Bu eser bir hibe desteği ile gerçekleştirilen 5R21HD080684-02, Ulusal Enstitüsü çocuk sağlığı ve insan gelişimi. Yazar Ken Cho onun sürekli coşku ve destek için teşekkür etmek istiyor. Yazar ayrıca değerli için Bruce Blumberg kamerasını, Rebekah Charney, el yazması ve Sean McNamara ve Marcin Wlizla Ulusal Xenopus kaynak (RRID:SCR_013731), eleştirel okuma kullanımı için kabul etmek istiyorum X. tropicalis beslenme ve hayvan bakımı rejimleri ile ilgili konuşmaları.

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve University of California, Irvine kullanım Komitesi tarafından onaylanmış olması.
1. PGC nakli hazırlıkları
<ol><li>Diseksiyon araçları peşin, yukarıda açıklanan23hazırlayın. Not: Kaş saç bıçak embriyo ameliyatları gerçekleştirirken stabilize etmek için saç döngüsü yardımı ile insizyon yapmak için kullanılır. Kaş kıllar ve saç döngüler önce bir alev içinde çizilmiştir borosilikat Pasteur Pipetler cam içine yapıştırılmış ve inceltilmiş kısmı üzerinde kırık ( şekil 1A, bkz: ok ucu) daha kısa, dar ipucu (şekil 1B) için daha fazla beceri oluşturmak için ameliyatları gerçekleştirirken.</li>
	<li>SgRNAs yordamlar yukarıda açıklanan24 kullanarak oluşturun. Not: Kısaca, sgRNAs için kodlama kısa DNA şablonları bir hata içermeyen, opsonins DNA polimeraz ile komplementer 5' bakteriyofaj T7 rehberleri ve "dolu" içeren örtüşen deoxyoligonucleotides kullanarak oluşturulur. Vitro sgRNA sentez reaksiyonları (kullanılan seti bağlı olarak) bir gecede birkaç saat inkübe. Tepkiler Dnaz şablonu kaldırmak için tedavi. SgRNAs fenol/kloroform çıkarma ve amonyum asetat/isopropanol bulutlu, seti üreticisinin yönergeleri24göre standart yöntemlerle saf.</li>
	<li>Kısa bir süre microinjections gerçekleştirmeden önce Cas9-sgRNA kompleksleri hazırlamak ilk denaturing ~ 250 tarafından RNAse free (diethylpyrocarbonate-tedavi) H2O 60-65 ° c 5 dk, 3 µL toplam hacmine sgRNA ng takip hızlı soğutma tarafından on Ice 5 min için. SgRNA bir kaç saniyeliğine santrifüj kapasitesi, 1 µg/µL Cas9 protein 1 µL ekleyin ve 10 dk 37 ° C'de karmaşık oluşumu teşvik etmek için kuluçkaya. Not: Bu kuluçka tüp buza mikroenjeksiyon için embriyo hazırlarken tutulabilir.</li>
	<li>X. Tropicalis embriyo vitro fertilizasyon standart yöntemlerle, yukarıda açıklanan25elde. 25,26 de-jöle 10 dk sonrası döllenme, embriyo. Not: Gübreleme zamanı kabul edilir zaman sperm süspansiyon yumurta eklenir ve çanak 1/9thX ile sular altında olduğunu sonra Marc'ın modifiye Ringers (MMR)26. X. Tropicalis25, X. laevis, aksine gerçekleştirmek için de-1/9'jellying x MMR % 3 sistein ücretsiz Bankası (değil HCl tuzu), içeren birden fazla yıkama 1/9 tarafından pH 7.8-8.0 için ayarlanmış takip x MMR. Bir özel (% 1) embriyo transferi-boyalı çanak 1/9 içeren x MMR oda sıcaklığında.</li>
	<li>Hemen içeren 1 %1 özel kaplı bir yemek için enjekte edilebilir embriyo transfer Pasteur pipet kullanarak x MMR.</li>
	<li>
1-hücre aşamada enjekte. Başvurular26,27 Xenopus mikroenjeksiyon yöntemleri ayrıntılı açıklamaları için bkz.
	<ol>
<li>Hayvan pole, tek bir sitede her embriyo 4 ile enjekte nL Cas9-sgRNA Kompleks (son tutar = 1 Cas9 ve sgRNA ~ 250 pg ng; bkz: tartışma)24. Enjeksiyon Makinası şifa 10-20 dakika sonra 1/9 içeren bir özel kaplı yemek için embriyo transfer x MMR ve 25 ° C'de kuluçkaya Ayrıca uninjected kardeş bir fincan greft alıcılar görev yapacak embriyo oluşturun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
~ 5 mm içeren Petri tabak (60 mm) hazırlamak-0,3 içinde yapılan % 1'özel kalın tabaka nakillerine X. tropicalisveya 1 Eğer x MMR, x MMR X. laevisiçin.
	<ol>
<li>Çöküntü ~ 3-4 oluşturmak mm derin bir 3 ekleyerek-x (96-şey PCR plaka kesim tarafından oluşturulan) 4-şey kalıp içine erimiş özel plakaları dökme zaman (bkz: şekil 1 c ve D). Kalıp birkaç milimetre kadar özel sertleştirilmiş bir yüzük standına bağlı bir kelepçe kullanarak Petri kabına alt yukarıda tutun.</li>
		<li>Ayrıca, bir 24-şey plaka wells ile yapılan 1/9 ' % 1'özel ince bir tabaka kaplama tarafından ev bireysel embriyolar için yapmak x MMR. Not: Kültür bu kuyuları için eklendi 1/9 x MMR viomisin sülfat/mL 50 µg ile desteklenmiş ortamıdır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. PGCs nakli
<ol><li>Ne zaman Nieuwkoop ve Faber28 blastula aşamasında 9 (şekil 2A), ~4.5 h ulaşmak sadece embriyoların sonrası döllenme (hpf) X. tropicalisiçin 25 ° C kuluçka makinesi çıkarıp ve oda sıcaklığında ek için equilibrate izin 0,5 h.</li>
	<li>5 nakli başlamak için hpf (şekil 2B), kullanmak Pasteur pipet (Cas9-sgRNA ile enjekte) bir PGC donör embriyo transferi (1.7. adımda oluşturduğunuz) çöküntü içinde 0,3 içeren 60 mm özel yemek için x MMR (veya 1 X. laeviskullanıyorsanız x MMR). Ayrıca bir uninjected kardeş embriyo, greft alıcıya bu çanak transfer. Not: Her biri bu embriyoların kimlikleri değil karışık önemlidir.</li>
	<li>El ile vitelline zarflar forseps kullanarak her embriyo kaldırmak ve böylece onların bitkisel Polonyalılar görünümünde ve ameliyat için erişilebilir her iki embriyo döndürün. Not: El ile de-vitellination embriyo açıklaması daha önce açıklanan26oldu.</li>
	<li>Bir kaş saç bıçak keskin ucu kullanarak, nerede blastopore işaretlemek gelecekteki şişe hücreleri oluşturacak bölge içinde alıcı embriyo bitkisel kutup bir kare şeklinde dört Sığ kesik olun. İnsizyon hemen altında yüzey ve yukarı doğru hareketleri saç döngüsü ile embriyo sabitleme Dilimleme olun embriyo içine kaş saç bıçak ucu ekleyerek olursunuz. Not: Yarım aralıklarla 4.5-7.0 hpf göstermek belgili tanımlık cep büyüklük ve şişe hücreleri (kesik çizgili beyaz daire) nerede oluşturacak tahmin etmek için bir kılavuz sağlamak için Şekil 2 bitkisel bir embriyo görünümlerini gösterir. Amaç kesik kesik kara kutu nerede belirtilir hale getirmektir.</li>
	<li>Bir kez kare dört tarafı kesikler tarafından belirlenen, her kesi bir derinlik, yaklaşık 1/3 1/2 mesafe blastocoel yere ulaşmak için benzer kesme hareketleri kullanarak kaş saç bıçakla derinleştirmek.</li>
	<li>Bitkisel doku explant alıcı embriyo ücretsiz (şekil 3A ve B) bir yatay (bitkisel yüzeye paralel) yaparak derin bitkisel bölgesinde cut(s). Not: PGC içeren bitkisel explant yaklaşık 0,4-0.45 mm yan başına ve 0,25-0.3 mm derinlemesine boyutudur. Bu bitkisel explant alıcı embriyo artık gerekli değildir ve bu nedenle bir kenara atılmak üzere ayarlanmalıdır.</li>
	<li>Hızlı bir şekilde çalışma, bu yordamı (Adım 2,4-2,6) PGC donör embriyo nakli için benzer şekilde ölçekli bitkisel doku parçası oluşturmak için yineleyin. Not: Bu ikinci diseksiyon onun açık yara iyileşmesi alıcı embriyo süresini en aza indirmek için küçük gecikme ile gerçekleştirmek önemlidir.</li>
	<li>Bir kez PGCs içeren doku donör embriyo kaldırılır, kaş saç bıçak ve saç döngü içine alıcı embriyo oluşturulan açılması bulunduğu bu explant taşımak için kullanın. Not: Alıcı embriyo iç donör greft iç yüzeyine karşı karşıya gerekir. Alıcı embriyo ile greft ventral dorsal ve sol-sağ eksen yönelimleri eşleştirmek gerekli değildir.</li>
	<li>Greft yüzeyine paralel düzenlenen kaş saç bıçak mili uzun kenarını hafifçe bastırın greft içine alıcı embriyo bitkisel yüzeyine açılış için kullanın.</li>
	<li>Greft yerleştirildi, bir hairloop veya bir kaş saç bıçak mili donör embriyo "karkas" özel yüzey üzerinde ve bir özel depresyon içine yavaşça kaydırın kılabilmesi için. Karkas açık yara toplu sıvı dönük olduğundan emin olun. Eğer değilse, bu yönlendirme ulaşmak için embriyo döndürmek için kaş saç bıçak kullanın.</li>
	<li>Yerde, bitişik bir depresyon içine şifa greft ile alıcı embriyo slayt ve aynı şekilde aşılı bitkisel pole doku toplu sıvı dönük olduğundan emin olun.</li>
	<li>Başka bir organ nakli/karkas çifti oluşturmak için başka bir çifti donör ve alıcı embriyo kullanarak bu yordamı (adımları 2.1-2.11) yineleyin; bunları boş çöküntü aktarın. Not: Bir karkas ve nakli taşıyan embriyolar uyumlu çiftleri izlemek için gösterimler yapar önemlidir. Donör leşleri Cas9 sgRNA bağlı mutagenesis nakli taşıyan hayvanlar cinsel olgunluğa ulaşana kadar hangi kolayca denetlesinler cant transplante PGCs içinde verimlilik için bir proxy olarak kullanılan (bkz. Adım 3.3, aşağıda ve tartışma ).</li>
	<li>Embriyo yaklaşık 6,5 yaklaşık erken gastrula etap 10, ulaşana kadar nakli yapmaya devam X. tropicalis yılında hpf (bkz. şekil 2E).</li>
</ol>3. embriyo bakım sonrası iyileşme
Not: ~ 30 dakika içinde yerine Greftler iyileşmek ve hücre lizis embriyo (şekil 3 c) yayan yolky bazı enkazı gözlemlemek için normaldir.
<ol><li>
Sonra iyileşti, Pasteur pipet çok yavaşça transfer embriyoların çöküntü bir özel kaplamalı 24-şey plaka bireysel wells için kullanabilirsiniz. Çıktı olacak (şekil 3D) aktarım sırasında karıştırma sıvı tarafından kaldırıldı.
	<ol>
<li>Bunlar bitkisel kadar toplu çözüm karşı karşıya kutup yerleştirilir embriyo döndürür. Yine, donör leşleri yerleştirin ve embriyo çiftleri takip içinde yardımcı olmak için alıcılar bitişik Wells grefti; Bu bilgileri kaydeder.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gecede kültür için 25 ° C kuluçka için embriyo içeren 24-şey plaka aktarın. Not: Ertesi gün, embriyo tailbud aşamaları ulaşmış.</li>
	<li>Özel kaplamalı 6-şey plakaları viomisin sülfat/ml, iyi başına 1 embriyo ile 50 µg ile MMR takıma 1/9 x içeren temizlemek için greft alıcılar taşıyın. Bunlar maç donör leşleri açık bir kaydını tutmak grefti alıcılar.</li>
	<li>Mutagenesis verimliliği sıralama PCR amplicons5,17,24 ya da PCR amplicons ( tartışmabakın) kullanan diğer yöntemleri kullanarak değerlendirmek için 0.2 mL PCR şerit tüpler için bireysel leşleri taşıyın. Orta çoğunu kaldırın ve alçalarak P200 pipet kullanarak pipetting K (PK) tarafından tekrarlanan İndinavir içeren 100 µL lizis arabellek24 ' te lunaparkçı.</li>
	<li>Embriyo lizis24 PK sindirim izin vermek için bir gecede 6 h için 56 ° C'de gerçekleştirin. Bu 90-95 ° C-10 dk hızlı 4 ° C'ye soğutma tarafından takip için Isıtma tarafından PK devre dışı bırakma Lysates daha fazla temizleme adımları olmadan doğrudan Sanger DNA sıralama24için kısa amplicons elde etmek için PCR reaksiyonları tohum için kullanın. Lysates-20 ° C'de depolayın Not: Birkaç gün içinde Kurbağa yavrularını besleme aşamaları (yaklaşık sahne 45-46) ulaşacak ve bir süspansiyon planktonik tozu (sera Micron)-ebilmek var olmak fed.</li>
	<li>Temizlik korumak ve mikrobiyal büyüme, en aza indirmek için kültür ortamının günlük değişimleri ile ~ 1 hafta sonra damla akış ile dolaşan bir su sisteminde küçük tanklar için Kurbağa yavrularını taşımak. Sıralama veri iribaşlar Kurbağa yavrularını üzerinden son derece verimli bir şekilde mutagenized PGCs ile alt mutagenesis verimlilik ile ayırmak için kullanın. Metamorfoz tamamlandıktan sonra froglets laboratuar yetişkin su sisteminde taşıyın. Not: Ulusal Xenopus kaynak (deniz Biyoloji Laboratuvarı, Woods Hole, MA) tarafından geliştirilen rejimleri29 ve yetişkin kurbağa bakım30besleme kurbağa yavrusu için bir kılavuz sağlar.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gurdon, J. B., Hopwood, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+introduction+of+Xenopus+laevis+into+developmental+biology:+of+empire,+pregnancy+testing+and+ribosomal+genes.">The introduction of Xenopus laevis into developmental biology: of empire, pregnancy testing and ribosomal genes.</a> Int J Dev Biol. 44 (1), 43-50 (2000).</li><li>Hellsten, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+Western+clawed+frog+Xenopus+tropicalis.">The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis.</a> Science. 328 (5978), 633-636 (2010).</li><li>Session, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+evolution+in+the+allotetraploid+frog+Xenopus+laevis.">Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis.</a> Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).</li><li>Blitz, I. L., Biesinger, J., Xie, X., Cho, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biallelic+genome+modification+in+F(0)+Xenopus+tropicalis+embryos+using+the+CRISPR/Cas+system.">Biallelic genome modification in F(0) Xenopus tropicalis embryos using the CRISPR/Cas system.</a> Genesis. 51 (12), 827-834 (2013).</li><li>Nakayama, T., Fish, M. B., Fisher, M., Oomen-Hajagos, J., Thomsen, G. H., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+CRISPR/Cas9-mediated+targeted+mutagenesis+in+Xenopus+tropicalis.">Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis.</a> Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).</li><li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+RNA/Cas9-mediated+genome+editing+in+Xenopus+tropicalis.">Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis.</a> Development. 141 (3), 707-714 (2014).</li><li>Wang, F., Shi, Z., Cui, Y., Guo, X., Shi, Y. B., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+disruption+in+Xenopus+laevis+using+CRISPR/Cas9.">Targeted gene disruption in Xenopus laevis using CRISPR/Cas9.</a> Cell Biosci. 5, 15 (2015).</li><li>Jaffe, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c21orf59/kurly+Controls+Both+Cilia+Motility+and+Polarization.">c21orf59/kurly Controls Both Cilia Motility and Polarization.</a> Cell Rep. 14 (8), 1841-1849 (2016).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genome+editing+of+genes+involved+in+neural+crest+development+using+the+CRISPR/Cas9+system+in+Xenopus+embryos.">Efficient genome editing of genes involved in neural crest development using the CRISPR/Cas9 system in Xenopus embryos.</a> Cell Biosci. 6, 22 (2016).</li><li>Naert, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+mediated+knockout+of+rb1+and+rbl1+leads+to+rapid+and+penetrant+retinoblastoma+development+in+Xenopus+tropicalis.">CRISPR/Cas9 mediated knockout of rb1 and rbl1 leads to rapid and penetrant retinoblastoma development in Xenopus tropicalis.</a> Sci Rep. 6 (35264), (2016).</li><li>Ratzan, W., Falco, R., Salanga, C., Salanga, M., Horb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+Xenopus+laevis+F1+albino+J+strain+by+genome+editing+and+oocyte+host-transfer.">Generation of a Xenopus laevis F1 albino J strain by genome editing and oocyte host-transfer.</a> Dev Biol. 426 (2), (2016).</li><li>Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9:+An+inexpensive,+efficient+loss+of+function+tool+to+screen+human+disease+genes+in+Xenopus.">CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus.</a> Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).</li><li>Shigeta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+analysis+of+gene+function+using+CRISPR-Cas9+in+Xenopus+tropicalis+founders.">Rapid and efficient analysis of gene function using CRISPR-Cas9 in Xenopus tropicalis founders.</a> Genes Cells. 21 (7), 755-771 (2016).</li><li>Hontelez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+transcription+is+controlled+by+maternally+defined+chromatin+state.">Embryonic transcription is controlled by maternally defined chromatin state.</a> Nat Commun. 6, 10148 (2015).</li><li>Peshkin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Relationship+of+Protein+and+mRNA+Dynamics+in+Vertebrate+Embryonic+Development.">On the Relationship of Protein and mRNA Dynamics in Vertebrate Embryonic Development.</a> Dev Cell. 35 (3), 383-394 (2015).</li><li>Owens, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Absolute+RNA+Copy+Numbers+at+High+Temporal+Resolution+Reveals+Transcriptome+Kinetics+in+Development.">Measuring Absolute RNA Copy Numbers at High Temporal Resolution Reveals Transcriptome Kinetics in Development.</a> Cell Rep. 14 (3), 632-647 (2016).</li><li>Blitz, I. L., Fish, M. B., Cho, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leapfrogging:+primordial+germ+cell+transplantation+permits+recovery+of+CRISPR/Cas9-induced+mutations+in+essential+genes.">Leapfrogging: primordial germ cell transplantation permits recovery of CRISPR/Cas9-induced mutations in essential genes.</a> Development. 143 (15), 2868-2875 (2016).</li><li>Blackler, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+germ-cells+in+Xenopus+laevis.">Transfer of germ-cells in Xenopus laevis.</a> Nature. 185, 859-860 (1960).</li><li>Blackler, A. W., Fischberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+primordial+germ-cells+in+Xenopus+laevis.">Transfer of primordial germ-cells in Xenopus laevis.</a> J Embryol. Exp Morph. 9, 634-641 (1961).</li><li>Bounoure, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> L'origine des cellules reproductrices et le problem de la lignee germinale. , (1939).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Sutasurya, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Primordial Germ Cells in the Chordates: Embryogenesis and phylogenesis. , (1979).</li><li>Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+of+cultured+Xenopus+oocytes+and+use+in+studies+of+maternally+inherited+molecules.">Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules.</a> Methods Cell Biol. 36, 213-230 (1991).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+dissection+and+micromanipulation+tools.">Embryo dissection and micromanipulation tools.</a> CSH Protoc. , (2007).</li><li>Nakayama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9-based+genome+editing+in+Xenopus+tropicalis.">Cas9-based genome editing in Xenopus tropicalis.</a> Methods Enzymol. 546, 355-375 (2014).</li><li>Ogino, H., McConnell, W. B., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+transgenesis+in+Xenopus+using+I-SceI+meganuclease.">High-throughput transgenesis in Xenopus using I-SceI meganuclease.</a> Nat Protoc. 1 (4), 1703-1710 (2006).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early development of Xenopus laevis.: a laboratory manual. , (2000).</li><li>Kay, B. K., Kay, B. K., Peng, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+oocytes+and+embryos.">Injection of oocytes and embryos.</a> Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology (Methods in Cell Biology Vol. 36). , (1991).</li><li>Nieuwkoop, P., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal Table of Xenopus laevis. (Daudin): A Systematical and Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metomorphosis. , (1994).</li><li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition.">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Res. 42 (22), e168 (2014).</li><li>Sander, V., Reversade, B., De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+opposing+homeobox+genes+Goosecoid+and+Vent1/2+self-regulate+Xenopus+patterning.">The opposing homeobox genes Goosecoid and Vent1/2 self-regulate Xenopus patterning.</a> EMBO J. 26 (12), 2955-2965 (2007).</li><li>Bedell, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome+editing+using+a+high-efficiency+TALEN+system.">In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system.</a> Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).</li><li>Kim, J. M., Kim, D., Kim, S., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotyping+with+CRISPR-Cas-derived+RNA-guided+endonucleases.">Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases.</a> Nat Commun. 5, 3157 (2014).</li><li>Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+editing+in+human+cells+with+zinc+finger+nucleases+constructed+via+modular+assembly.">Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly.</a> Genome Res. 19 (7), 1279-1288 (2009).</li><li>Qiu, P., Shandilya, H., D'Alessio, J. M., O'Connor, K., Durocher, J., Gerard, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+detection+using+Surveyor+nuclease.">Mutation detection using Surveyor nuclease.</a> Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).</li><li>Ota, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+identification+of+TALEN-mediated+genome+modifications+using+heteroduplex+mobility+assays.">Efficient identification of TALEN-mediated genome modifications using heteroduplex mobility assays.</a> Genes Cells. 18 (6), 450-458 (2013).</li><li>Dahlem, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Methods+for+Generating+and+Detecting+Locus-+Specific+Mutations+Induced+with+TALENs+in+the+Zebrafish+Genome.">Simple Methods for Generating and Detecting Locus- Specific Mutations Induced with TALENs in the Zebrafish Genome.</a> PLoS Genet. 8 (8), e1002861 (2012).</li><li>Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+genotyping+of+CRISPR/Cas9-mediated+mutants+using+fluorescent+PCR-capillary+gel+electrophoresis.">High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis.</a> Sci Rep. 5, 15587 (2015).</li><li>Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9:+An+inexpensive,+efficient+loss+of+function+tool+to+screen+human+disease+genes+in+Xenopus.">CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus.</a> Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).</li><li>Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR+Based+Protocol+for+Detecting+Indel+Mutations+Induced+by+TALENs+and+CRISPR/Cas9+in+Zebrafish.">A PCR Based Protocol for Detecting Indel Mutations Induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in Zebrafish.</a> PLoS ONE. 9 (6), e98282 (2014).</li><li>Mock, U., Hauber, I., Fehse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+to+assess+gene-editing+frequencies+(GEF-dPCR)+mediated+by+designer+nucleases.">Digital PCR to assess gene-editing frequencies (GEF-dPCR) mediated by designer nucleases.</a> Nat Protoc. 11 (3), 598-615 (2016).</li><li>Varshney, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+gene+targeting+and+phenotyping+in+zebrafish+using+CRISPR/Cas9.">High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9.</a> Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).</li><li>Shi, J., Wang, E., Milazzo, J. P., Wang, Z., Kinney, J. B., Vakoc, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+cancer+drug+targets+by+CRISPR-Cas9+screening+of+protein+domains.">Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains.</a> Nat Biotechnol. 33 (6), 661-667 (2015).</li><li>Koebernick, K., Loeber, J., Arthur, P. K., Tarbashevich, K., Pieler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elr-type+proteins+protect+Xenopus+Dead+end+mRNA+from+miR-18-mediated+clearance+in+the+soma.">Elr-type proteins protect Xenopus Dead end mRNA from miR-18-mediated clearance in the soma.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107, 16148-16153 (2010).</li><li>Yang, J., Aguero, T., King, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xenopus+maternal-to-zygotic+transition+from+the+perspective+of+the+germline.">The Xenopus maternal-to-zygotic transition from the perspective of the germline.</a> Curr Top Dev Biol. 113, 271-303 (2015).</li></ol>

Yazar ifşa etmek hiçbir şey vardır.

Bu rapor, nakli PGCs PGCs. içeren bitkisel doku nakli için detaylı bir protokol genom düzenleme teknolojileri (Örneğin, CRISPR/Cas9) ile birlikte germline değiştirmek için kullanılır bir hayvan sağlar Neredeyse tüm onun somatik dokuların genetik olarak vahşi türü olarak sürdürmek. Leapfrogging için başarılı olmak için bir dizi performans gösteren nakillerine gerçekleştirmeden önce dikkat edilmesi gereken kritik faktör vardır.
Germline tam yedek mutant gen ile emin olmak için bir ilk sgRNAs in vivo verimliliğini belirler önerilir. Deneyim çoğu sgRNAs CRISPRDirect (https://crispr.dbcls.jp/) veya CRISPRScan (http://www.crisprscan.org/) tarafından tasarlanan 250 pg/embriyo kullanıldığında etkili olduğunu göstermektedir. Ancak, bazı durumlarda (örneğin, Blitz ve ark tarafından17, Yayınlanan gsc sgRNA ~ 1 ng/embriyo gerekli) daha yüksek konsantrasyonlarda kullanmak gerekli olabilir. Mutagenesis hedef sitesinin etkinliğini değerlendirmek önemlidir ve bir nicel değerlendirmesi31GELGİT kullanımına izin verir. Kullanırken vurguladı yöntemi burada doğrudan Sanger (mutant gen F0 embriyo nüfusu temsil eden), PCR amplicons sıralama çok sayıda diğer yöntemleri genom düzenleme literatürde bu amaçla kullanılmaktadır. Yaygın olarak kullanılan diğer orta maliyet için düşük teknikleri parçası uzunluk polimorfizmi analizi ya kaybı enzimleri33 veya Cas9/TALEN bölünme siteleri34, T7 endonükleaz 135 ve arazi dahil 36 deneyleri, heteroduplex hareketlilik tahlil37, yüksek çözünürlüklü eritebilir tahlil38, parçalara ayırması Kapiler Elektroforez39,40ve qPCR tabanlı yöntemleri41, göre analiz 42.
İkinci bir göz hedef site konumu hedef gen içinde seçimdir. Mutant fenotipleri verimli kurtarma F1 üretimi izin vermek için tam LOF gen için şans en üst düzeye çıkarmak önemlidir. Mutant hattı klasik yaklaşımlar kullanarak yaparken Cas9 bölünme Kodlayıcı bölgeler bölge desteği protein başlangıcında erken çeviri fesih temin için bir 5' ucu yakınında hedeflemek için ortak bir stratejidir. F1 heterozygotes frameshift mutasyonları ile tespit edilmesi ve onlar boş allelleri yürütmek için bekleniyor çünkü bu hayvanların daha fazla çalışma için seçili olması. Leapfrogging strateji F0 intercrosses kullandığı için 5' uç kodlama sırası hedefleme yaklaşım son derece verimsiz olurdu. F0 embriyo mozaik germlines var ve heterozygotes17nüfus çoğunlukla F1 mutantların ışığını sonuçlarında bileşik. Büyük ölçekli analiz ortalama, çift iplikli kırılmalara tarafından üretilen mutasyonların beklenen ~1/3rd , çerçeve43olduğunu doğrular beri bu şekilde üretilen çoğu F1 embriyo bir çerçeve ile en az bir gen olurdu mutasyon yaban türü aktivite korumak. Bu nedenle, farklı bir strateji bile bu çerçeve mutant gen boş değerlere olma olasılığı olduğundan emin olmak için gereklidir. Çift kırılmalara normal protein işlevi için gerekli olan protein katlanması etki alanlarındaki hedefleme tam LOF (null allelleri)17,44daha yüksek bir şans içinde sonuçlanması bekleniyor. Protein etki alanları, atom düzeyinde structure(s) için dikkatli bir değerlendirme ne zaman elde edilebilir, o zaman bile bir tek amino asit çerçeve silme içeren etki alanı yapısı (bozmaya beklenebilir ikincil yapılara sahip bölge teşhis etmek için yardımcı olabilir örneğin, Blitz ve ark17tarafından Yayınlanan gsc Δ3bp mutasyon). CRISPR/Cas9 hedef siteleri bu bölge içinde tanımlanan bir başarıyla null allelleri oluşturma daha yüksek bir şans varsa. Protein ikincil yapısal bileşenler arasındaki solvent maruz döngüler içinde küçük silme işlemleri daha az tercih olduklarından daha esnek bölgeleri mutasyonların hala işlevsel proteinler arasında neden olabilir.
Leapfrogging için üçüncü bir göz alıcı embriyo kaldırılması PGC verimliliği olduğunu. Bu adım tam germline yedek sağlamak için etkin olması gerekir. Burada açıklanan yöntemle üretilen tüm greft alıcı embriyo onların PGCs. bütün-mount situ hybridizations gösteri değişkenlik tümüyle kaldırılmasını yerelleştirme blastula aşamasında embriyo PGC işaretlerinin içinde olup şu anda belli değil. Birçok durumda, tamamını veya hemen hemen tüm sinyal bulunur yakınındaki embriyo çoğu bitkisel sonu ve bu nedenle burada özetlenen cerrahi tarafından kaldırıldı (vd.17 ve alıntıları orada Blitz). Ancak, bazı embriyo hücrelerinde birkaç daha yakın blastocoel yere PGC marker ifade göstermektedir. Mikrop plasm önce coalesces bitkisel Kutbu'nda sonra gübreleme ve bölünme oluklar erken kesim sırasında sonra süpürüp götürdü. Bazı mikrop plasm hücreleri bitkisel Yarımküre ortasında dağıtılabilir haline ve etkili bir şekilde blastocoel için genişletmek nakli kullanmadan kaldırılması değil. Ancak, germ hücreli işaretçileri içeren bu derin hücreler germline için katkıda değil gibi mikroRNA'lar PGC mRNA'ların somatik hücre45,46üzerinden temizlemek için bilinen unutmamak önemlidir. PGC işaretler için olumlu boyama bu derin hücreler somatik hücreler böyle izni geçiyor olabilir. Alıcı embriyo tam PGC kaldırılması emin olmak için yöntem şu anda geliştirilmekte olan.
Son olarak, kaç F0 hayvan leapfrogging tarafından oluşturmak için dikkate almak önemlidir. Hayvanlar değişken sayıda cinsel olgunluğa hayatta olmaz gibi 20'den fazla embriyo nakli içeren oluşturulan önerilir. İçin gerekli her iki cinsiyette (1) bu yeterli sayıda emin olmak için yeterince hayatta kalan hayvanlar elde edilir ve bunlar yeterince yüksek frekansta mutant gen araştırmacı tarafından planlanan analizleri için uygun olmak için iletimi (2) olacaktır.
Burada, bazı uygulama ile açıklanan protokolü kullanarak amfibi embryologists PGC nakillerine tekniği biraz pratik ile ana gerekir. Leapfrogging mümkün değil sadece diğer kurbağalar, aynı zamanda kolayca embriyogenez erken aşamalarında bireyler arasındaki transplantable PGCs içeren diğer organizmalar olacaktır.

Nasıl kodladığını genotip fenotip yeniden keşfi beri Biyoloji Mendel'ın yasaları büyük bir soru olmuştur. Genler, onların yönetmelik ve etkileşimleri gen ağları içerisinde rolleri ve işlevleri açığa çıkarmak yeni Biyoloji ve hastalık durumlarında ameliorating araçları sağlamak için kodlanmış ürünleri vaatlerin bir anlayış. Yarım yüzyıl1için, Afrika pençeli kurbağası Xenopus, temel Biyoloji ve Biyomedikal geliştirme genetik kontrolü de dahil olmak üzere, çok çeşitli konular üzerinde çalışmalar için önde gelen bir model olmuştur. Tarihsel olarak, çoğu araştırma Xenopus allotetraploid kurbağa, X. laevis, kullandı ama son zamanlarda, onun diploidy nedeniyle X. tropicalis bir amfibi genetik model olarak geliştirilmiştir. Komple genom dizileri hem Xenopus türler2,3monte edilmiştir. "Kurbağa" Şimdi bir dönüm noktasında nerede temel genom değişiklik teknoloji eğitim gen işlevinin hemen hemen at will ruhsatı topluluktur. Programlanabilir CRISPR/Cas9 endonucleases gen mutagenesis yüksek verimli, biallelic mutasyon mümkün çoğu hücrelerde hayvan4,5,6,7ile yapmış, 8,9,10,11. Bu çalışmalar, Bhattacharya vd tarafından vurguladı 12 ve Shigeta vd. 13, birçok genlerin fonksiyonun F0 mozaik hayvanlarda mutagenesis tarafından okudu olabilir göstermiştir. Bu yaklaşım pek çok avantajı vardır; Ancak, Cas9-sgRNA-microinjected embriyo çoğunlukla nedeniyle eksik işlev (LOF) kaybı değişken fenotipleri görüntüler. Daha da önemlisi, mutant satırları bazı uygulamalar için son derece avantajlı olduğunu — bir anne mRNA katkı var genler okurken özellikle. Anne mRNA'ların ve proteinler ve onların etkileri epigenetik üzerinde uzun bir süre için erken gelişimsel katkıları pek çok gen işleme embriyogenez14,15,16, kalıcı Refrakter F0 analiz için. Bu nedenle, diğer LOF yaklaşımlar gereklidir.
Mutant satırları oluşturmak Aradığınız zaman, çeşitli engeller homozigoz LOF embriyo elde etmek için yolu vardır. Çünkü cinsel olgunluk, uygun bir çizgi üretimi ile müdahale için hayatta yetersizliğinde temel gen işlev sonuçlar biallelic mutasyonları üretmek için ilk, verimli mutagenesis dezavantajlı olabilir. Cas9-sgRNA teslim miktarı dikkatli titrasyon ortak bir çözümdür. Amaç da germline mutagenesis verimliliği en üst düzeye ölümcül azaltmak arasında bir denge elde etmek için burada. İkinci bir sorun nerede fenotipik analizleri F2 nesil kadar ertelenmiş standart üreme düzeninden doğar. Standart yaklaşım kullanarak, mutant gen germline aracılığıyla "hangi sonra cinsel olgunluğa yetiştirilmektedir F1 heterozigoz taşıyıcılar", üretmek için outcrossed iletimi F0 hayvanlar cinsel olgun. İki F1 heterozygotes sonra F2 mutant embriyo % 25 bir beklenen Mendel frekansta üretmek için intercrossed. Böylece, iki kuşak ıslahının mutant fenotipleri analizi için gereklidir. Mutant hayvanlar ya homozygotes ya da bileşik heterozygotes (F1 intercross içinde kullanılan ebeveyn hayvanların genotip bağlıdır içeren iki farklı mutant gen,Yani, döl) olabilir.
Hangi leapfrogging17adlı yeni bir yöntemi altında yatan programlanabilir nükleaz aracılı mutagenesis germ hücreleri, hapsetmesi tarafından bu engellerin üstesinden gelebilir. Leapfrogging iki ana bileşeni vardır: (1 mikroenjeksiyon Cas mRNA ile birlikte sgRNA veya nükleaz-sgRNA kompleksleri (veya, ilke, TALENs veya çinko parmak enzimler) embriyonik genom verimli bir şekilde mutagenize için tek hücreli aşamada takip (2) tarafından PGCs nakli içine wildtype kardeş embriyolar, nerede endojen PGCs çıkarıldı. Her iki adım mutant germ hücreleri ile verimli, tam germline replasmanı olduğunda elde edilebilir. Blackler 1960'ların başında Xenopus PGCs geç neurula, embriyo ve erken tailbud aşamaları18,19arasında nakledilen gösterdi. Leapfrogging için Blackler'ın yaklaşımı PGCs embriyo20,21bitkisel kutbunda yerelleştirilmiş zaman blastula aşamasında17, nakillerine gerçekleştirerek güncellenmiştir. Nakli gastrulasyon önce iki ana avantajı vardır. İlk olarak, nakli ve sonraki normal gelişim engraftment ekimi blastula aşamasında (yayınlanmamış gözlemler) gerçekleştirildiğinde daha verimli olmasını bulundu. İkinci olarak, kısa bir süre zygotic transkripsiyon başladıktan sonra blastula aşamasında nakillerine gerçekleştirerek, bir gelişimsel gen gastrulasyon veya bu bozabilir mutasyonlar, aksi halde hatalı biçimlendirilmiş geç neurulae için yol kaynaklanan ölümcül önleyebilirsiniz. PGC nakli taşıyan embriyolar ("başkanıkendini") için cinsel olgunluğa yetiştirilen ve intercrosses bu F0 hayvanlar arasında birçok durumda, F1 döl % 100'ünü (çoğu bileşik varlık LOF fenotip görüntülemesini göstermiştir heterozygotes), tam germline değiştirme ile hedeflenen mutasyonlar gösteren.
Bu leapfrogging Xenopusgenetik yaklaşımlar hızlanır bekleniyor. Anne etkisi genler (yayınlanmamış gözlemler) LOF analizi için alternatif "transfer ev sahipliği" yöntemi22 sağlar Ayrıca leapfrogging. Geçerli yayında özellikle PGC nakli üzerinde odaklama yöntemi, ayrıntılı bir açıklama X. tropicalis içinde ( X. laevisiçin küçük değişiklikler) sunulur. PGCs nakli burada Xenopusile çalışan diğer laboratuvarlar bu teknolojinin daha hızlı bir transfer kolaylaştırmak için gösterilmiştir. Bu yöntemin ilkeleri diğer kurbağalar (Örneğin, urodeles) başarılı olmalı ve metodoloji olarak organizma özel değişiklikleri uygulama verimli mutagenesis gerçekleştirilebilir birçok hayvan için izin vermelidir ve PGCs kolayca transplantable.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20 or 11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyebrow hair knife</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Homemade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair loop</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Homemade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes, borosilicate glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krazy Glue (Cyanoacrylate-based)</td>
			<td>Elmer&#39;s Products, Inc.</td>
			<td>KG581</td>
			<td>To affix eyebrow hair and hair loops into Pasteur pipettes, other similar glues can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligodeoxynucleotides, custom ordered</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Custom ordered</td>
			<td>Template oligos for sgRNA synthesis, see Nakayama et al., 2014 for design details.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megascript T7 kit</td>
			<td>Ambion/ThermoFisher</td>
			<td>AM1334</td>
			<td>Or use Megashortscript T7 (AM1354) kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol, Tris buffered</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>High quality distilled phenol from any commercial supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>High quality chloroform from any commercial supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>High quality ethanol from any commercial supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethylpyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td>Sigma Chemical Co.</td>
			<td>D5758-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 protein, with nuclear localization signal</td>
			<td>PNA Bio, Inc.</td>
			<td>CP01</td>
			<td>Reconstituted using DEPC-treated water according to manufacturer&#39;s recommendations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Marc&#39;s Modified Ringers solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Homemade. Recipe (ref 26) for 1X MMR (lacking EDTA) is 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. Solution is pH adjusted to 7.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any Molecular Biology grade agarose is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 X15 mm Petri plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>3047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma Chemical Co.</td>
			<td>C7352-100G</td>
			<td>Free base, not HCl salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Roche</td>
			<td>03 115 828 001</td>
			<td>Typically ~20mg/ml from Roche</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sera Micron</td>
			<td>sera</td>
			<td></td>
			<td>Tadpole food. Resuspend in growth medium. Can be purchased from a variety of online retailers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primordial germ cell transplantation for crispr/cas9-based leapfrogging in xenopus

Genom düzenleme mutant satırların yaratılması çoğu canlıda genetik analiz hızlanıyor. CRISPR/Cas9 yöntemleri Afrika pençeli kurbağası, Xenopus, uzun süredir devam eden model organizma biyomedikal araştırmalar için kullanmak için adapte edilmiştir. Homozigoz mutant hatları ile mutagenesis CRISPR/Cas9-hedef oluşturmak için geleneksel ıslah düzenleri çeşitli zaman alan ve zahmetli adımlar var. Özellikle embriyo için gerekli olan genlerin dışarı vurma ile ilişkili engelleri aşmak için mutant embriyo oluşturulması kolaylaştırmak için leapfrogging adlı yeni bir yöntem geliştirildi. Bu teknik Xenopus embriyo "kes ve Yapıştır" sağlamlık güçlendirir embriyoda yöntemleri. Leapfrogging primordial germ hücreleri (PGCs) transferini PGC-ablated wildtype kardeşler verimli bir şekilde mutagenized donör embriyo kullanır. Bu yöntem için temel gen mutasyon verimli chimeric hayvanları içeren bir mutant germline taşıyan wildtype somatik hücreler oluşturarak sağlar. Ne zaman iki F0 hayvan taşıyan "birdirbir nakli" (Yani, mutant germ hücreleri) intercrossed, böylece fenotipik verileri elde etmek için tam üretimi zamandan tasarruf homozigoz veya bileşik heterozigoz, null F1 embriyolar, ürettikleri. Leapfrogging de yeni bir yaklaşım CRISPR/Cas9 mutagenesis takip F0 fenotipik analiz için ateşe dayanıklı anne etkisi genler analiz etmek için sağlar. Bu el yazması PGC nakli başarıyla gerçekleştirmek nasıl üzerinde durularak leapfrogging yöntemi ayrıntıları.

Ekimi, nitel CRISPR/Cas9 mutagenesis etkinliğinin belirlenmesi hayvancılık büyümek ve cinsel olgunluğa hayvanları korumak için çaba sokmaksızın önce gerçekleştirilmelidir. Birdirbir nakli taşıyan hayvan somatically wildtype ve germline doğrudan ölçülerini erişmek zordur çünkü donör embriyo mürekkep tasarrufu önemli hale gelir. Mürekkep DNA analizinden transplante germline17' oluşur mutagenesis kapsam için bir vekil olarak hizmet vermektedir.
Mutagenesis başarısını değerlendirmek için bir yaklaşım doğrudan için hedeflenen genomik bölgesi kapsayan PCR amplicons dizisidir. Bu çok sayıda tek tek klonlanmış DNA parçalarının birçok hayvan üzerinden sıralamak için özellikle pahalı ve verimsiz bir dilek olur. Bunun yerine, onlar genetik mozaik embriyo türetilmiştir gibi hedef sitede heterojen amplicons sıralama her embriyo19mutagenesis etkinliğini değerlendirmek için kullanılır. Görsel olarak chromatograms hedef sıra ve haline tepeler "şifreli" (Yani, birden çok esaslarını her nükleotit konumda görünmesini karşılık gelen doruklarına co oluşumunu) vahşi tipi kol (Pik) akıntıya karşı gösterir aşağı Cas9 katalize iki iplikçikli sonu sitesi. Böyle örnek şekil S1 Blitz ve arkiçinde bulunabilir. 17. bu şifreli tepeler tarafından temsil edilen mutagenesis ölçüde doğru Nefelometri elde edilebilir kullanarak bir dizi ayrışma algoritmasısı, GELGİT (https://tide-calculator.nki.nl/)31. Bu tekniği kullanarak tek tek embriyo eleme her embriyo düzgün enjekte ve mutagenesis için hedeflenen güven verir. Fluorescently tagged dextran gibi bir izleyici başarılı enjeksiyon24 onaylamak için kullanılan ve aynı zamanda bir kurbağa yavrusu nakledilen doku (yayınlanmamış veri) gerçekten de taşıyor oluşturmada yardımcı olabilir. Resmi olasılığını floresan dextran ile birlikte Cas9-sgRNA coinjection Cas9 mutagenesis verimliliği değiştirebilir değil araştırdı unutmamak gerekir. Herhangi bir "leapfrogged" embriyo nakli kötü veya unmutagenized bağışçılardan içeren göz ardı.
F2 nesil analizde standart genetik ıslah düzenleri, ihtiyacını leapfrogging F1 embriyo yerleştirilmesi verimli fenotipik analizleri tanıyarak kaçınmanızı sağlar. Standart yaklaşım gerekli genleri mutasyona kullanırken, Cas9-sgRNA doz dikkatli titrasyon kurucusu embriyolar, bir düşük mutagenesis verimliliği kaynaklanan canlılık sağlamak için gereklidir. F0 kalan bu standart düzen hayvanlardan sonra taşıyıcıları tanımlamak için ekranlı uygun F1 embriyo elde etmek için wildtypes ile outcrossed. Son olarak, bu F1 heterozygotes için cinsel olgunluğa büyüdü ve mutant fenotipleri görüntüleme homozigoz F2 bireyler elde etmek için intercrossed. Buna ek olarak, onların germlines tam yedek mutant gen ile var üretir hayvanlar leapfrogging çünkü, bu F0 hayvanlar ışığını mutant fenotipleri F1 üretimi üretir. Blitz vd. melanosit ve retinada pigmentasyon için gerekli olan Tirozinaz (tyr) odağı hedeflenen F0 hayvanlarının çoğu % 100 germline iletim ( ile outcrossing tarafından ölçülen gösterdi 17 bildirdi Tyr- / - albino hayvanlar) mutant genleri donör kaynaklı (bkz Şekil 4A-B ve Tablo 1). Böylece, iki hayvan leapfrogging tarafından üretilen ışığını homozigoz veya bileşik heterozigoz mutant F1 embriyo verim.
Benzer sonuçlar mutasyonlar (DNA'ya bağlanıcı homeodomain kodlama) homeobox goosecoid (gsc) gen içinde taşıyan F0 leapfrogged hayvanlar ışığını tarafından17 elde (bkz. şekil 4A, C-H). Gsc gen ön kafa32tam gelişimi için gerekli ve Cas9-sgRNA de Haritayı iribaşlar enjekte nakavtlar Gsc ifade morpholino antianlamlı oligonucleotides X. laevis içinde kullanarak önerdi Embriyonik öldürücü fenotipleri17. Ancak, kalıcı ve sağlam somatically vahşi türü, varlık leapfrogged F0 hayvanlar, ve F1 intercross üretilen embriyolar ile aynı LOF fenotipleri bu X. laevis nakavtlar17' yayınlandı. Bu sağlanan veri genetik teyit prensip bir kanıtı olarak bu leapfrogging yanı sıra morpholino fenotip, embriyonik öldürücü fenotipleri üstesinden gelmek için kullanılabilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56035/56035fig1.jpg"> Şekil 1: malzeme nakli için gerekli. Mikrocerrahi erken embriyo üzerinde için döngüler(a)borosilikat cam Pasteur Pipetler kaş saç bıçaklar ve saç yapmak için kullanılır. Çizim Bunsen burner kullanarak cam dışarı saç ekleme için dar bir bitiş sağlar. Kırmızı ok ucu cam ara verilecek yaklaşık konumunda işaretler. (B) bir kaş saç bıçak (üst) ve saç döngüsü (alt), hızlı kuruyan Tutkalla Pipetler sabit bir örnek. 96-şey PCR plaka (C) A bölümü kalıp katılaşmaya % 1'özel izin vererek bir özel plaka çöküntü oluşturmak için kullanılan (0.3 x veya 1 özel yapılmış olup X. tropicalis nakillerine gerçekleştiriliyor bağlı olarak x MMR, veya X. laevis, sırasıyla). Özel kalınlığı 3-4 mm ~ 5 mm olan-derin kuyu. (D) 12 ile ekimi için bir özel plaka örneği çöküntü, Cpanelinde gösterildiği gibi. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56035/56035fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56035/56035fig2.jpg"> Şekil 2: erken gastrula aşamalarında ve strateji diseksiyon için geç blastula sırasında bitkisel pole morfolojisi. (A-F) Xenopus tropicalis embriyo blastula aşamasında 9 başlangıcından itibaren yarım zaman aralıklarında bitkisel görünümünde gösterilir (4.5 hpf) erken gastrula sahne ~10.25 için (7 hpf). 5 önce hpf, blastomeres büyük ve daha kolay zarar görmüş. Beyaz, kesik çizgili daire şişe hücre oluşumu panelleri (E ve F) başlangıç (üst) dorsal tarafta şekillendirme görülebilir gastrulasyon sırasında beklenen konumunu işaretler. Leapfrogging için bir kare içinde dört insizyon yapılır, siyah Kesikli çizgilerle tasvir, bir final cut (değil resimli) doku yüzeyine yapılan paralel bitkisel explant boşaltmak için. Ölçek çubuğu 400 µm. = <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56035/56035fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56035/56035fig3.jpg"> Şekil 3: nakli. (A) bir örnek bir ~5.5 hpf embriyo bitkisel PGC içeren doku çıkarıldıktan sonra. Siyah Kesikli kutu ve beyaz çizgili daire Şekil 2' de gösterilen alanındakiyle aynı göreli boyutlar vardır. (B) bitkisel explant embriyo panelinde A, iç yüzeyi görüntüleyiciyi, karşı karşıya kaldırıldı yaklaşık 0,4-0.45 mm yan başına ve 0,25-0.3 mm derinlemesine olduğunu. (C) bir embriyo transplante bitkisel doku ile. Görüntü ~ 10 dk sonra nakli satın alınmıştır. (D) 30 dakika sonra nakli, bitkisel doku (nazik embriyo Cpanelinde görülen enkaz geçmişte kaldı bir girdap oluşturmak için kullanılan bir kaş saç bıçak ile yukarıdaki dönen) yerine iyileştirmiş görülür. 1/9 x MMR ve kuluçka 25 ° C'de transferden sonra çoğu embriyo gastrulasyon normalde tamamlayın. Ölçek çubuğu 400 µm. = <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56035/56035fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56035/56035fig4v2.jpg"> Şekil 4: Germline iletim F0 hayvanlardan üretilen tarafından leapfrogging. (A)leapfrogging için iki gen CRISPR/Cas9 tarafından Tirozinaz (üst) ve goosecoid (alt) hedef. Tyr gen hedeflenen4,5 kodlama sıralama (mavi gölgelendirme) içinde bir N-terminal sinyal peptid (SP, kırmızı gölgelendirme) yapıldı, gsc Gen dizisi, kodlama içinde hedeflenen17 iken homeobox (kırmızı gölgelendirme) ile başlayan, hangi arasında iki ekzonlar ayrılmıştır. Çevrilmeyen 5' ve 3' eksonik gölgesiz bölgeleridir. (B) tüm 160 F1 iribaşlar üzerinden (Ayrıca bkz: Tablo 1) bir çiftleşme leapfrogged F0 erkek (LF1) ve bir albino (tyr-/-) kadın olduğunu belirten albino leapfrogged erkek tüm germline olmuştu Tyr mutant germ hücreleri ile yerini aldı. İlave bir vahşi tipi iribaş normal retina ve melanosit pigmentasyon ile gösterir. (C-H) İki F0 arasında bir intercross türetilmiş F1 embriyolar Xenopus homeobox gen hedefleme leapfrogged gsc. Yaklaşık 2/3rds embriyoların gsciçin phenotypically mutasyona uğramış, fenotip ile değişen derecelerde ön kesme (E-H) başkanı olmak. Mutantlar yarısı ya kyklopik ya da yakından aralıklı gözleri (F), diğer yarısı ise eyeless (H) vardı. Genotipleme bunlar homozygotes veya bileşik heterozygotes olmak gösterdi. Vahşi-türü fenotip (C, D) gösteren embriyolar 1/3rd homozigoz vahşi türü veya heterozygotes vardı. İn situ hibridizasyon otx2 (ön, orta ve gözleri bir işaretleyici), egr2 (arka beyin rhombomeres 3 ve 5 ve nöral crest akışı işaretleyici) ve hoxb9 (omurilik bir işaretleyici) için Bu kaybı gösterir GSC işlevi yalnızca otx2 etki alanı ön kısmını etkiler. Bu veri Blitz vd. , çoğaltılamaz 17 biyologlar şirket izniyle. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56035/56035fig4v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Çapraz</td>
			<td>Erkek</td>
			<td>Erkek</td>
			<td>Albino</td>
			<td>Vahşi türü</td>
			<td>Toplam</td>
			<td>% Albino</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>LF1</td>
			<td>Tyr-/-</td>
			<td>160</td>
			<td>0</td>
			<td>160</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>LF2</td>
			<td>Tyr-/-</td>
			<td>148</td>
			<td>0</td>
			<td>148</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>Tyr-/-</td>
			<td>LF3</td>
			<td>409</td>
			<td>0</td>
			<td>409</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>Tyr-/-</td>
			<td>LF4</td>
			<td>0</td>
			<td>519</td>
			<td>519</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>Tyr-/-</td>
			<td>LF5</td>
			<td>223</td>
			<td>0</td>
			<td>223</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>LF6</td>
			<td>Tyr-/-</td>
			<td>493</td>
			<td>703</td>
			<td>1196</td>
			<td>41,2</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>Tyr-/-</td>
			<td>LF7</td>
			<td>1</td>
			<td>94</td>
			<td>95</td>
			<td>1.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>Tyr-/-</td>
			<td>LF8</td>
			<td>125</td>
			<td>0</td>
			<td>125</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>Tyr-/-</td>
			<td>LF9</td>
			<td>0</td>
			<td>417</td>
			<td>417</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>Tyr-/-</td>
			<td>LF10</td>
			<td>252</td>
			<td>0</td>
			<td>252</td>
			<td>100</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Verimli germline yedek tarafından birdirbir nakli mutasyonlar Tirozinaziçinde taşıyor. Tirozinazhedefleme, organ nakli taşıyan hayvanlar her iki cinsiyette elde edilmiştir. Bu hayvanları mutant gen germline iletimini ve albinizm iribaş aşamada denetlesinler gösterdi F1 embriyo yüzde verimliliğini sınamak için homozigoz tyr- / -, çoğu albino ile kesişti. "Erkek" ve "Kadın" etiketli sütunlar girişlerinde tyr- / - veya leapfrogging (LF) türetilmiş test hayvan hangi üst belirtin. Embriyo albino fenotip "% Albino" altında gösterilen bir çapraz gösteren içinde yüzde 6 / 10 hayvan birdirbir nakli ile tam (% 100) yedek mutant gen ile gösterdi unutmayın. Bu tablo Blitz ve ark. çoğaltılamaz 17, izne sahip.

Watch this Scientific Journal Video about Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus at JoVE.com

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Hayatta kalmak için gerekli genler mutant satırları oluşturmak için teknik engel oluşturmaktadır. Leapfrogging ölümcül germline mutasyonlar taşıyan vahşi-türü hayvanlar oluşturmak için ilkel germ hücre transplantasyonu ile düzenleme genom birleştirerek kaçınmanızı sağlar. Leapfrogging de F1 nesil homozigoz null mutantların üretimi verimli verir. Burada, nakli adım gösterilmiştir.

CRISPR/Cas9-tabanlı Xenopus Leapfrogging için ilkel Germ hücre transplantasyonu

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

primordial-germ-cell-transplantation-for-crisprcas9-based

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

8.3K Görüntüleme.  University of California, Irvine. Hayatta kalmak için gerekli genler mutant satırları oluşturmak için teknik engel oluşturmaktadır. Leapfrogging ölümcül germline mutasyonlar taşıyan vahşi-türü hayvanlar oluşturmak için ilkel germ hücre transplantasyonu ile düzenleme genom birleştirerek kaçınmanızı sağlar. Leapfrogging de F1 nesil homozigoz null mutantların üretimi verimli verir. Burada, nakli adım gösterilmiştir.

Video: Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Here, we present protocols for rearing an intermediate-germ beetle, Dermestes maculatus (D. maculatus) in the lab. We also share protocols for embryonic and parental RNAi and methods for analyzing embryonic phenotypes to study gene function in this species.

Yetiştirme ve Gizle böcek RNA aracılı gen demonte çift sarmallı,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Genetik

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

Tek Hücre sıralama kullanarak Kopya sayısı Değişmeler Algılama

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those populations. Single-cell gene expression measurements can help assess the role of noise in gene expression, identify correlations in the expression of pairs of genes, and reveal subpopulations of cells that respond differently to a stimulus. Here, we describe a procedure to measure the expression of up to 96 genes in single mammalian cells isolated from a population growing in tissue culture. Cells are sorted into lysis buffer by fluorescence-activated cell sorting (FACS), and the mRNA species of interest are reverse-transcribed and amplified. Gene expression is then measured using a microfluidic real-time PCR machine, which performs up to 96 qPCR assays on up to 96 samples at a time. We also describe the generation and use of PCR amplicon standards to enable the estimation of the absolute number of each transcript. Compared with other methods of measuring gene expression in single cells, this approach allows for the quantification of more distinct transcripts than RNA FISH at a lower cost than RNA-Seq.

We describe a method to sort single mammalian cells and to quantify the expression of up to 96 target genes of interest in each cell. This method includes the use of internal qPCR standards to enable the estimation of absolute transcript counts.

İç Standartları FACS ve qPCR kullanma Tek hücreli Gen İfadesi Profil

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration of transgenes. However, due to the low efficiency of homologous recombination (HR) and various indel mutations of non-homologous end joining (NHEJ)-based strategies in non-dividing cells, in vivo genome editing remains a great challenge. Here, we describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based CRISPR/Cas9 system for efficient in vivo precise targeted integration. In this system, the targeted genome and the donor vector containing homology arms (~800 bp) flanked by single guide RNA (sgRNA) target sequences are cleaved by CRISPR/Cas9. This HMEJ-based strategy achieves efficient transgene integration in mouse zygotes, as well as in hepatocytes in vivo. Moreover, a HMEJ-based strategy offers an efficient approach for correction of fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) mutation in the hepatocytes and rescues Fah-deficiency induced liver failure mice. Taken together, focusing on targeted integration, this HMEJ-based strategy provides a promising tool for a variety of applications, including generation of genetically modified animal models and targeted gene therapies.

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system provides a promising tool for genetic engineering, and opens up the possibility of targeted integration of transgenes. We describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based strategy for efficient DNA targeted integration in vivo and targeted gene therapies using CRISPR/Cas9.

Bir bitiş homoloji-aracılı katılmadan tabanlı strateji kullanarak hedeflenen Integration CRISPR/Cas9-aracılı Vivo içinde

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

Embriyo mikroenjeksiyon ve Nasonia vitripennis genom manipülasyon için transplantasyonu tekniği

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling pathway is one of such essential molecular machinery for cell-to-cell communications, which plays key roles in normal development of embryos. This pathway involves a cell-to-cell transfer of oscillatory information with ultradian rhythms, but despite the progress in molecular biology techniques, it has been challenging to elucidate the impact of multicellular interactions on oscillatory gene dynamics. Here, we present a protocol that permits optogenetic control and live monitoring of gene expression patterns in a precise temporal manner. This method successfully revealed that intracellular and intercellular periodic inputs of Notch signaling entrain intrinsic oscillations by frequency tuning and phase shifting at the single-cell resolution. This approach is applicable to the analysis of the dynamic features of various signaling pathways, providing a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

Here, we present a protocol to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information by optogenetic control and live monitoring of gene expression. This approach provides a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

Bir Optogenetic kontrol etmek ve hücre-hücre etkileşimleri gen ifade desenleri analiz yöntemi

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or C-terminal fluorescent tags. The prokaryotic CRISPR/Cas9 system (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9) may be used to introduce large exogenous sequences into genomic loci via homology directed repair (HDR). To achieve the desired knock-in, this protocol employs the ribonucleoprotein (RNP)-based approach where wild type Streptococcus pyogenes Cas9 protein, synthetic 2-part guide RNA (gRNA), and a donor template plasmid are delivered to the cells via electroporation. Putatively edited cells expressing the fluorescently tagged proteins are enriched by fluorescence activated cell sorting (FACS). Clonal lines are then generated and can be analyzed for precise editing outcomes. By introducing the fluorescent tag at the genomic locus of the gene of interest, the resulting subcellular localization and dynamics of the fusion protein can be studied under endogenous regulatory control, a key improvement over conventional overexpression systems. The use of hiPSCs as a model system for gene tagging provides the opportunity to study the tagged proteins in diploid, nontransformed cells. Since hiPSCs can be differentiated into multiple cell types, this approach provides the opportunity to create and study tagged proteins in a variety of isogenic cellular contexts.

Described here is a protocol for tagging endogenously expressed proteins with fluorescent tags in human induced pluripotent stem cells using CRISPR/Cas9. Putatively edited cells are enriched by fluorescence activated cell sorting and clonal cell lines are generated.

Endojen Protein insan etiketleme Pluripotent kök hücre kullanarak CRISPR/Cas9 indüklenen

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy

Stem and stem-cell-derived cells have immense potential as a regenerative therapy for various degenerative diseases. DNA is the storehouse of genetic data in all cells, including stem cells, and its integrity is fundamental to its regenerative ability. Stem cells undergo rapid propagation in labs to achieve the necessary numbers for transplantation. Accelerated cell growth leads to the loss of DNA integrity by accumulated metabolites, such as reactive oxygen, carbonyl, and alkylating agents. Transplanting these cells would result in poor engraftment and regeneration of the deteriorating organ. Moreover, transplanting DNA-damaged cells leads to mutations, DNA instability, cellular senescence, and possibly, life-threatening diseases such as cancer. Therefore, there is an immediate need for a quality control method to evaluate the cell's suitability for transplantation. Here, we provide step-by-step protocols for the assessment of the DNA integrity of stem cells prior to cell transplantation.

Here, we provide a detailed description of an experimental setup for an analysis of the assessment of DNA integrity in stem cells prior to cell transplantation.

Kardiyak hücre tedavisi için kök hücre DNA bütünlük değerlendirilmesi

Stem and stem-cell-derived cells have immense potential as a regenerative therapy for various degenerative diseases. DNA is the storehouse of genetic data ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been successfully repurposed for genome engineering in many different living organisms. Most commonly, the wildtype CRISPR associated 9 (Cas9) or Cas12a endonuclease is used to cleave specific sites in the genome, after which the DNA double-stranded break is repaired via the non-homologous end joining (NHEJ) pathway or the homology-directed repair (HDR) pathway depending on whether a donor template is absent or present respectively. To date, CRISPR systems from different bacterial species have been shown to be capable of performing genome editing in mammalian cells. However, despite the apparent simplicity of the technology, multiple design parameters need to be considered, which often leave users perplexed about how best to carry out their genome editing experiments. Here, we describe a complete workflow from experimental design to identification of cell clones that carry desired DNA modifications, with the goal of facilitating successful execution of genome editing experiments in mammalian cell lines. We highlight key considerations for users to take note of, including the choice of CRISPR system, the spacer length, and the design of a single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) donor template. We envision that this workflow will be useful for gene knockout studies, disease modeling efforts, or the generation of reporter cell lines.

CRISPR-Cas is a powerful technology to engineer the complex genomes of plants and animals. Here, we detail a protocol to efficiently edit the human genome using different Cas endonucleases. We highlight important considerations and design parameters to optimize editing efficiency.

Memeli hücre CRISPR-Cas kullanarak satırları genom düzenleme

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in vivo gene control of neocortical projection neuron morphology. This method is based on (1) in vitro lentiviral engineering of neuronal precursors as "test" and "control" cells, (2) their co-transplantation into wild-type brains, and (3) paired morphometric evaluation of their neuronal derivatives. Specifically, E12.5 pallial precursors from panneuronal, genetically labeled donors, are employed for this purpose. They are engineered to take advantage of selected promoters and tetON/OFF technology, and they are free-hand transplanted into neonatal lateral ventricles. Later, upon immunofluorescence profiling of recipient brains, silhouettes of transplanted neurons are fed into NeurphologyJ open source software, their morphometric parameters are extracted, and average length and branching index are calculated. Compared to other methods, this one offers three main advantages: it permits achieving of fine control of transgene expression at affordable costs, it only requires basic surgical skills, and it provides statistically reliable results upon analysis of a limited number of animals. Because of its design, however, it is not adequate to address non cell-autonomous control of neuroarchitecture. Moreover, it should be preferably used to investigate neurite morphology control after completion of neuronal migration. In its present formulation, this method is exquisitely tuned to investigate gene control of glutamatergic neocortical neuron architecture. Taking advantage of transgenic lines expressing EGFP in other specific neural cell types, it can be re-purposed to address gene control of their architecture.

Based on in vitro lentiviral engineering of neuronal precursors, their co-transplantation into wild-type brains and paired morphometric evaluation of "test" and "control" derivatives, this method allows accurate modeling of in vivo gene control of neocortical neuron morphology in a simple and affordable way.

In vivo Nöromimarlık çalışmaları için tasarlanan nöronal öncülerin intraventriküler nakli

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...