Bu eser Sapienza Roma Üniversitesi ve İtalyan Kistik fibrozis araştırma Vakfı (proje Siena, Sondrio Valchiavenna, Cerea Il Sorriso di Jenny ve Pavia FFC heyetleri tarafından benimsenen FFC #11/2014) fon tarafından desteklenmiştir. Bu eser parçası da FILAS Grant Prot FILAS-RU-2014-1020 tarafından desteklenmiştir.
Bronş epitel hücreleri sağlamak için Dr Loretta Ferrera (U.O.C. Genetica Medica, Istituto Giannina Gaslini, Genova, İtalya) için minnettarız.

1. hücre hazırlık
<ol><li>Tohum 2.5x106 hücre 10 ml, en az gerekli orta (2 mM glutamin (MEMg), ile desteklenmiş MEM) % 10 fetal sığır serum (FBS), antibiyotik (penisilin ve streptomisin 0.1 mg/mL) ve puromisindir (0,5 µg/mL seçimi ve bakımı için hücre satırı) bir T75 şişesi içinde. 37 ° C ve % 5 CO2 şişeye 2 gün kuluçkaya. Deneme başlamadan önce kesiştiği yerde ters bir mikroskop altında hücre kontrol. Not: deneme için kullanılan ölümsüzleştirdi insan bronş epitel hücreleri puromisindir direnci veriyor lentiviral bir vektör ile transduced hücrelerdir. Stabil bir işlevsel CFTR14,15hızlı.</li>
	<li>Hücre izdiham 90-%100 ulaşmıştır sonra şişeye ortamından Aspire edin ve biyolojik güvenlik kabin sınıfı II altında bir atık şişe içine atın. 6 mL tamponlanmış fosfat hücrelerle serum kalsiyum ve magnezyum (CMF-PBS) yıkayın. Yavaşça şişeye el ile kaya ve CMF-PBS atın. Not: pipet ile hücre monolayer dokunmamaya dikkat et.</li>
	<li>CMF-PBS 10 mL ekleyin ve 10 dk 37 ° C ve % 5 CO2 şişeye kuluçkaya.</li>
	<li>CMF-PBS Aspire edin ve o atın. Sonra tripsin/EDTA 2 mL şişe için ekleyin.</li>
	<li>Yavaşça tamamen hücreleri ceket ve hücreleri gözle görülür bir mikroskop altında müstakil kadar 10 dk 37 ° C ve % 5 CO2 şişeye kuluçkaya çözüm sağlayan şişesi, rock. Not: kuluçka süresi sonunda, yuvarlak ve değil bağlı plastik yüzey hücreleri görünmelidir. Hücreleri de müstakil değilseniz, manuel ajitasyon gerekli olabilir.</li>
	<li>MEMg artı % 10 10 mL ekleyin FBS tripsin devre dışı bırakın ve şişeye alt yıkayarak hücreleri toplamak için. Birimin bir konik 50 mL tüp içine aktarın.</li>
	<li>Tüp 80 x gde 5 dk santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Süpernatant Aspire edin ve MEMg artı % 10 6 mL hücrelerde yeniden askıya FBS. Tekrar tekrar herhangi bir kümeleri kadar kırmaya pipet.</li>
	<li>Bir micropipette ile hücre süspansiyon 10 µL çıkar ve birimin kapak daha önce Burker veya Neubauer odası üzerinde koymak cam altında enjekte.</li>
	<li>Hücre sayısı.</li>
</ol>2. hücre kültüründe tohum ekler
<ol><li>12-şey plaka her kuyuya, kültür Ekle steril cımbızla (şekil 1) aktarın. Plaka yüzeyine düzeltmek için ekler kenarları boyunca basın için cımbız kullanın. Not: Yapışma sağlar bir yapışkan alt ekler var.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56825/56825fig1.jpg"> Resim 1 : Düzgün bir 12-şey plaka kuyu koymak silikon kültür ekler, şematik gösterimi. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56825/56825fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<ol start="2"><li>Düzgün hücre süspansiyon MEMg artı % 10 oranında seyreltin FBS. Her Bölmesi ekleme hücre süspansiyon (yaklaşık 3.5x104 hücreleri/odası), 70 µL ile doldurun. Not: Her kompartımanda uygulanan hücre yoğunluğu hücre türüne göre değişir. Bu izdiham 24 h içinde tamamlamak için yol açar bir hücre yoğunluğu kullanmak için tavsiye edilir.</li>
	<li>Mikroskop altında Hücre Ekle bölmeleri sızıntı değil ve 37 ° C ve % 5 CO224 h 12-şey plaka kuluçkaya kontrol edin.</li>
</ol>3. sözde yara iyileşme tahlil
<ol><li>Kuluçka sonra hücreleri Konfluent hücre monolayers oluşmuş doğrulamak için ters mikroskop altında görselleştirin.</li>
	<li>Test bileşikler (Örneğin, amper) 1 mL MEMg yeniden askıya alma. Not:-20 ° C'de depolanan stok çözüm başlayarak taze amper dilutions hazırlamak</li>
	<li>Yavaşça ekler tarafından steril cımbız kaldırmak. Hücre monolayers kırmamaya dikkat et. Ekler emici kağıt üzerine aktarın. Not: aynı ekler yeniden kullanmak için onlara en az 3 h için % 70 etanol içinde sterilize. Bu daha sonra çöpe önerilir.</li>
	<li>Yapışık olmayan hücreleri kaldırmak için iyi bir micropipette kullanarak başına MEMg 1 mL ekleyin. Plaka kapatın ve yavaşça salla. Not: Orta kendi kesintileri önlemek için doğrudan hücre monolayers üstüne eklemeyin.</li>
	<li>Orta Aspire edin ve MEMg 1 mL de başı ile değiştirin. Plaka kapatın ve bir video kamera ile donatılmış 4 X büyütme, ters mikroskop altında (ekler tarafından oluşturulan) boş hücre boşlukları görselleştirmek. Görüntüleri (T0) zaman sıfır ve bir .jpg biçiminde kaydedebilirsiniz.</li>
	<li>Orta kuyulardan kaldırmak, PBS ile 1 mL yıkar ve o atın.</li>
	<li>(3.2 noktada hazır) test bileşikler wells için ekleyin. Tedavi edilmemiş kontrol örnekleri için MEMg 1 mL ekleyin. 37 ° C ve % 5 CO2plaka kuluçkaya.</li>
	<li>15, 20 ve 24 h tedavi sonra 4 X büyütme, mikroskop altında hücre göç gözlemlemek ve görüntüleri. Not: Bu adım sırasında esir alma imge T0 gelince aynı alanlarda çalışın. Hangi imge esir alma zaman aralıkları seçim hücre geçiş hızına bağlıdır.</li>
	<li>Bazı seçmeli inhibitörleri, Yani AG1478, hücre göç, etkisini incelemek için ekler kaldırmadan önce her INSERT bölmesi ortamından Aspire edin.<ol>
<li>Her bölmesi taze MEMg ile yıkayın ve MEMg AG1478 ile desteklenmiş 70 µL ile doldurun.</li>
		<li>3.3 noktasından açıklandığı gibi kuluçka 37 ° C ve %5 CO230 dk sonra devam. Not: çamaşır adım ve hücre monolayers belirli inhibitörleri ile ön sırasında ekler kaldırmak değil dikkatli olun.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. görüntü analizi
<ol><li>Üzerinde ikmal-in deneme, görüntüleri çeşitli deneysel grupları en iyi temsil eden örnekleri seçin ve T0, T15, T20 ve T24 h tek görüntüleri içeren bir ZIP dosyası oluşturun. Not: Tek görüntüleri tüm örnekleri için seçilen zaman aralıklarında alınır. Triplicates en az üç kez tekrarlanan her deneme için çalıştırın. Sonunda, tüm deneysel grupları, en az 3 fotoğraf ("a", "b", "c", her bağımsız deneyden türetme vb,) için her zaman noktası analiz edilir.</li>
	<li>Belgili tanımlık fermuar eğe içine otomatik olarak seçilen zaman noktalarda (yüzde) olarak cep kaplı ve kazı bölgelerinden deneysel verileri içeren bir elektronik tablo Özet dosya e-posta yoluyla sağlayan görüntü analiz yazılımı yükleyin. Not: Öncü ve gap alanının tanınması büyük ölçüde kenar algılama yöntemi (hangi keskin görüntü parlaklığını değiştirir noktaları belirlenmesi amaçlı) temel alır.</li>
	<li>Verileri kaydetmek ve onları toplamak. Ortalama değer açısından tüm verilerin zaman sıfır normalleştirmek. Her zaman noktası ve göreli standart hata (SEM) tüm çoğaltır normalleştirilmiş veri ortalama değerini hesaplamak. İki yönlü Varyans analizi (ANOVA) kullanarak, uygun istatistik yazılımı ile istatistiksel analiz yapmak. Peptid tedavi grupları ve farklı zaman aralıklarında kontrol grubu arasında farklılıklar istatistiksel olarak signiﬁcant bir piçin olmak olarak kabul edilir < 0,05.</li>
	<li>Elde edilen verileri seçili zaman aralıkları tüm örnek gruplar karşı hücre bölgeyi yüzdesini gösteren bir çubuk grafik, bir grafik çizmek.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Enyedi, B., Niethammer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+epithelial+wound+detection.">Mechanisms of epithelial wound detection.</a> Trends Cell Biol. 25, 398-407 (2015).</li><li>Kujath, P., Kujath, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complicated+skin,+skin+structure+and+soft+tissue+infections+-+are+we+threatened+by+multi-resistant+pathogens?.">Complicated skin, skin structure and soft tissue infections - are we threatened by multi-resistant pathogens?.</a> Eur J Med Res. 15, 544-553 (2010).</li><li>Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+formation+in+the+cystic+fibrosis+airway.">Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway.</a> Pulm Pharmacol Ther. 21, 595-599 (2008).</li><li>Chiappini, E., Taccetti, G., de Martino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+lung+infections+in+cystic+fibrosis+patients:+an+update.">Bacterial lung infections in cystic fibrosis patients: an update.</a> Pediatr Infect Dis J. 33, 653-654 (2014).</li><li>Mangoni, M. L., McDermott, A. M., Zasloff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+peptides+and+wound+healing:+biological+and+therapeutic+considerations.">Antimicrobial peptides and wound healing: biological and therapeutic considerations.</a> Exp Dermatol. 25, 167-173 (2016).</li><li>Lau, K., Paus, R., Tiede, S., Day, P., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+role+of+stem+cells+in+cutaneous+wound+healing.">Exploring the role of stem cells in cutaneous wound healing.</a> Exp Dermatol. 18, 921-933 (2009).</li><li>Hu, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+and+regenerative+repair+in+wound+healing.">Tissue engineering and regenerative repair in wound healing.</a> Ann Biomed Eng. 42, 1494-1507 (2014).</li><li>Ramot, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+PPARgamma-mediated+signalling+in+skin+biology+and+pathology:+new+targets+and+opportunities+for+clinical+dermatology.">The role of PPARgamma-mediated signalling in skin biology and pathology: new targets and opportunities for clinical dermatology.</a> Exp Dermatol. 24, 245-251 (2015).</li><li>Lai, Y., Gallo, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPed+up+immunity:+how+antimicrobial+peptides+have+multiple+roles+in+immune+defense.">AMPed up immunity: how antimicrobial peptides have multiple roles in immune defense.</a> Trends Immunol. 30, 131-141 (2009).</li><li>Zasloff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+peptides+of+multicellular+organisms.">Antimicrobial peptides of multicellular organisms.</a> Nature. 415, 389-395 (2002).</li><li>Hulkower, K. I., Herber, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+and+invasion+assays+as+tools+for+drug+discovery.">Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery.</a> Pharmaceutics. 3, 107-124 (2011).</li><li>Di Grazia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+frog+skin-derived+antimicrobial+peptide+esculentin-1a(1-21)NH2+promotes+the+migration+of+human+HaCaT+keratinocytes+in+an+EGF+receptor-dependent+manner:+a+novel+promoter+of+human+skin+wound+healing?.">The frog skin-derived antimicrobial peptide esculentin-1a(1-21)NH2 promotes the migration of human HaCaT keratinocytes in an EGF receptor-dependent manner: a novel promoter of human skin wound healing?.</a> PLoS One. 10, e0128663 (2015).</li><li>Di Grazia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D-Amino+acids+incorporation+in+the+frog+skin-derived+peptide+esculentin-1a(1-21)NH2+is+beneficial+for+its+multiple+functions.">D-Amino acids incorporation in the frog skin-derived peptide esculentin-1a(1-21)NH2 is beneficial for its multiple functions.</a> Amino Acids. 47, 2505-2519 (2015).</li><li>Cappiello, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esculentin-1a-derived+peptides+promote+clearance+of+Pseudomonas+aeruginosa+internalized+in+bronchial+cells+of+cystic+fibrosis+patients+and+lung+cell+migration:+biochemical+properties+and+a+plausible+mode+of+action.">Esculentin-1a-derived peptides promote clearance of Pseudomonas aeruginosa internalized in bronchial cells of cystic fibrosis patients and lung cell migration: biochemical properties and a plausible mode of action.</a> Antimicrob Agents Chemother. 60, 7252-7262 (2016).</li><li>Bebok, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Failure+of+cAMP+agonists+to+activate+rescued+deltaF508+CFTR+in+CFBE41o-+airway+epithelial+monolayers.">Failure of cAMP agonists to activate rescued deltaF508 CFTR in CFBE41o- airway epithelial monolayers.</a> J Physiol. 569, 601-615 (2005).</li><li>Trinh, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+defective+cystic+fibrosis+airway+epithelial+wound+repair+after+CFTR+rescue.">Improvement of defective cystic fibrosis airway epithelial wound repair after CFTR rescue.</a> Eur Respir J. 40, 1390-1400 (2012).</li><li>Gan, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidermal+growth+factor+receptor+(EGFR)+tyrosine+kinase+inhibitor+AG1478+increases+the+formation+of+inactive+untethered+EGFR+dimers.+Implications+for+combination+therapy+with+monoclonal+antibody+806.">The epidermal growth factor receptor (EGFR) tyrosine kinase inhibitor AG1478 increases the formation of inactive untethered EGFR dimers. Implications for combination therapy with monoclonal antibody 806.</a> J Biol Chem. 282, 2840-2850 (2007).</li><li>Tokumaru, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+keratinocyte+migration+via+transactivation+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+by+the+antimicrobial+peptide+LL-37.">Induction of keratinocyte migration via transactivation of the epidermal growth factor receptor by the antimicrobial peptide LL-37.</a> J Immunol. 175, 4662-4668 (2005).</li><li>Tjabringa, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antimicrobial+peptide+LL-37+activates+innate+immunity+at+the+airway+epithelial+surface+by+transactivation+of+the+epidermal+growth+factor+receptor.">The antimicrobial peptide LL-37 activates innate immunity at the airway epithelial surface by transactivation of the epidermal growth factor receptor.</a> J Immunol. 171, 6690-6696 (2003).</li><li>Di Grazia, A., Luca, V., Segev-Zarko, L. A., Shai, Y., Mangoni, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporins+A+and+B+stimulate+migration+of+HaCaT+keratinocytes+and+kill+intracellular+Staphylococcus+aureus.">Temporins A and B stimulate migration of HaCaT keratinocytes and kill intracellular Staphylococcus aureus.</a> Antimicrob Agents Chemother. 58, 2520-2527 (2014).</li></ol>

Yazarlar ifşa yoktur

Hücre göç yara iyileşmesi, embriyonik gelişim ve kanser metastaz dahil olmak üzere birçok fizyolojik ve patolojik olaylarda önemli bir süreçtir. Hücre göç vitro çalışma temel yordamı içerir: (i) bir hücre monolayer, (ii) hücreleri, Konfluent tabakası sözde bir yarada üretimi oluşturulması (III) yara kadar farklı zaman aralıklarında görüntüleri yakalama kapatma ulaştı , (iv) seçilen hücreleri geçiş hızını ölçmek için görüntü sırası analizi.
Sonuçlarımız kültür ekler uygulanması objektif ve hücre geçiş özellikleri kantitatif değerlendirilmesi için güvenilir deneysel teknik olduğunu göstermiştir. Bu tahlil temel laboratuvar ekipmanları ile herhangi bir araştırma grubu tarafından gerçekleştirilebilir. Ancak, bazı kritik adımlar Protokolü'nün tekrarlanabilirlik ulaşmak için düşünülmelidir. Örneğin, pilot deneyler, tohum izdiham tüm bireysel örneklerde aynı ölçüde almak için her yerde hücrelere tam sayısını tarafından tanımlamak önemlidir. Bu amaç için bir eşitlenmiş döngüsü aşama hücrelerle olan ve tohum önce hücre kümeleri kaçınmak önemlidir. Topaklanma en aza indirmek için mümkün bir şekilde hücre süspansiyon bir şırınga iğnesi ile nazik bir geçiştir. Ancak, örnekleri boyutunu artırarak önemli ölçüde değişkenlik hücreleri arasında düşmesine katkıda bulunacaktır.
Buna ek olarak, tüm örnekleri iyi tanımlanmış bir genişliğe sahip bir boşluk oluşturulması çok önemlidir. Bu amaçla, silikon ekler iki kat daha fazla yeniden kullanılmamalıdır. Ayrıca, silikon ayrılık duvar altında hücrelerinin büyümesini kaçınılmalıdır. Bu sorunları önlemenin, yumuşak basınç INSERT, üstüne bir kez yerleştirilen amacına plaka/iyi, el ile eklemek için plastik yapışma artırmak için steril cımbız vasıtasıyla uygulanabilir. Dikkatli eklemek kaldırılması da boş hücre yüzey genişleme hücre monolayer bozulma ile engel olacaktır.
Ancak, bir kez eklemek doğru yerinden ve sahte bir yara mükemmel üretilen, bazı hücre hatları özellikle serum veya Takviyeler Vitaminler, amino asitler ve büyüme faktörleri gibi olmadan ortamda inkübe Eğer plastik yüzeyden bağlantısını kesin. Hücre kültürü ortamında bu faktörler yokluğu onlar yara iyileşmesi teşvik faaliyetle test bileşiklerin engelleyebilir gerçeği tarafından dikte. Bu sorunu aşmak için kültür orta kompozisyon rasyonel seçim önerilir.
Bir kritik adım yordam Şifa Bu yarayı ayarlamadan önce düşünün için farklı hücre türleri arasında bulunan farklı geçiş hızıdır. Ayrıca bu durumda, ön deneyler görüntüleri yakalanması gerekiyor doğru zaman aralıkları belirlemek amacı ile planlanmış olması gerekir. Bu yöntem ile ilişkili bir sınırlama böyle kültür ekler geçiş süspansiyon (örneğin polimorfonükleer lökositler) yetişen hücre eğitimi için istihdam olamaz düşünün gereklidir.
Yara iyileşmesi deneyleri gerçekleştirilen rağmen silikon kültürü ile ekler daha klasik kazı kazan tahlil daha pahalıdır, onlar hücre göç faaliyete veri hızlı ve doğru üreme sağlar. Sistem Kurulum olduğunda, önemlisi, bu etkinlik endojen veya eksojen faktörler tarafından uyarılan şifa yara temel moleküler mekanizması üzerinde genişletmek için kullanılabilir. Bu amaçla, hücre monolayers belirli molekülleri (Örneğin, inhibitörleri) ile Önarıtma sözde yara oluşturmadan önce yapılabilir. Bir örnek Önarıtma amper tarafından indüklenen "yaralı" alan kapatılması doğrulamak için hücre bölünmesi oranı20 veya (ii) metalloprotease inhibitörleri tarafından etkilenir olup olmadığını keşfetmek için (i Hücre proliferasyonu engelleyici mitomycin C içeren hücrelerin şöyle verilir: katkısını metalloproteases içinde harekete geçirmek EGFR aracılı sinyalleşme yolu12.
Önemlisi, yara kapatma işlemi sırasında örnekleri olabilir sabit ve sitoiskeleti ve çekirdekleri algılama için uygun lekeleri ile tedavi (phalloidin ve DAPI, sırasıyla) değişiklikleri hücre morfolojik açıdan görselleştirmek için (Örneğin, lamellipodia ön kenarında oluşumu) floresan/confocal mikroskobu tarafından. Ayrıca, tedavi floresan etiketli AMP ile hücre hücresel dağılımı (membran yüzey veya hücre içi/intranuclear Yerelleştirme), farklı zamanlarda hücre göç Etkinlik başlangıcından bu yana görselleştirme sağlayabilir. Ayrıca, bu uçlar yara iyileşme faaliyete polarize ve farklılaştırılmış epitel hücreleri (örneğin, birincil bronş hücreleri hava-sıvı arayüzü muhafaza), onlara uygun transwell yerleştirilen sonra analiz etmek için istismar geçirgen destekler.
Sonuç olarak, açıklanan yöntemi yapisan hayvan hücreleri/epitel doku farklı türde göçmendir özellikleri yanı sıra en umut verici yara iyileşmesi yelpazesi anlayış belirgin şekilde artırmak için önemli potansiyele sahip Organizatör ve/veya inhibitörleri, kısa bir süre içinde ve yüksek doğruluk ile.

Büyük ölçüde hayvanlarda yara iyileşmesi bütünlüğü ve doku katmanları normal fonksiyonu yaralanma1sonra yeniden kurmak için temel bir süreç olduğu bilinmektedir. Epitel yüzeyleri dış ortama (Örneğin, deri, solunum sistemi ve gastrointestinal yolları) maruz rağmen fiziksel ve kimyasal hakaret üzerinden koruyucu bir bariyer oluşturmak, yara oluşumu kolayca, özellikle sonra oluşabilir cerrahi veya mikrobiyal enfeksiyonlar2. Örnek olarak, akciğer dokusu tarafından Kistik fibrozis (CF) olanlar, özellikle de fırsatçı bakteriyel pathogen Pseudomonas aeruginosa, kolonizasyon sonucu solunum yetmezliği3airways epitel, zarar yol açar, 4. Yara iyileşmesi bir yaralı doku5normal mimarisini geri yüklemek için bir karmaşık ana bilgisayar onarım mekanizmadır. Epithelialization, anjiogenez ve kolajen üretimini ve hücre farklılaşması6,7,8 ile doku remodeling kapsayan bir yenilenme dönemi ardından ilk inflamasyon ile karakterizedir . Epitel bütünlüğünü güvenceye almak için ve mikrobiyal nükleer silahların yayılmasına karşı denetlemek için tüm canlıların savunma molekülleri, antimikrobiyal peptidler (Amper)9,10dahil üretmek. İşlem şifa yara vitro hücre artıkları ve farklı hücre tipleri arasındaki karmaşık etkileşimler eksikliği nedeniyle benzetimini yapmak çok zordur. Ancak, uyararak sözde bir yara kapatma hızlandırmak için bir peptid vitro yeteneğini epitel hücrelerinin geçiş güvenliği aşılan bir epitel iyileşmek için onun yetenek gösterge. Gerçekten de, hücre göç yara iyileşmesinde hızı sınırlaması olay ve hücre geçiş etkileyen faktörler eğitim geliştirilmiş yara iyileşmesi için hedef tedaviler için yardımcı olacaktır.
Burada, bir çok tekrarlanabilir deneysel tahlil hücre göç içinde vitrodeğerlendirmek için özel silikon kültür ekler göre sağlanır. Konfluent hücre monolayer üzerinde 500 mikron boşluk (sözde yara) oluşturulması dayanmaktadır. Hücreler yapay "yaralı" alanının kenarındaki boş hücre alanına geçiş, yeni hücre-hücre kişiler şekillendirme başlar. Kültür Ekle hızlı yara deneyler şifa için yeni bir araç temsil eder. 500 mikron duvar tarafından ayrılmış iki rezervuarlar sağlanır ve düzgün bir 3 cm tabak tabak içine veya iyi bir 12-şey plaka yerleştirilebilir. Her Bölmesi ekleme bir hücre süspansiyon ile doldurma hücreleri ekleme kaldırma yaklaşık 500 mikron (ayrılık duvar aynı genişlikte) bir temiz boş hücre boşluk doğurmak iken izdiham kadar belirlenmiş her alanda büyümeye sağlar. Bir uygun hücre kültür testi karışımla takıma orta sonra amacına eklenebilir plaka/iyi. Daha sonra boşluğu kapatma ters bir mikroskop, tercihen bir resim alma için bir video kamera ile donatılmış altında farklı zaman aralıklarında görüntülenir. Son olarak, ölçüm değişiklikleri web tabanlı otomatik görüntü analiz programı tarafından cep kaplı alanda yaranın kapanması ve hücre geçiş hızını miktar sağlayacaktır. Genel olarak, bu yöntem klasik tahlil, burada bir çizik bile el ile steril bir iğne ile Konfluent hücre monolayers incising tarafından yapılır veya bir pipet ipucu11ile ilgili bir adım olur. Nitekim, son işlem plastik alt yemeğin yok edebilir plaka/iyi ve kırışıklıkları oluşturma yüzey kaplama. Buna ek olarak, bu son derece iğne/ipucu için araştırmacılar tarafından uygulanan basınç bağlı olarak "yaralı" alan iyi tanımlanmış genişlik boşluğu, tüm uzunluğu boyunca sahip değil. Ayrıca, yerinden çıkar hücreleri çizik kenarları canlı ve ölü hücreleri kümeleri oluşturabilir; Ayrıca, canlı hücreler "yaralı" alanının Yayilim sigara tekrarlanabilir sonuçlar12üreten hücre geçiş hızı ile etkileyebilir.
Ayrıca, sıfırdan görüntü analiz platformu sayesinde kullanıcılar hızla (dakika içinde) ek yazılım edinme gerekliliği olmadan Seçili hücrelerin göç davranışı üzerinde Nicel veri alabilir. Bu platform faz kontrast mikroskobu görüntülerini düşük (~ 5 X), orta (~ 10 X) ve yüksek (~ 20 X) büyütme analiz yeteneğine sahiptir. Görüntülerin (*.jpg, *.jpeg, *.jp2, *.png, *.gif, *.tiff biçimi) bir zip dosyası yükledikten sonra analiz otomatik olarak alan hücre örtülü ve Karalama alanı yüzdesini, hem de hücre hızını gösteren bir Özet dosyası oluşturmak için yapılır göç, farklı zaman aralıklarında.
Bu çalışmada, bir kurbağa-cilt AMP-Türev, Yani Esc(1-21) ve onun diastereomer Esc(1-21) - 1 c13ve fonksiyonel CF transmembran gürültülerinden regülatörü (CFTR)14,15ifade bir bronş hücre satırı kullanarak, peptid indüklenen hücre göç tedavi edilmemiş (kontrol) örnekleri ile karşılaştırıldığında bir örnek sağlanmıştır. Hava yolu epitel ve CFTR akciğer fonksiyonu korumada önemli bir rol oynamak unutmayın ve onarım16yara. Ayrıca, selektif inhibitörü (Örneğin, AG1478)17 epidermal büyüme faktörü reseptör (EGFR) aracılığıyla, geçiş bronş hücre tarafından yukarıda belirtilen peptidler indüklenen kanıt EGFR12aktivasyonu içerir, 18 bildirilir.
Özet olarak, bu yordam nasıl böyle silikon kültür ekler kullanımı doğru göç yapışık hücreleri (Örneğin, bronş epitel hücreleri) ve moleküler belirlemek için hızlı ve kolayca erişilebilen bir tahlil temsil ettiğini göstermek için hedeftir Bu tür olayları kontrol mekanizmaları.

<table><tbody><tr><td>Minimum essential medium (MEM)&amp;nbsp;</td><td>Euroclone</td><td>ECB2071L</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Euroclone</td><td>ECB3000D</td><td></td></tr><tr><td>Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Euroclone</td><td>ECS0180DH&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin and Streptomycin</td><td>Euroclone</td><td>ECB3001D</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA 1X in PBS</td><td>Euroclone</td><td>ECB3052D</td><td>Warm at room temperature before use</td></tr><tr><td>DPBS without calcium and magnesium (CMF-PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>DPBS with calcium and magnesium (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>Ibidi Culture-Insert 2 well</td><td>Ibidi&amp;nbsp;</td><td>80209</td><td></td></tr><tr><td>Wimasis Image Analysis</td><td>Ibidi&amp;nbsp;</td><td>30002</td><td></td></tr><tr><td>PRISM software&amp;nbsp;</td><td>GraphPad</td><td>version 6.0</td><td></td></tr></tbody></table>

a novel in vitro wound healing assay to evaluate cell migration

Bu çalışmanın amacı, antimikrobiyal peptidler (Amper), hücre göç teşvik etmek gibi bazı immunomodulatory molekülleri yeteneği değerlendirmek için yeni bir yöntem göstermektir. Önemlisi, hücre geçiş bütünlüğü ve doku katmanları normal fonksiyonu yaralanma sonra yeniden kurmak için yara iyileşme sürecinde bir hızı sınırlaması olayı değil. Bu yöntemin avantajı üzerinden el ile yapılan bir çizik içinde bir hücre monolayer dayanır, klasik tahlil özel silikon kültür kullanımı iyi tanımlanmış genişlik (500 mikron ile bir boş hücre sözde yara alan oluşturmak için sağlayan iki bölmeleri ekler olduğunu ). Buna ek olarak, bir otomatik görüntü analiz platformu nedeniyle hızla yaranın kapanması ve hücre geçiş hızı üzerinde nicel verileri elde etmek mümkündür. Daha doğrusu, iki kurbağa-cilt amper etkisi bronş epitel hücrelerinin geçiş-ecek var olmak göstermek. Ayrıca, ön bu hücrelerin belirli inhibitörleri ile bu tür olayların altında yatan moleküler mekanizmaları üzerinde bilgi sağlar.

Bu iletişim kuralı etkisi Esc(1-21) ve Esc(1-21) - 1 c fonksiyonel CFTR ifade bronş epitel hücreleri indüklenen hücre göç etkinlik açısından şifa yara belirlemek için kullanıldı. Bu tahlil, kültür ekler bir 12-şey plaka wells yerleştirildi ve her bölmesi MEMg % 10 ile desteklenmiş 35.000 hücreleri ile seribaşı FBS. Hücreleri 24 h içinde tam izdiham sonra ulaştı, bir 500 mikron boşluk oluşturulur ve her şey peptid farklı konsantrasyonlarda içeren MEMg doluydu. Deneme dört kez tekrarlandı. Şekil 2' de gösterildiği gibi hücre monolayer üretilen sözde yara alan neredeyse tamamen kapanmayla sırasıyla ~ 20 h, Esc(1-21) - 1 c ve Esc(1-21), 1 mikron ve 10 mikron en uygun konsantrasyonlarda içinde iki peptidler tarafından akımıdır. Bu Esc(1-21) - 1 c bronş hücrelerdeki sözde bir yara yeniden epithelialization teşvik daha verimli olduğunu gösterir.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56825/56825fig2v3.jpg"> Resim 2 : Esculentin-1a etkisini elde edilen amper bronş epitel hücreleri monolayer içinde oluşturulan sözde bir yara kapatılması üzerine. Hücreleri silikon kültür Ekle her kompartımanda tohumlari ve onun kaldırıldıktan sonra hücre için hücre göç 15, 20 ve 24 s kanıt peptidler eklenmesinden sonra çekildi. Hücre bölgeyi noktası hesaplanmıştır her zaman yüzdesi tedavi edilmemiş kontrol hücreleri (Ctrl) karşılaştırıldığında ve y ekseni üzerinde bildirilir. Tüm veriler üzerinden dört bağımsız deneyler ± SEM anlamına gelir ve bir önceki çalışmada14alınır. Kontrol ve tedavi örnekleri arasında testleri için istatistiksel anlamlılık düzeyleri şunlardır: *p< 0,05, **p< 0,01, ***p< 0,001, ve ***p< 0,0001. Her peptid, 1 mikron, Denetim ile karşılaştırıldığında konsantrasyonu içeren hücrelerin tedavisinden sonra (T0) önce temsilcisi sonuçları ve 20 h gösterilen filmler de raporlanır. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56825/56825fig2v3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
EGFR aktivasyonu Esc kaynaklı yara kapatma bir rol oynadı olup olmadığını doğrulamak için bronş hücreleri AG1478, EGFR, selektif inhibitörü ekleme kaldırma önce 30 dakika 5 mikron ile preincubated. Hücre bölgeyi yüzdesi önemli ölçüde peptid indüklenen otelde hücreleri inhibitörü önceki peptid yönetimiyle (şekil 3), bu işaret ön işleme değil bulundu sonuçları için karşılaştırıldığında tüm zaman aralıklarında düşürülmüştür bu yana hücre göç EGFR aktivasyonu içerir. Ancak, daha fazla çalışmaları Esc peptidler (Örneğin, doğrudan EGFR etkinleştirme veya trans-harekete geçirmek membran bağlantılı EGFR ligandlar ayırmak için gösterilen metalloproteases tarafından aracılı tarafından tetiklenen moleküler olayları açıklamak için gerekli olacak 19).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56825/56825fig3v3.jpg"> Şekil 3 : Bronş epitel hücrelerinin peptid kaynaklı geçiş AG1478 önleyici etkisi. Hücreleri ekleme kaldırma önce 5 ile önceden inkübe mikron AG1478 30 dk için ve daha sonra aynı konsantrasyonu tek başına peptid ile tedavi. Tüm veriler üzerinden dört bağımsız deneyler ± SEM anlamına gelir ve bizim önceki iş14alınır. Belirtilen grup örnekleri arasında testleri için istatistiksel anlamlılık düzeyleri şunlardır: *p< 0,05; p< 0,0001. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56825/56825fig3v3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration at JoVE.com

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Burada, peptidler etkisi bronş epitel hücrelerinin geçiş değerlendirmek için bir protokol mevcut. Bu yöntemi Nicel veri hücre göç ve yara kapatma hızı üzerinde hızlı ve son derece tekrarlanabilir elde olanak sağlar.

Roman Vitro hücre göç değerlendirmek için şifa tahlil yara

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

a-novel-in-vitro-wound-healing-assay-to-evaluate-cell-migration

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

21.8K Görüntüleme.  Sapienza University of Rome. Burada, peptidler etkisi bronş epitel hücrelerinin geçiş değerlendirmek için bir protokol mevcut. Bu yöntemi Nicel veri hücre göç ve yara kapatma hızı üzerinde hızlı ve son derece tekrarlanabilir elde olanak sağlar.

Video: A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms including wound healing disorder. The physiological process of wound healing is highly complex. The formation of granulation tissue is a key step in this process resulting in a preliminary wound closure and providing a network of new capillary blood vessels &#8211; either through vasculogenesis (novel formation) or angiogenesis (sprouting of existing vessels). Both vasculo- and angiogenesis require functional, directed migration of endothelial cells. Thus, investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of chemical induced wound healing disorders and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention.
We assessed impaired wound healing after alkylating agent exposure and tested potential candidate compounds for treatment. We used a set of techniques outlined in this protocol. A modified Boyden chamber to quantitatively investigate chemokinesis of EEC is described. Moreover, the use of the wound healing assay in combination with track analysis to qualitatively assess migration is illustrated. Finally, we demonstrate the use of the fluorescent dye TMRM for the investigation of mitochondrial membrane potential to identify underlying mechanisms of disturbed cell migration. The following protocol describes basic techniques that have been adapted for the investigation of EEC.

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

Toksik Kimyasalların Maruz sonra Endotel Hücre Göç Değerlendirilmesi

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Gelişim Biyolojisi

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration and invasion abilities to understand how cancer cells disseminate, with the aim of developing new treatment strategies. Analysis of the cellular and molecular basis of these abilities has led to the characterization of cell mobility and the physicochemical properties of the cytoskeleton and cellular microenvironment. For many years, the Boyden chamber assay and the scratch wound assay have been the standard techniques to study cell invasion and migration. However, these two techniques have limitations. The Boyden chamber assay is difficult and time consuming, and the scratch wound assay has low reproducibility. Development of modern technologies, especially in microscopy, has increased the reproducibility of the scratch wound assay. Using powerful analysis systems, an &#34;in-incubator&#34; video microscope can be used to provide automatic and real-time analysis of cell migration and invasion. The aim of this paper is to report and compare the two assays used to study cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and an optimized in vitro video microscope-based scratch wound assay.

This study reports two different methods for the analysis of cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and the in vitro video microscope-based wound-healing assay. The protocols for these two experiments are described, and their benefits and disadvantages are compared.

Cep işgali ve geçiş işlemi değerlendirilmesi: Video mikroskop esaslı çizik karşılaştırılması tahlil ve Boyden odası tahlil yara

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

Kanser Araştırmaları

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor metastasis. In this assay, cells are grown to form a confluent monolayer and a mechanical wound is created by scratching with a device. Then the migration rate of the cells towards the denuded area can be monitored by imaging. Our 8-channel mechanical wounder is designed to tackle most of the problems associated with the cell migration assay. Firstly, our wounder can be easily sterilized by autoclaving or with common disinfectants. Secondly, the individual adjustable pins allow even contact with the cell culture plate so that sharp and reproducible wounds can be created. Thirdly, the guiding bars on both sides of the wounder ensure consistent wounding position in each well. The use of disposable plastic pipette tips for wounding can further provide better handling of the wounder as well as to minimize cross-contamination. In conclusion, our cell wounder can provide researchers with a user friendly and reproducible device for performing the cell migration assay using the standard 96-well culture plate.

Here, we present a protocol to perform a semi-high throughput cell migration assay on a 96-well cell culture plate. This protocol is a fast, simple and economical method to create consistent scratch wounds on a cell monolayer.

96 oyuklu bir plaka içerisinde hücre gücü / yara iyileşme gerçekleştirmek için bir cihaz

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration

Understanding the physiologic mechanisms of wound healing has been the focus of ongoing research for many years. This research directly translates into changes in clinical standards used for treating wounds and decreasing morbidity and mortality for patients. Wound healing is a complex process that requires strategic cell and tissue interaction and function. One of the many critically important functions of wound healing is individual and collective cellular migration. Upon injury, various cells from the blood, surrounding connective, and epithelial tissues rapidly migrate to the wound site by way of chemical and/or physical stimuli. This migration response can largely dictate the outcomes and success of a healing wound. Understanding this specific cellular function is important for translational medicine that can lead to improved wound healing outcomes. Here, we describe a protocol used to better understand cellular migration as it pertains to wound healing, and how changes to the cellular environment can significantly alter this process. In this example study, dermal fibroblasts were grown in media supplemented with fetal bovine serum (FBS) as monolayer cultures in tissue culture flasks. Cells were aseptically transferred into tissue culture treated 12-well plates and grown to 100% confluence. Upon reaching confluence, the cells in the monolayer were vertically scratched using a p200 pipet tip. Arsenic diluted in culture media supplemented with FBS was added to individual wells at environmentally relevant doses ranging 0.1-10 &#956;M. Images were captured every 4 hours (h) over a 24 h period using an inverted light microscope to observe cellular migration (wound closure). Images were individually analyzed using image analysis software, and percent wound closure was calculated. Results demonstrate that arsenic slows down wound healing. This technique provides a rapid and inexpensive first screen for evaluation of the effects of contaminants on wound healing.

In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration

This study focuses on an in vitro model of wound healing (scratch assay) as a mechanism for determining how environmental contaminants such as arsenic influence cellular migration. The results demonstrate that this in vitro assay provides rapid and early indications of changes to cellular migration prior to in vivo experimentation.

Vitro Cilt hücre göç arsenik etkilerini göstermek için tahlil kaşı

Understanding the physiologic mechanisms of wound healing has been the focus of ongoing research for many years. This research directly translates into ...

Çevre

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

Bir Üç boyutlu Kollajen Matrix içindeki Hücre Göç Analizi

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Biyomühendislik

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

İçinde üç boyutlu Vitro hücre göç karakterize ortamlar yara

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated experimental procedures, while potentially lacking in precision. In vitro culture of epithelial cell lines provides a suitable platform for researching the cell migratory behavior in wound healing and the impact of treatments on these cells. The physiology of epithelial cells is often studied in non-confluent conditions; however, this approach may not resemble natural wound healing conditions. Disrupting the epithelium integrity by mechanical means generates a realistic model, but may impede the application of molecular techniques. Consequently, microscopy based techniques are optimal for studying epithelial cell migration in vitro. Here we detail two specific methods, the artificial wound scratch assay and the artificial migration front assay, that can obtain quantitative and qualitative data, respectively, on the migratory performance of epithelial cells.

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing

This manuscript describes how incision-like lesions made on cultured epithelial cell monolayers conveniently model wound healing in vitro, allowing for imaging by confocal or laser scanning microscopy, and which can provide high-quality quantitative and qualitative data for studying both cell behavior and the mechanisms involved in migration.

Mikroskopi Vitro yara iyileşmesi sırasında epitel hücre göç değerlendirilmesi için yöntemleri temel

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

Tıp

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

Vitro Hücre Göç ve Invasion Tahliller

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Biyoloji

Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective treatment. Appropriate in vitro and in vivo approaches are essential for the identification of new target molecules for drug treatments to improve the skin wound healing process. We identified the &#946;3 subunit of voltage-gated calcium channels (Cav&#946;3) as a potential target molecule to influence the wound healing in two independent assays, i.e., the in vitro scratch migration assay and the in vivo dorsal skinfold chamber model. Primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) acutely isolated from wild-type (WT) and Cav&#946;3-deficient mice (Cav&#946;3 KO) or fibroblasts acutely isolated from WT mice treated with siRNA to down-regulate the expression of the Cacnb3 gene, encoding Cav&#946;3, were used. A scratch was applied on a confluent cell monolayer and the gap closure was followed by taking microscopic images at defined time points until complete repopulation of the gap by the migrating cells. These images were analyzed, and the cell migration rate was determined for each condition. In an in vivo assay, we implanted a dorsal skinfold chamber on WT and Cav&#946;3 KO mice, applied a defined circular wound of 2 mm diameter, covered the wound with a glass coverslip to protect it from infections and desiccation, and monitored the macroscopic wound closure over time. Wound closure was significantly faster in Cacnb3-gene-deficient mice. Because the results of the in vivo and the in vitro assays correlate well, the in vitro assay may be useful for the high-throughput screening before validating the in vitro hits by the in vivo wound healing model. What we have shown here for wild-type and Cav&#946;3-deficient mice or cells might also be applicable for specific molecules other than Cav&#946;3.

Here, we present a protocol for an in vitro scratch assay using primary fibroblasts and for an in vivo skin wound healing assay in mice. Both assays are straightforward methods to assess in vitro and in vivo wound healing.

In Vitro ve In Vivo In Vivo Analizi Yara İyileşmesi için Scratch Migration Tahlil ve Dorsal Skinfold Odası

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Cell migration is an important process that influences many aspects of health, such as wound healing and cancer, and it is, therefore, crucial for developing methods to study the migration. The scratch assay has long been the most common in vitro method to test compounds with anti- and pro-migration properties because of its low cost and simple procedure. However, an often-reported problem of the assay is the accumulation of cells across the edge of the scratch. Furthermore, to obtain data from the assay, images of different exposures must be taken over a period of time at the exact same spot to compare the movements of the migration. Different analysis programs can be used to describe the scratch closure, but they are labor intensive, inaccurate, and forces cycles of temperature changes. In this study, we demonstrate an optimized method for testing the migration effect, e.g. with the naturally occurring proteins Human- and Bovine-Lactoferrin and their N-terminal peptide Lactoferricin on the epithelial cell line HaCaT. A crucial optimization is to wash and scratch in PBS, which eliminates the aforementioned accumulation of cells along the edge. This could be explained by the removal of cations, which have been shown to have an effect on keratinocyte cell-cell connection. To ensure true detection of migration, pre-treating with mitomycin C, a DNA synthesis inhibitor, was added to the protocol. Finally, we demonstrate the automated optical camera, which eliminates excessive temperature cycles, manual labor with scratch closure analysis, while improving on reproducibility and ensuring analysis of identical sections of the scratch over time.