: NaN3 sitokrom C inhibitörü olduğunu o zaman düşük konsantrasyonlarda kullanılır, böylece onlar görüntüleme sırasında hareket etmez geri dönülebilir olarak solucan anesthetizes.</li>
		<li>Solucan cDCFDA ile desteklenmiş OP50 plaka almak ve herhangi bir OP50 olmadan temiz bir NGM plakasına aktarmak. Solucanlar solucan yüzeyinden kaldırılacak OP50 çoğunu izin vermek bir kaç saniyeliğine taşımak izin ve sonra 5 mM sodyum azid içeren özel yastık solucanlar aktarın.</li>
		<li>Hemen özel yastık bir kapak notu ile kapak. Bu solucan patlama neden olabilir bu yana çok fazla baskı uygulamadan kapak notu yavaşça yerleştirdiğinizden emin olun. Not: cDCFDA ile desteklenmiş OP50 bakteri mikroskobu tarafından görüntülenir zaman bulabilsem, bu nedenle solucanların en iyi temizlemek mümkün olduğunca sodyum azid içeren özel yastık bunları yerleştirmeden önce önemlidir. 6'dan fazla (N2, vahşi türü denetimi de dahil olmak üzere) C. elegans suşları prepping, böylece solucanlar özel yastık üzerinde kurumasına olduğunu sağlamak için 6, toplu halde örneklerinde hazırlamak için tavsiye edilir. Bazı suşları vulva kapak notu baskısı nedeniyle uzun bir süre sonra buna göre planlamak önemlidir bu yüzden rüptürü başlanır.</li>
	</ol></li>
	<li>Confocal mikroskobu Not: Bazı mikroskoplar otomatik olarak artırır floresan yoğunluğu Floresans çeşitli düzeyleri için telafi etmek için yerleşik bir özelliği var. Böyle mikroskoplar de doğal olarak örnekleri floresan yoğunluğu artacak bu yana cDCFDA ile lekeli solucanlar görüntüleme için çalışmayabilir.<ol>
<li>488/530 için ayarla uyarma/emisyon dalga boylarında kullanarak standart confocal mikroskop düşsel gerçekleştirmek nm cDCFDA için. Uçak bağırsak organellerin (değil Z-yığınlar) görüntülerini alın ve odak (maksimal sinyal yoğunluğu) yoğunluk miktar için çoğu organellerin kullanın. Not: Belki de boya kullanılabilirlik farklılıkları nedeniyle, bağırsak hücreleri için farinks doğrudan arka organellerin yoğunluğu ne olursa olsun genotip veya yaş boyama cDCFDA korumak, dolayısıyla bu hücrelerde organellerin Imaging önlemek için özen gösterilmelidir.</li>
		<li>2 gün eski vahşi N2 ilk solucanlar türünü içeren slayt görüntü. Bunu yaparken de, lazer gücü, iğne deliği ve diyafram yoğunluğu boyama cDCFDA değil doygun olduğunu emin olmak için gibi confocal görüntüleme parametreleri ayarlayın. Not: Bu ayarlar ayarladığınızda, onları o gün için görüntüleme tüm süresince değiştirmeyin.</li>
		<li>Bağırsak (solucanı başına 3-4 görüntü) tek bir uçağın 1024 x 1024 piksel çekim bir 60 X büyütme objektif kullanarak. Not: Solucan cDCFDA emisyon spektrumunda 520 nm rastlayan bağırsak autofluorescence (şekil 3) ayrı bir belirli sinyal okuma sağlayan onun bildirilen Floresans spektrum20ile tek bir önemli en yüksek verim.</li>
		<li>RAW confocal resim (.lsm dosyaları) her kanal için .tiff dosyası olarak dışa aktarın.</li>
		<li>Daha sonra ImageJ açın ve dosyasını tıklatın | Açık sayısal için görüntü dosyası açmak için. Görüntü yükler sonra oval şekil seçim aracını ImageJ içinde faiz (ROI) bir bölge seçmek için kullanın.</li>
		<li>Bundan sonra tıklayın analiz | Ölçü floresan yoğunluğu için ki ROI ölçmek için. 4 – 5 farklı, odakta organellerin resim başına seçin ve faiz (ROI) her bölgede ortalama göreli floresan yoğunluğu hesaplayın.</li>
		<li>Her görüntü için arka plan floresan yoğunluğu arasında organellerin bağırsak bölgesinde ölçmek. Arka plan Floresans yoğunluk değerleri lizozomal Floresans yoğunluk değerleri üzerinden çıkarma.</li>
		<li>Toplamda, yaklaşık 30-50 normalleştirilmiş değerlerini cDCFDA yoğunluğu (6-10 hayvanlar) test edilen her zorlanma için ayrı ayrı toplamak. Bu değerler herhangi bir uygun istatistiksel yazılım kullanarak bir kutu ve bıyık arsa çizmek için kullanın. Not: floresan yoğunluğu karşılaştırmalar yalnızca aynı boyama deneme sürecinde örnekleri içinde anlamlıdır öyle ki boyama önemli ölçüde sıcaklık, kuluçka süresi ve genel sağlık/yaş hayvan gibi faktörlere bağlı olarak değişebilir. Bu nedenle boyama her denemede denetimleri işlemek önemlidir. İstatistiksel farklar hesaplama (t-testleri) herhangi bir uygun istatistiksel yazılım kullanarak.</li>
		<li>Görüntü tüm (aynı gün lekeli) aynı deneme görüntüleme parametrelerden birini değiştirmek için dikkat çekici sırayla suşları.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Erjavec, N., Larsson, L., Grantham, J., Nystrom, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+aging+and+failure+to+segregate+damaged+proteins+in+Sir2+mutants.">Accelerated aging and failure to segregate damaged proteins in Sir2 mutants.</a> Genes Dev. 21 (19), 2410-2421 (2007).</li><li>Madeo, F., Eisenberg, T., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+for+the+avoidance+of+neurodegeneration.">Autophagy for the avoidance of neurodegeneration.</a> Genes Dev. 23 (19), 2253-2259 (2009).</li><li>Rubinsztein, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+intracellular+protein-degradation+pathways+in+neurodegeneration.">The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration.</a> Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).</li><li>Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+activities+protect+against+age-onset+proteotoxicity.">Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity.</a> Science. 313 (5793), 1604-1610 (2006).</li><li>Cuervo, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+and+aging:+the+importance+of+maintaining+&amp;#34;clean&amp;#34;+cells.">Autophagy and aging: the importance of maintaining &amp;#34;clean&amp;#34; cells.</a> Autophagy. 1 (3), 131-140 (2005).</li><li>Harrington, A. J., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+model+system+for+identifying+effectors+of+alpha-synuclein+misfolding+and+dopaminergic+cell+death+associated+with+Parkinson's+disease.">Caenorhabditis elegans as a model system for identifying effectors of alpha-synuclein misfolding and dopaminergic cell death associated with Parkinson's disease.</a> Methods. 53 (3), 220-225 (2011).</li><li>Muchowski, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+misfolding,+amyloid+formation,+and+neurodegeneration:+a+critical+role+for+molecular+chaperones?.">Protein misfolding, amyloid formation, and neurodegeneration: a critical role for molecular chaperones?.</a> Neuron. 35 (1), 9-12 (2002).</li><li>Cuervo, A. M., Dice, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+decline+in+chaperone-mediated+autophagy.">Age-related decline in chaperone-mediated autophagy.</a> J Biol Chem. 275 (40), 31505-31513 (2000).</li><li>Tonoki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+evidence+linking+age-dependent+attenuation+of+the+26S+proteasome+with+the+aging+process.">Genetic evidence linking age-dependent attenuation of the 26S proteasome with the aging process.</a> Mol Cell Biol. 29 (4), 1095-1106 (2009).</li><li>Squier, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+protein+aggregation+during+biological+aging.">Oxidative stress and protein aggregation during biological aging.</a> Exp Gerontol. 36 (9), 1539-1550 (2001).</li><li>Sarkar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecules+enhance+autophagy+and+reduce+toxicity+in+Huntington's+disease+models.">Small molecules enhance autophagy and reduce toxicity in Huntington's disease models.</a> Nat Chem Biol. 3 (6), 331-338 (2007).</li><li>Glick, D., Barth, S., Macleod, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+cellular+and+molecular+mechanisms.">Autophagy: cellular and molecular mechanisms.</a> J Pathol. 221 (1), 3-12 (2010).</li><li>Boya, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+function+and+dysfunction:+mechanism+and+disease.">Lysosomal function and dysfunction: mechanism and disease.</a> Antioxid Redox Signal. 17 (5), 766-774 (2012).</li><li>Kim, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-aging+treatments+slow+propagation+of+synucleinopathy+by+restoring+lysosomal+function.">Anti-aging treatments slow propagation of synucleinopathy by restoring lysosomal function.</a> Autophagy. 12 (10), 1849-1863 (2016).</li><li>Vila, M., Bove, J., Dehay, B., Rodriguez-Muela, N., Boya, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+membrane+permeabilization+in+Parkinson+disease.">Lysosomal membrane permeabilization in Parkinson disease.</a> Autophagy. 7 (1), 98-100 (2011).</li><li>Cuervo, A. M., Dice, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+intracellular+proteolytic+systems+change+with+age?.">How do intracellular proteolytic systems change with age?.</a> Front Biosci. 3, d25-d43 (1998).</li><li>Cuervo, A. M., Dice, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+lysosomes+get+old.">When lysosomes get old.</a> Exp Gerontol. 35 (2), 119-131 (2000).</li><li>Gachet, Y., Codlin, S., Hyams, J. S., Mole, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=btn1,+the+Schizosaccharomyces+pombe+homologue+of+the+human+Batten+disease+gene+CLN3,+regulates+vacuole+homeostasis.">btn1, the Schizosaccharomyces pombe homologue of the human Batten disease gene CLN3, regulates vacuole homeostasis.</a> J Cell Sci. 118 (Pt 23), 5525-5536 (2005).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Preston, R. A., Murphy, R. F., Jones, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+vacuolar+pH+in+yeast+and+identification+of+acidification-defective+mutants.">Assay of vacuolar pH in yeast and identification of acidification-defective mutants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (18), 7027-7031 (1989).</li><li>Pringle, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy+methods+for+yeast.">Fluorescence microscopy methods for yeast.</a> Methods Cell Biol. 31, 357-435 (1989).</li><li>Baxi, K., Ghavidel, A., Waddell, B., Harkness, T. A., de Carvalho, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Lysosomal+Function+by+the+DAF-16+Forkhead+Transcription+Factor+Couples+Reproduction+to+Aging+in+Caenorhabditis+elegans.">Regulation of Lysosomal Function by the DAF-16 Forkhead Transcription Factor Couples Reproduction to Aging in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 207 (1), 83-101 (2017).</li><li>Colacurcio, D. J., Nixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorders+of+lysosomal+acidification-The+emerging+role+of+v-ATPase+in+aging+and+neurodegenerative+disease.">Disorders of lysosomal acidification-The emerging role of v-ATPase in aging and neurodegenerative disease.</a> Ageing Res Rev. 32, 75-88 (2016).</li><li>Kang, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+screening+identifies+ATM+as+a+target+for+alleviating+senescence.">Chemical screening identifies ATM as a target for alleviating senescence.</a> Nat Chem Biol. 13 (6), 616-623 (2017).</li><li>Arrasate, M., Mitra, S., Schweitzer, E. S., Segal, M. R., Finkbeiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusion+body+formation+reduces+levels+of+mutant+huntingtin+and+the+risk+of+neuronal+death.">Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and the risk of neuronal death.</a> Nature. 431 (7010), 805-810 (2004).</li><li>Brunk, U. T., Terman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial-lysosomal+axis+theory+of+aging:+accumulation+of+damaged+mitochondria+as+a+result+of+imperfect+autophagocytosis.">The mitochondrial-lysosomal axis theory of aging: accumulation of damaged mitochondria as a result of imperfect autophagocytosis.</a> Eur J Biochem. 269 (8), 1996-2002 (2002).</li><li>Gerland, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autolysosomes+accumulate+during+in+vitro+CD8++T-lymphocyte+aging+and+may+participate+in+induced+death+sensitization+of+senescent+cells.">Autolysosomes accumulate during in vitro CD8+ T-lymphocyte aging and may participate in induced death sensitization of senescent cells.</a> Exp Gerontol. 39 (5), 789-800 (2004).</li><li>Poon, H. F., Vaishnav, R. A., Getchell, T. V., Getchell, M. L., Butterfield, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics+analysis+of+differential+protein+expression+and+oxidative+modification+of+specific+proteins+in+the+brains+of+old+mice.">Quantitative proteomics analysis of differential protein expression and oxidative modification of specific proteins in the brains of old mice.</a> Neurobiol Aging. 27 (7), 1010-1019 (2006).</li><li>Yin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+basis+of+lipofuscin,+ceroid,+and+age+pigment-like+fluorophores.">Biochemical basis of lipofuscin, ceroid, and age pigment-like fluorophores.</a> Free Radic Biol Med. 21 (6), 871-888 (1996).</li><li>Nehrke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reduction+in+intestinal+cell+pHi+due+to+loss+of+the+Caenorhabditis+elegans+Na+/H++exchanger+NHX-2+increases+life+span.">A reduction in intestinal cell pHi due to loss of the Caenorhabditis elegans Na+/H+ exchanger NHX-2 increases life span.</a> J Biol Chem. 278 (45), 44657-44666 (2003).</li><li>Chakraborty, K., Leung, K., Krishnan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+lumenal+chloride+in+the+lysosome+is+critical+for+lysosome+function.">High lumenal chloride in the lysosome is critical for lysosome function.</a> Elife. 6, (2017).</li></ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan ederim.

Hücresel ve moleküler olayları çeşitli katkıda bulunmak için yaşlanma, yaşam öyküsü özellikleri ve genetik faktörlerden etkilenir. Bizim son çalışma22 üreme döngüsü lizozomal pH dynamics düzenlenmesi aracılığıyla soma fitness denetlenmesinde önemli bir rol oynar öneriyor. Biz hayvanlar aktif olarak sırayla asidik organellerin sağlar v-ATPaz transkripsiyon upregulation tarafından yeniden iken o lizozomal aracılı proteolizis yükseltilir gösterdi. Üreme, v-ATPaz ifade damla, sonu üzerine organellerin alkalinize ve protein toplamları bu hücrelerinde birikir.
Lizozomal asitleştirme zarar bozuklukları değişmiş v-ATPaz aktivitesi tarafından neden olduğu gösterilmiştir ve v-ATPaz işlevi beyinde azalan Ayrıca çeşitli nörodejeneratif hastalıklar23altında yatan için önerilmiştir. Sonuçlarımız daha da hipotezini Engelli v-ATPaz işlevi hücresel yaşlanma ve yaşlanma24nedenleri arasında destekler.
Bir saytolojik yaşlanma hücreleri misfolded ve toplanan proteinler ilerici oluşumu eski hücreler1,25,26,27,28,29özelliğidir. Post-Reproductive C. elegansolduğu gibi benzer protein toplamları geçit memeli kültürlü lizozomal Lümen içinde geç bulunan27,29hücreleri. Organellerin autophagic yolu terminal bitiş noktası olduğundan, hasarlı proteinler ve organelleri alkalinized organellerin içine sürekli akını sonra diğerine yol açar bu organellerin fonksiyonel çöküşü sonuçlanan akla yatkın Sonuçta hücresel yaşlanma için katkıda aşağı akım olaylar.
Burada açıklanan protokol göreli Asitlik basit ve tekrarlanabilir değerlendirilmesi canlı bağırsak organellerin üretmek için tasarlanmış C. elegans. Dar pH aralığı (4,5-5) bu organelleri uygun proteolizis için gereklidir çünkü pH ince artışlar cep ve doku homeostazı17için dramatik sonuçları var. Floresans özellikleri ve cDCFDA düşük pka sağlar bu fizyolojik ilgili pH pencere18asitliği değişiklikleri yakalamak bu boya. Organellerin boyama için önerilen cDCFDA konsantrasyonu lizozomal pH bizim görüntü parametreleri ve görüntüleme sistemi bağlı olarak değişiklikler en iyi olası okuma sağlamak için optimize edilmiştir. Öyle olsa bile, cDCFDA boyama sonuçlarını cDCFDA boyama desen lizozomal pH değişiklikleri doğru yansıtılmamış öyle ki onların görüntüleme kurulumu temel alınarak farklı son kullanıcılar için farklı olabilir. Bu olursa, elbette eylem en iyi en cDCFDA (10-100 mM) konsantrasyonları farklı varyasyonları görüntüleme için optimum konsantrasyonu belirlemek için kullanmak üzere olurdu vahşi türü N2 solucanlar 2 gün ve günde 8 mesaj L4. İdeal cDCFDA konsantrasyon organellerin genç (2. gün sonrası L4) Worms verimli bir şekilde doygun olmadan lekeleri ama aynı zamanda eski (günde 8 mesaj L4) solucanlar için azalan bir boyama yoğunluk gösterir biridir.
Bir cDCFDA boyama tekniği sınırlamaları onun uzun bir kuluçka zamanı geldi. Solucanlar bir belirli zamanda noktada inkübe zaman, bu sonuçlar yalnızca ~ 24 h sonra görüntülenmeyecektir. Muhtemelen bir pH duyarlı fluorophore lizozomal membran protein öğesini kullanarak lizozomal pH, gerçek zamanlı bir okuma sağlayan C. elegans bir tür geliştirmek için daha verimli olacaktır.
Orada iken birkaç farklı teknikler C. elegans, bağırsak pH değerlendirmek için bu tekniklerin çoğu bağırsak pH bir bütün30, değerlendirmek ya da zaman alan vücut boşluğu içine enjeksiyon gerektirir ve hantal31. cDCFDA büyük ölçüde genetik ekranlar bu değiştirilmiş Haritayı lizozomal pH veya Fizyoloji C. elegans mutantlar için aramak için beslenme RNAi kitaplıklarını kullanma için kolayca uygulanabilir. CDCFDA kullanılan ve bir genç (2. gün sonrası L4) eklediğinizden emin konsantrasyon bu yöntemin yalnızca önemli yönleridir N2 denetim zorlanma confocal görüntüleme her oturumu sırasında yapılandırma için bir kriter olarak.
Yaşlanma için lizozomal pH katkısını daha iyi anlamak için farklı hücresel ve çevresel girişlerine yanıt lizozomal Asitlik düzenleyici mekanizmaları arkasında dinamik değişiklikleri incelemek önemli olacaktır. cDCFDA boyama C. elegansaraştırmada genişletmek için bir strateji olarak kullanılabilir.

Protein toplamları görünümünü yaygın bir hallmark ökaryotik hücreler1,2,3ve hangi hücresel yaşlanma4 ilke sürücüleri arasında düşünülmektedir oluşumu yaşlanma olmak kabul , 5 , 6 , 7. yaş hücreleri gibi protein katabolizma protein toplama artışa önde gelen Engelli olduğunu büyüyen kanıtıdır. Hücrelerin yaşlanma içinde proteolizis çöküşü autophagy8 yanı sıra proteasome-aracılı protein yıkımı9bir bozulma içerir. Son olarak, geri dönüşü olmayan protein oksidasyon daha fazla protein katabolizma10bozulması eski hücrelerde artar.
Autophagy başlangıçta için toplu bozulma bozuk proteinlerin non-selektif bir süreç olduğu düşünülüyordu ama son yıllarda yapılan çalışmalarda bu autophagy çok seçici protein toplamları ve işlevsel olmayan organelleri olmayan katabolizma belirttiler mükellef bozulması diğer protein izni mekanizmaları11ile için. Autophagy işlemi sırasında zarar görmüş ve toplanan proteinleri autophagosome denilen bir çift-membran vezikül münzevi. Bu autophagosome sonra da autophagosome kargo12düşmesine neden organellerin, denilen asidik organelleri ile Sigortalar. Organellerin autophagic yolun son nokta temsil ve membran tamir, transkripsiyon kontrolü ve besin algılama gibi farklı hücresel süreçler iştirak; hücresel homeostasis (ref. 13 gözden) içindeki merkezi rolü vurgulayarak. Çeşitli çalışmalarda lizozomal işlevi bir yaş bağımlı azalma ve çeşitli nörodejeneratif hastalıklar13arasındaki ilişkiyi göstermektedir. Sürekli olarak, büyük hücrelerdeki lizozomal işlevi geri yükleme fenotipleri yaşlanma ile ilgili14,15başlangıçlı gecikme. İntralumen ortamın kompozisyonu çalışmalarının lizozomal büyük hücre işlevinde çöküşü lizozomal proteaz16üretim azalma nedeniyle değil öneririz. Alternatif olarak, intralysosomal asit, enzimatik faaliyet, kritik bir gereklilik kaybı lysosome-aracılı proteolizis17düşüş altında yatan önerilmiştir. Bu hipotez keşfetmek için güçlü olmak, reaktifler ve dinamik değişiklikleri canlı hücrelerdeki lizozomal pH yinelenebilir ve tutarlı bir şekilde soruşturma için protokolleri geliştirmek esastır.
C. elegans bağırsak solucanları önemli metabolik doku ve sistemik homeostazı ve ömrü kritik bir regülatör. Biz deneyleri değişikliklerini değerlendirip geliştirdik solucan nasıl lysosome-aracılı proteolizis belirlemek için bağırsak organellerin Lümen asitliği yaşlanmaya katkıda bulunur. PH-duyarlı fluorophores daha önce C. elegans içinde bağırsak organellerin işaretlemek için kullanılmıştır rağmen henüz küçük artışlar lizozomal pH vivo18'. algılayabilir başarılı bir iletişim kuralı kurmak çabası olmadı Burada, OP50 maması pH duyarlı fluorophore (cDCFDA) içeren basit ve uygun beslenme protokolü kullanarak lizozomal asit kaybı C. elegans bağırsak hücreleri algılamak için kullanılan bir protokol sağlar.

<table><tbody><tr><td>OP50 (&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td>Order online at https://cgc.umn.edu/strain/OP50</td></tr><tr><td>5(6)-carboxy-2&amp;rsquo;,7&amp;rsquo;-dichlorofluorescein diacetate&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>C369</td><td>Commonly known as cDCFDA</td></tr><tr><td>9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1&#039;H-2,2&#039;-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron</td><td>ThermoFisher</td><td>L7528</td><td>Commonly known as Lysotracker Red</td></tr><tr><td>Confocal microscope (e.g. Zeiss LSM 510)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Download for free from https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>LB Broth powder</td><td>ThermoFisher</td><td>22700041</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Sigma</td><td>A5306-1KG</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>S71604</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol powder</td><td>Sigma</td><td>C3045&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>449709</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>K3PO4</td><td>Sigma</td><td>P5629</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Cover Slips</td><td>ThermoFisher</td><td>3406</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A6013</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mirror or other smooth flat surface</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

assessing lysosomal alkalinization in the intestine of live caenorhabditis elegans

Yuvarlak solucanlar Caenorhabditis elegans (C. elegans) uzun ömür ve gelişim yolları çalışma için yaygın olarak kullanılan bir modeli sistemidir. Bu tür çalışmalar hayvan, ileriye ve geriye doğru genetik deneyleri, üreten fluorescently etiketli protein göreli kolaylığı ve ya erken microinjected floresan boyalar kullanımı yeteneği şeffaflık tarafından kolaylaştırdı embriyo veya hücre organelleri (örneğin phenoxazine-5-1 9-diethylamino-5 H-benzo (a) ve (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1)) methylidene]-2 H-pyrrol-5-yl-kappaN} - N - etiketlemek için onun gıda (E. coli zorlanma OP50) içine dahil [2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Burada, bağırsak organellerin, lekeleri floresan bir pH duyarlı boya kullanımı canlı solucanlar lizozomal asitliği dinamik, fizyolojik değişikliklerin görsel bir okuma sağlayan mevcut. Bu iletişim kuralı lizozomal pH ölçmek değil, ama oldukça fizyolojik alakalı varyasyonları lizozomal asitliği değerlendirirken, güvenilir bir yöntem kurmayı amaçlıyor. cDCFDA floresan fluorophore 5-(and-6)-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein (cDCF) hidroliz üzerine tarafından hücre içi esterazlar dönüştürülür hücre permeant bir bileşiktir. Organellerin içinde Protonation cDCF içinde nerede biriken bu organelleri yakalar. 4.8 düşük onun pKa nedeniyle, bu boya Maya bir pH sensör olarak kullanılmıştır. Burada bağırsak organellerin asitliği değerlendirmek için bir gıda takviyesi olarak cDCFDA kullanımı açıklamak C. elegans. Bu teknik canlı hayvanlar, alkalinizing organellerin tespiti için izin verir ve deneysel uygulamalar yaşlanma, autophagy ve lizozomal Biyogenez çalışmalar da dahil olmak üzere geniş bir yelpazesine sahiptir.

cDCFDA bir pH bağımlı şekilde organellerin lekeleri ve onun düşük pKa ve hazır Alım organellerin içine bir ideal pH sensör21yapar. cDCFDA yoğunluğu boyama lizozomal pH (Yani boyama yoğunluğu arttıkça pH azalır)18,22' ye ters orantılıdır. cDCFDA sinyalleri sürekli zayıf organellerin hayvanların klorokin, lizozomal asitleştirme bir inhibitörü 20 mM ile tedavi ve v-ATPaz, protein kompleksi için proton ithalat22 gereklidir organellerin membran üzerinde tükenmiş solucanlar . Bunlar diğer genetik arka planlar veya tedavi boyama cDCFDA göreli düzeylerini değerlendirirken kullanılacak önemli denetimlerdir.
Ayrıca açık hiçbir etkisi üzerinde fitness cDCFDA maruz kalma veya doğurganlık tedavi Worms (veri gösterilmez) bulun. Bu iletişim kuralını kullanan, post-reproductive vahşi türü Worms organellerin asitliği endojen bir kaybı tespit edilmiştir. 3 resimde görüldüğü gibi cDCFDA floresan sinyal genç (2 gün sonrası L4) organellerin içinde sağlam C. elegansacidified organellerin belirten, yeniden oluşturma. Boyama yoğunluğu oldukça eski (8 günlük yazı L4) solucanlar de olduğu gibi nerede proton akını içine bu organelleri azalır solucanlar (via nakavt vha genlerin v-ATPaz alt birimleri kodlama) içinde gözlemlediği gibi organellerin, alkalinization azaltır. Bu yöntemi kullanarak, lizozomal Asitlik fizyolojik bir kaybı post-reproductive hayvanlar ( Şekil 2, şekil 3Albümdeki Floresans diyagramında) bağırsak tespit ettik. İndirimli cDCFDA gün 8 (post-L4) bağırsaklarında alkalinized organellerin ve protein yetkisi içinde olası bir bozulma solucanlar işaret sinyali. Bu hayvanlar protein toplamları organellerin bu hayat sahne22içinde önemli ölçüde biriktikçe durum, bu aslında. Lumen de-asitleştirme bu süreçte rol doğrulamak için biz iki çekirdek bileşenleri v-ATPaz pompası makinaları (VHA-2 ve VHA-8), RNAi tarafından tüketilmiş ve bu nedenle düzgün proton içine almamalısınız hayvan üreten genç, ortak lekeli organellerin. Beklendiği gibi bu post-reproductive vahşi türü Worms karşılaştırılabilir ve alkalinized organellerin (şekil 3) ile tutarlı RNAi hayvanlar, vha-2 ve vha-8 üreme aşamasında bile, azaltılmış cDCFDA floresan sinyallerini gösterdi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57414/57414fig1.jpg"> Şekil 1: slaytlar mikroskopi için hazırlanıyor. Mikroskopi için slayt hazırlamak için takip edilmesi gereken adımları gösteren bir basit adım adım şematik.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57414/57414fig2.jpg"> Resim 2: C. elegansbağırsak organellerin asitliği soruşturma için pH duyarlı boya kullanımı. Bağırsak cDCFDA floresan yoğunluğu şekillerinin (2 gün) üreten ve sonrası üreme (günde 8) solucan gösteren diyagram. Solucanları bütün. en iyi diyagramları gösterir Alt temsil kutularına Yakınlaştırılmış, midgut bölgesinin merkezinde intestinal Lümen diyagramları öngörülen. Organellerin veziküller büyüklüklerde bağırsak hücreleri sitoplazmada olarak tasvir edilir. Bu şematik diyagramları şekil 3 görüntüleri ile karşılaştırın.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57414/57414fig3.jpg"> Şekil 3: Resim Boyama cDCFDA. Temsili Resim 2 gün ve günde 8 (L4 sonrası) gösterilen cDCFDA ile lekeli C. elegans bağırsak organellerin (N2 vahşi türü) yanı sıra vha-2 ve vha-8 RNAi Worms bağırsak organellerin cDCFDA (pozitif kontrol) ile lekeli. vha-2 ve vha-8 katmaninin ATPaz (vATPase), lizozomal Lümen asitleştirme için sorumludur lizozomal membran astar proton pompa altbirimden kodlamak.

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Lizozomal asit pH duyarlı hayati boya 5 (6) - carboxy - 2', 7'-dichlorofluorescein diacetate (cDCFDA) kullanarak C. elegans bağırsak kaybı soruşturma için bir adım adım kılavuz

Bağırsak hayatın Caenorhabditis elegans lizozomal Alkalinization değerlendirilmesi

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

assessing-lysosomal-alkalinization-intestine-live-caenorhabditis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

5.9K Görüntüleme.  University of Saskatchewan. Lizozomal asit pH duyarlı hayati boya 5 (6) - carboxy - 2', 7'-dichlorofluorescein diacetate (cDCFDA) kullanarak C. elegans bağırsak kaybı soruşturma için bir adım adım kılavuz

Video: Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine whether there is an imbalance in age-related energy metabolism between mitochondrial oxidative phosphorylation and aerobic glycolysis. Here, we show the utilization of commercial colorimetric assay kits for lactate and pyruvate in the model organism C. elegans. Recently, the sensitivity and accuracy of the colorimetric/fluorimetric assay kits have been improved greatly by the research and development conducted by reagent manufacturers. The improved reagents have enabled the use of small-scale assays with a 96-well plate in C. elegans. In general, a fluorimetric assay is superior in sensitivity to a colorimetric assay; however, the colorimetric approach is more suitable for the use in common laboratories. Another important issue in these assays for quantitative determination is protein precipitation of homogenized C. elegans samples. In our protein precipitation method, common precipitants (e.g., trichloroacetic acid, perchloric acid and metaphosphoric acid) are used for sample preparation. A protein-free assay sample is prepared by directly adding cold precipitant (final concentration of 5%) during homogenization.

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe a modified small-scale extraction and colorimetric assays of lactate and pyruvate in the nematode C. elegans. When utilizing commercial assay kits, the technical development of their sensitivity and accuracy is important. Protein precipitation in extraction is the most critical step for the quantitative determination of intracellular metabolites.

Küçük ölçekli Renkölçer deneyleri, intrasellüler laktat ve Pyruvate nematodunun Caenorhabditis elegans içinde

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Biyokimya

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the lumen and basolateral membranes contacting each other and/or the extracellular matrix. How this distinctive membrane asymmetry is established and maintained during organ morphogenesis is still an unresolved question of cell biology. This protocol describes the C. elegans intestine as a&#160;model for the analysis of polarized membrane biogenesis during tube morphogenesis, with emphasis on apical membrane and lumen biogenesis. The C. elegans twenty-cell single-layered intestinal epithelium is arranged into a simple bilaterally symmetrical tube, permitting analysis on a single-cell level. Membrane polarization occurs concomitantly with polarized cell division and migration during early embryogenesis, but de novo polarized membrane biogenesis continues throughout larval growth, when cells no longer proliferate and move. The latter setting allows one to separate subcellular changes that simultaneously mediate these different polarizing processes, difficult to distinguish in most polarity models. Apical-, basolateral membrane-, junctional-, cytoskeletal- and endomembrane components can be labeled and tracked throughout development by GFP fusion proteins, or assessed by in situ antibody staining. Together with the organism&#39;s genetic versatility, the C. elegans intestine thus provides a unique in vivo model for the visual, developmental, and molecular genetic analysis of polarized membrane and tube biogenesis. The specific methods (all standard) described here include how to: label intestinal subcellular components by antibody staining; analyze genes involved in polarized membrane biogenesis by loss-of-function studies adapted to the typically essential tubulogenesis genes; assess polarity defects during different developmental stages; interpret phenotypes by epifluorescence, differential interference contrast (DIC) and confocal microscopy; quantify visual defects. This protocol can be adapted to analyze any of the often highly conserved molecules involved in epithelial polarity, membrane biogenesis, tube and lumen morphogenesis.

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analy

The transparent C. elegans intestine can serve as an "in vivo tissue chamber" for studying apicobasal membrane and lumen biogenesis at the single-cell and subcellular level during multicellular tubulogenesis. This protocol describes how to combine standard labeling, loss-of-function genetic/RNAi and microscopic approaches to dissect these processes on a molecular level.

C. elegans bağırsak olarak bir Model hücreler arası Lumen morfogenez ve In Vivo polarize membran Biyogenez tek hücre düzeyinde için: etiketleme antikor boyama, işlev RNAi kaybı çözümleme ve görüntüleme

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the ...

Gelişim Biyolojisi

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

Fat Kütle Biyokimyasal ve Yüksek Verimli Mikroskobik Değerlendirme<em&gt; Caenorhabditis Elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

Biyoloji

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

In living organisms, intestinal hyperpermeability is a serious symptom that leads to many inflammatory bowel diseases (IBDs). Caenorhabditis elegans is a nonmammalian animal model that is widely used as an assay system due to its short lifespan, transparency, cost-effectiveness, and lack of animal ethics issues. In this study, a method was developed to investigate the effects of different bacteria and 3,3'-diindolylmethane (DIM) on the intestinal permeability of C. elegans with a high-throughput image analysis system. The worms were infected with different gut bacteria or cotreated with DIM for 48 h and fed with fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran overnight. Then, the intestinal permeability was examined by comparing the fluorescence images and the fluorescence intensity inside the worm bodies. This method may also have the potential to identify probiotic and pathogenic intestinal bacteria that affect intestinal permeability in the animal model and is effective for examining the effects of harmful or health-promoting chemicals on intestinal permeability and intestinal health. However, this protocol also has some considerable limitations at the genetic level, especially for determining which genes are altered to control illness, because this method is mostly used for phenotypic determination. In addition, this method is limited to determining exactly which pathogenic substrates cause inflammation or increase the permeability of the worms' intestines during infection. Therefore, further in-depth studies, including investigation of the molecular genetic mechanism using mutant bacteria and nematodes as well as chemical component analysis of bacteria, are required to fully evaluate the function of bacteria and chemicals in determining intestinal permeability.

Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

This protocol describes how to measure intestinal permeability of Caenorhabditis elegans. This method is helpful for basic biological research on intestinal health related to the interaction between intestinal bacteria and their host and for screening to identify probiotic and chemical agents to cure leaky gut syndrome and inflammatory bowel diseases.

Bakteri ve Kimyasalların Caenorhabditis elegans'ın Bağırsak Geçirgenliği Üzerine Etkilerinin Ölçülmesi

In living organisms, intestinal hyperpermeability is a serious symptom that leads to many inflammatory bowel diseases (IBDs). Caenorhabditis elegans is a ...

Tıp

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed orientation. Here we describe methods to label, image, and analyze the microtubule dynamics and growth during the development and regeneration of touch neurons in C. elegans. Using genetically encoded fluorescent reporters of microtubule tips, we imaged the axonal microtubules. The local changes in microtubule behavior that initiates axon regeneration following axotomy can be quantified using this protocol. This assay is adaptable to other neurons and genetic backgrounds to investigate the regulation of microtubule dynamics in various cellular processes.

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

A protocol for imaging the dynamic microtubules in vivo using fluorescently labeled End binding protein has been presented. We described the methods to label, image, and analyze the dynamic microtubules in the Posterior lateral microtubule (PLM) neuron of C. elegans.

In vivo Caenorhabditis elegans Nöronlarında Mikrotübül Dinamiklerinin ve Oryantasyonunun Değerlendirilmesi

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed ...

Nörobilim

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

Yöntemler içinde Muscle hücrealtı Kompartmanları DeğerlendirecekÜSKÜP<em&gt; ° C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved in humans and are associated with metabolic syndrome or other diseases. Examination of lipid accumulation in this organism can be carried out by fixative dyes or label-free methods. Fixative stains like Nile red and oil red O are inexpensive, reliable ways to quantitatively measure lipid levels and to qualitatively observe lipid distribution across tissues, respectively. Moreover, these stains allow for high-throughput screening of various lipid metabolism genes and pathways. Additionally, their hydrophobic nature facilitates lipid solubility, reduces interaction with surrounding tissues, and prevents dissociation into the solvent. Though these methods are effective at examining general lipid content, they do not provide detailed information about the chemical composition and diversity of lipid deposits. For these purposes, label-free methods such as GC-MS and CARS microscopy are better suited, their costs notwithstanding.

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Nile red staining of fixed Caenorhabditis elegans is a method for quantitative measurement of neutral lipid deposits, while oil red O staining facilitates qualitative assessment of lipid distribution among tissues.

Lipid bolluk ve değerlendirme Lipid dağılımı Nil kırmızı ve O kırmızı petrol boyama tarafından Caenorhabditis elegans miktar

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits obesity and many associated diseases including cardiovascular disorders, type II diabetes, and cancer. To advance the current understanding of lipid metabolic regulation, quantitative methods to precisely measure in vivo lipid storage levels in time and space have become increasingly important and useful. Traditional approaches to analyze lipid storage are semi-quantitative for microscopic assessment or lacking spatio-temporal information for biochemical measurement. Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology that enables rapid and quantitative detection of lipids in live cells with a subcellular resolution. As the contrast is exploited from intrinsic molecular vibrations, SRS microscopy also permits four-dimensional tracking of lipids in live animals. In the last decade, SRS microscopy has been widely used for small molecule imaging in biomedical research and overcome the major limitations of conventional fluorescent staining and lipid extraction methods. In the laboratory, we have combined SRS microscopy with the genetic and biochemical tools available to the powerful model organism, Caenorhabditis elegans, to investigate the distribution and heterogeneity of lipid droplets across different cells and tissues and ultimately to discover novel conserved signaling pathways that modulate lipid metabolism. Here, we present the working principles and the detailed setup of the SRS microscope and provide methods for its use in quantifying lipid storage at distinct developmental timepoints of wild-type and insulin signaling deficient mutant C. elegans.

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows selective, label-free imaging of specific chemical moieties and it has been effectively employed to image lipid molecules in vivo. Here, we provide a brief introduction to the principle of SRS microscopy and describe methods for its use in imaging lipid storage in Caenorhabditis elegans.

Uyarılmış Raman Saçılma Mikroskopisi Kullanılarak Caenorhabditis elegans Lipid Depolama Dinamiklerinin Etiketsiz Görüntülenmesi

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...

<meta charset="utf8"></head><body>Caenorhabditis elegans'ta Metabolizma ve Yaşlanma Modelinin Değerlendirilmesi

Using Low-Cost Dyes to Visualize Glycogen Accumulation and Gut Integrity in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a transparent, non-parasitic nematode with a simple biology, which makes it a great tool for biological sciences teaching through the staining of the cells or their molecular content. Lugol dye (iodine-potassium iodide solution) has been widely used in biochemistry to stain glycogen stores. In this context, it is possible to observe differences between fed and starved animals, besides the effects of different conditions, such as different diets and oxygen levels. Erioglaucine is a blue dye that indicates the loss of the intestinal barrier. When the intestinal barrier is intact, the blue dye stains inside the lumen; however, when this integrity is disrupted, the dye leaks into the body cavity. Using a stereomicroscope or a microscope, teachers can demonstrate physiological and biochemical alterations, or they can instigate students to ask a scientific question and hypothesize and test their hypothesis using these assays. The present protocol describes two staining techniques in C. elegans that can be easily carried out by students.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Düşük Maliyetli, Yüksek Etkili Tahliller Kullanarak C. elegans'ta Metabolik ve Yaşlanma Süreçlerini Keşfetmek

Teaching biological sciences can be made more stimulating for students through the use of experimentation. This manuscript presents two different yet complementary protocols that can be utilized in the classroom to encourage students to formulate and test hypotheses related to high-calorie diets, starvation, and aging.

Caenorhabditis elegans'ta Glikojen Birikimini ve Bağırsak Bütünlüğünü Görselleştirmek için Düşük Maliyetli Boyaların Kullanılması

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a transparent, non-parasitic nematode with a simple biology, which makes it a great tool for biological sciences ...

Bağırsak hayatın Caenorhabditis elegans lizozomal Alkalinization değerlendirilmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Küçük ölçekli Renkölçer deneyleri, intrasellüler laktat ve Pyruvate nematodunun Caenorhabditis elegans içinde

C. elegans bağırsak olarak bir Model hücreler arası Lumen morfogenez ve In Vivo polarize membran Biyogenez tek hücre düzeyinde için: etiketleme antikor boyama, işlev RNAi kaybı çözümleme ve görüntüleme

Fat Kütle Biyokimyasal ve Yüksek Verimli Mikroskobik Değerlendirme

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Bakteri ve Kimyasalların Caenorhabditis elegans'ın Bağırsak Geçirgenliği Üzerine Etkilerinin Ölçülmesi

In vivo Caenorhabditis elegans Nöronlarında Mikrotübül Dinamiklerinin ve Oryantasyonunun Değerlendirilmesi

Yöntemler içinde Muscle hücrealtı Kompartmanları DeğerlendirecekÜSKÜP

Lipid bolluk ve değerlendirme Lipid dağılımı Nil kırmızı ve O kırmızı petrol boyama tarafından Caenorhabditis elegans miktar

Uyarılmış Raman Saçılma Mikroskopisi Kullanılarak Caenorhabditis elegans Lipid Depolama Dinamiklerinin Etiketsiz Görüntülenmesi

Caenorhabditis elegans'ta Glikojen Birikimini ve Bağırsak Bütünlüğünü Görselleştirmek için Düşük Maliyetli Boyaların Kullanılması