Biz geliştirmek ve fiili duruma bu teknikleri rafine yardımcı eski üyeleri laboratuarının sayesinde vermek istiyorum: Dr Celia Martinez-Mora; Dr Anna Mrowiec, Dr Catalina Ruiz-Canada'da ve Dr Antonia Alcaraz-García. Biz kuvvetle bu tekniklerin gelişimi desteklemek için hastane Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca için borçlu bulunmaktadır. Ayrıca Instituto de Salud Carlos III, Fondo de Investigaciones Sanitarias. Estatal planı ben + D + ı ve Instituto de Salud Carlos III-Subdirección General de Evaluación y Fomento de la Investigación (Grant No: PI13/00794); www.isciii.es. Fondos FEDER "Una manera de hacer Europa". Biz Ayrıca Universidad de Murcia, IMIB-Arrixaca ve FFIS idari destek ve yardım için teşekkür ederiz. Sonunda, biz özel bir Doktor Isabel Martínez-Argudo ve Facultad de Ciencias Ambientales y Bioquímica, kampüs Tecnológico de la Fábrica de Armas, Universidad Castilla la Mancha, Toledo isteyerek sigorta içinde tür destek için teşekkür vermek istiyorum Biyomedikal ve biyoteknoloji filme bu kağıt parçası mümkün kılmak için laboratuvar.

1. yapay yara karalama tahlil için nicel çalışmalar
<ol>
	<li>Hücre monolayer hazırlık
	<ol>
		<li>Steril koşullarda çalışma, tohum ve kültür şişe serum takıma orta kullanarak Mv1Lu veya HaCaT epitel hücrelerinde büyür. Orta bir kez her 24-48 h yenileyin. Hücrelerin % 80 izdiham ulaştıktan sonra hücreleri kullanarak bir uygun yöntemi, Yani, trypsinization9bağlantısını kesin. Not: Mv1Lu ve epitel hücre hatları EMEM ve DEMEM kültür ortamına kullanarak kültürlü HaCaT sırasıyla, 2 mM L-glutamin ile desteklenmiş ve % 5 CO2kontrollü bir atmosfer ile 37 ° C'de inkübe. Her hücre kültürünü iyice hücre toplama ve zamanlama tam confluency ulaşmak için gerekli belirlemek için denetlesinler gerekir. Genellikle Mv1Lu veya HaCaT hücreler için 2-4 x 104 ya da 4-6 x 104 hücreleri/iyi, sırasıyla, bir 175 cm2 kültür şişeye numaralı seribaşı ve %80 35 x 106 Mv1Lu ya da 1 x 107 HaCaT hücreleri izdiham verir.</li>
		<li>Ya bir 12-şey ya da 24-şey kültür tabağına, her kuyuya hücre 2 mL tohum. Her 24-48 h emin olun cep numaraları sonra 2-3 gün sonra % 100 izdiham ulaşmak için yüksek orta yenileyin.</li>
		<li>Hücreleri izdiham ulaştıktan sonra serum takıma orta kaldırmak ve iki kez taze orta ile serum-Alerjik yıkayın. Hücreler serum-Alerjik orta 24 h için tırmalamak önce tutmak. Not: Mv1Lu veya HaCaT hücreleri özel substrat gereksinimleri yoktur; Ancak, hücre hatlarında serum serbest koşullarda kendiliğinden ayırma için duyarlı, Poli-L-lizin çözüm kullanarak kültür plaka yüzeyi öncesi kaplama10düşünülmelidir.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Monolayer tırmalamak
	<ol>
		<li>Steril bir ortamda çalışmaya, kültür monolayer sıkıca 20 µL veya 200 µL steril micropipette uç, bağlı olarak istenilen sıfırdan genişliği dar sonuna sürükleyerek kaşı. İpucu boşluk homojenliği en üst düzeye çıkarmak için kültür yüzeye dik tutun.<ol>
			<li>Kültür plakaları açıkça hücre monolayer izlemek için karanlık bir yüzeye yerleştirin. Gerekirse, iki dikey çizik (çapraz şeklinde) üzerine 4 geçiş alanları kadar çalışmaya her iyi gerçekleştirin.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Müstakil hücreler kültür orta ve yavaşça ekleyerek taze serum-Alerjik orta hafifçe kaldırarak yıkayın. İki kere tekrar edin veya en ekli olmayan hücreleri kaldırıncaya kadar.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Deneysel işlem ve veri toplama
	<ol>
		<li>Her şey bir CCD kamera birleştiren bir ters faz kontrast mikroskobu kullanarak sıfırdan farkı merkezli 4 ön arıtma referans görüntü alabilir. Mikroskop alan çizikler bitişik kesişimine kenarına yerleştirerek ilgi alanları seçin. Not: Genellikle, 10 x büyütme ve 1280 x 1024 piksel görüntü boyutu kullanarak görüntüleri elde edilir. Yardımcı olur kolay Yerelleştirme ve doğrulama şey başına en çok 4 ölçümler için yukarıda açıklandığı gibi ilgi alanları seçme.</li>
		<li>Bir kez tüm görüntüleri elde, tedavi wells belirlemek; Wells orta seçili tedavileri içerir taze orta ile değişimi. Not: Alternatif olarak, kimyasal madde veya kültür orta homojenliği rahatsız etmeyin bileşikler için Tedaviler doğrudan kültür ortamın aşılanmış.</li>
		<li>Gözlem ulaşmak % 90'ı karalama boşluğu kapatma koşullarda kadar çizik plaka (37 ° C de % 5 CO2içeren bir kontrollü atmosfer) kuluçkaya. Tam kapatma kaçının. Not: Toplam boşluğu kapatma tedavi sonrası resim koleksiyonu olarak başvuru alanları algılanabilir değildir ve gap kapanış zaman başvurusunu kurulamıyor kapatıldı. Mv1Lu veya HaCaT hücre söz konusu olduğunda, 16-19 h % 90 izdiham ulaşmak için gereklidir.</li>
		<li>Hücre geçiş hücreleri düzelterek dur; Yavaşça 1 mL % 4 formalin PBS içinde deneysel kültür orta yerine. 15 dakika dik, kuluçkaya</li>
		<li>Aşırı formalin kaldırmak için hücreleri yıkayın; Yavaşça kuyuları çözümde taze PBS ile değiştirin. En az iki kere tekrar edin. Not: Bu aşamada, mühürleme sonra plakaları 4 ° C'de süresiz olarak saklanır.</li>
		<li>Tedavi sonrası referans görüntü her şey çizilmemesi sonra yakalanan başvuru alanlarından alabilir. Aynı ekipman (CCD kamera birleşmeyle ters optik faz kontrast mikroskop) ve eşleşen resim ayarları (büyütme ve dijital çözünürlük/yoğunluğu) kullanın. Not: tek tek geçir ve bağımsız olarak (örneğin, MDA-MB-231 meme kanseri insan hücreleri) tutarlı bir cephe oluşumu boşluğu doldurmak hücreler için tek tek hücre geçiş hızları hesaplanması zaman ders görüntüleri izin verebilir.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Görüntü analizi ve miktar göç
	<ol>
		<li>Görüntü işleme yazılımı (örneğin, ImageJ) kullanarak, sıfırdan farkı sınırlarını tanımlamak ve dört ölçüm sonuçları ön arıtma resimler için boşluk yüzey belirlemek. "Ön arıtma boşluğu yüzeyi" olarak veri kaydı (PREGAP). Tedavi sonrası resimler için aynı işlemi tekrarlayın. "Tedavi sonrası boşluğu yüzeyi" olarak veri kaydı (POSTGAP).<ol>
			<li>Kaydedilen görüntü ImageJ kullanarak açın. "Resim" menüsündeki resim türü 8 bit olarak ayarlayın. "İşlem" menüsünden "filtreler" alt menüsüne gidin ve "varyans" filtreleme uygulayın.</li>
			<li>"Resim" menüsündeki "ayarlama" alt menü ve siyah ve beyaz set eşik girin (B &#38; W), "Koyu arka plan" seçilmediğinden emin olun. "İşlem" menüsünden "ikili" alt menüsüne gidin ve "boşluğu doldurman gerek" seçin.</li>
			<li>"Analiz" menüsündeki "ölçümleri Kur" seçeneğini ve "alan" harekete geçirmek. Sonra böylece boşluğu sınırlayan geçirme kenar dağılımı aşağıdaki ölçülebilir alanı çizin.</li>
			<li>"Analiz" menüde "parçacıklar analiz" seçin ve "Toplam alan" değerlerini çizilmiş alan yüzey için kaydedin.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>PREGAP ve POSTGAP Toplam alan değerleri her el bireysel örnekleri için mutlak geçiş boşluğu yüzey ölçümleri fark olarak ölçmek için elektronik tablodaki tanıtmak: PREGAP − POSTGAP [rasgele birimleri]. Ayrıca, mutlak göç veri denetimi örnekleri her durumun normale: (örnek / kontrol) * 100 [%]. Not: tek tek geçir ve tutarlı bir açık, (örneğin, MDA-MB-231 meme kanseri insan hücreleri) oluşumu bağımsız olarak boşluğu doldurmak hücreler için mutlak geçiş merkezi bir istila hücreleri sayarak hesaplanabilir ya da şerit denetimi ya da tedavi örnekleri.</li>
		<li>(Bkz. şekil 1) miktar çıkışlarını arsa. İstatistiksel analizi gerçekleştirin.</li></ol></li></ol>Öğrenci t-Testi ne zaman iki koşul veya koşullar daha fazla sayıda için Varyans analizi testi karşılaştırma düşünün.
	
	

2. yapay geçiş açık tahlil topografik Etüdleri
<ol>
	<li>Hücre monolayer hazırlık
	<ol>
		<li>Plaka'nın yüzeyi tamamen kaplı kadar steril koşullarda çalışma, boş kültür levha sterilize yuvarlak coverslips bir katman yer. Not: 12 ve 33 coverslips kadar 5 cm ve 10 cm Çap Kaplamalar, anılan sıraya göre uygun.</li>
		<li>Kültür plaka üzerinde hafifçe 2-3 gün sonra % 100 izdiham sağlar bir konsantrasyon hücreleri yeterli bir hacmi tohum. Steril micropipette bahşiş ile hafif basınç uygulayarak yüzen coverslips önlemek ve hiçbir coverslip komşu coverslips çakışıyor emin olun. Orta her 24-48 h yenileyin. Not: Her hücre kültürünü iyice hücre toplama ve zamanlama tam confluency ulaşmak için gerekli belirlemek için denetlesinler gerekir. Genellikle Mv1Lu veya HaCaT hücreler için sırasıyla, 2-3 x 106 veya 2.5-4 x 106 hücreler/10 cm-Çap plaka, seribaşı. Küçük tabak için hücre sayıları ölçekli olmalıdır.</li>
		<li>Hücreleri izdiham ulaştıktan sonra serum takıma orta kaldırın ve taze serum-Alerjik orta ile değiştirin. Yapay yara yapılmadan önce hücreleri serum-Alerjik orta 24 saat tutun. Not: Mv1Lu veya HaCaT hücreleri özel substrat gereksinimleri yoktur; Ancak, hücre hatlarında serum serbest koşullarda kendiliğinden ayırma duyarlı, Poli-L-lizin çözüm kullanarak kültür yüzey öncesi kaplama10düşünülmelidir.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Monolayer yaralama
	<ol>
		<li>Steril cımbız kullanarak, yavaşça bir coverslip taze serum-Alerjik orta içeren bir temiz 10 cm tabak taşıyın. Coverslip çevre cımbız ile tutarak monolayer zarar vermemek. Coverslip kırılması neden olabilir aşırı basınç kaçının.</li>
		<li>Yapay yaraları sterilize jilet enine bir çizgide coverslips Merkezi sürükleyerek oluşturun. 3-4 mm ve ileri geri, Merkezi monolayer şerit tamamen kaldırmak için sürükleyin. Hiçbir hücre artıkları yaralı kenarlarına bağlı kalır emin olun. Not: üzerinde 12 mm çapında coverslip, belgili tanımlık kesme sırasında yapılan orta coverslip. Hücrelerin coverslip aşağıdaki adımlarda, devirme önlemek için yeterince büyük ana açık karşısında (en az 2 mm genişliğinde) bir çizgi bıraktığınızdan emin olun.</li>
		<li>Yaralı coverslips hücreleri, bir temiz 6-şey plaka içeren en az 2 mL taze serum-Alerjik ortamına karşı karşıya aktarabilirsiniz. 4 yaralı coverslips/iyi uygun.</li>
		<li>Yavaşça iki kez taze kullanarak yıkayın müstakil hücre kaldırma için serum-Alerjik orta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Deneysel bir işlem ve örnekleme
	<ol>
		<li>Yavaşça Wells orta seçili tedavileri içerir taze orta ile değişimi. Not: Alternatif olarak, kimyasal madde veya kültür orta homojenliği rahatsız etmeyin bileşikler için Tedaviler doğrudan kültür ortamın aşılanmış. Herhangi bir potansiyel hücre dekolmanı önlemek için dikkatli olun.</li>
		<li>Bir hücre İnkübatör (37 ° C, % 5 CO2) içinde plaka için istenen deneysel zamanlama tutmak.</li>
		<li>Hücre geçiş hücreleri düzelterek dur; Yavaşça 1 mL % 4 formalin PBS içinde deneysel kültür orta yerine. 15 dakika dik, kuluçkaya Not: Ders deneyler süre örnekleri kültür plaka kaldırın ve bunları diğer, devam eden deneysel koşullar etkileyen formalin duman önlemek için ayrı bir tabak içinde düzeltmek.</li>
		<li>Aşırı formalin kaldırmak için hücreleri yıkayın; Yavaşça kuyuları çözümde taze PBS ile değiştirin. En az iki kere tekrar edin. Not: Bu aşamada, mühürleme sonra plakaları 4 ° C'de süresiz olarak saklanır.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ayirt (Eğer) ve topolojik analizi
	<ol>
		<li>Eğer boyama gerçekleştirmek ve görüntüleme bireysel coverslips üzerinde başka bir3,4,11bölümünde.<ol>
			<li>10 dakikadır coverslips % 0,3 Triton X-100 çözümde PBS çeker tarafından permeabilize.</li>
			<li>Blok 30 dk ertesi gün engelleme eriyik istimal için: %0,3 sığır Serum albümin; % 10 fetal sığır Serum; %5 yağsız süt; %0,3 Triton X-100 PBS çözümde. Not: süt olmadan çözüm engelleme olabilir önceden hazırlanmış ve -20 ° C'de depolanan</li>
			<li>Nemli bir oda içinde oda sıcaklığında 1 h için birincil antikor süt içermeyen engelleme çözümde seyreltilmiş ile kuluçkaya. Coverslips ters uygun dağıtım sağlamak için 15 µL antikor çözümde yerleştirin. Not: Antikor çalışma seyreltme değişkendir ve antikor kullanılıyor bağlı olacaktır. Örneğin, 1/100 seyreltme tavşan anti-c-Jun antikor gerektirir.</li>
			<li>Çözümde bir içinde % 0,1 Triton X-100 PBS coverslips daldırma tarafından üç kez yıkayın.</li>
			<li>İkincil antikor engelleme arabelleği süt ücretsiz 30 min için seyreltilmiş coverslips kuluçkaya. Not: Antikor çalışma seyreltme değişkendir ve antikor kullanılıyor bağlı olacaktır. Örneğin, keçiyi-anti-tavşan (488) 1/400 seyreltme için en iyi çözünürlük gerektirir. Phalloidin ve Höchst 33258 gibi diğer etiketleme reaktifler kuluçka arabelleğe bu aşamada eklenebilir.</li>
			<li>Üç kez PBS % 0,1 Triton X-100 çözümde coverslips daldırma tarafından yıkayın.</li>
			<li>Coverslips ters içinde mikroskop slayt üzerinde yerleştirilen bir 10 µL montaj medya damla (örneğin, Vectashield) bağlayın. Slaytları gecede montaj orta sertleştirme için oda sıcaklığında karanlıkta bırakın. Daha sonra karanlıkta 4 ° C'de süresiz olarak depolar.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Ya epifluorescence ya da yapısal değişiklikler geçirme ön kenarında meydana gelen confocal mikroskobu görüntüleri elde edilir. Not: Topolojik çalışmalar iç monolayer geçirme açık resimler fayans tarafından gerçekleştirilir. Yarı nicel çalışmalar yerel Floresans yoğunluklarda yazılım tabanlı analiz tarafından yapılır.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Singer, A. J., Clark, R. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10471461">Cutaneous wound healing.</a> N Engl J Med. 341 (10), 738-746 (1999).</li>
<li>Davidson, J. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9710378">Animal models for wound repair.</a> Arch Dermatol Res. 290, Suppl . S1-S11 (1998).</li>
<li>Alcaraz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amniotic+Membrane+Modifies+the+Genetic+Program+Induced+by+TGFss%2C+Stimulating+Keratinocyte+Proliferation+and+Migration+in+Chronic+Wounds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Amniotic Membrane Modifies the Genetic Program Induced by TGFss, Stimulating Keratinocyte Proliferation and Migration in Chronic Wounds.</a> PLoS One. 10 (8), e0135324(2015).</li>
<li>Ruiz-Canada, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amniotic+membrane+stimulates+cell+migration+by+modulating+Transforming+Growth+Factor-beta+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Amniotic membrane stimulates cell migration by modulating Transforming Growth Factor-beta signaling.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2017).</li>
<li>Schmierer, B., Hill, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta-SMAD+signal+transduction%3A+molecular+specificity+and+functional+flexibility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">TGFbeta-SMAD signal transduction: molecular specificity and functional flexibility.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 970-982 (2007).</li>
<li>Hu, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FAK+and+paxillin+dynamics+at+focal+adhesions+in+the+protrusions+of+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">FAK and paxillin dynamics at focal adhesions in the protrusions of migrating cells.</a> Sci Rep. 4, 6024(2014).</li>
<li>Martinez-Mora, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroin+and+sericin+from+Bombyx+mori+silk+stimulate+cell+migration+through+upregulation+and+phosphorylation+of+c-Jun%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Fibroin and sericin from Bombyx mori silk stimulate cell migration through upregulation and phosphorylation of c-Jun.</a> PloS one. 7 (7), e42271(2012).</li>
<li>Bernabe-Garcia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oleanolic+acid+induces+migration+in+Mv1Lu+and+MDA-MB-231+epithelial+cells+involving+EGF+receptor+and+MAP+kinases+activation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Oleanolic acid induces migration in Mv1Lu and MDA-MB-231 epithelial cells involving EGF receptor and MAP kinases activation.</a> PLoS One. 12 (2), e0172574(2017).</li>
<li>Huang, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin-induced+proteome+alteration+during+cell+subculture+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Sci%22%5BJournal%5D)">Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells.</a> J Biomed Sci. 17, 36(2010).</li>
<li>Liberio, M. S., Sadowski, M. C., Soekmadji, C., Davis, R. A., Nelson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+tissue+culture+coating+substrates+on+prostate+cancer+cell+adherence%2C+morphology+and+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differential effects of tissue culture coating substrates on prostate cancer cell adherence, morphology and behavior.</a> PLoS One. 9 (11), e112122(2014).</li>
<li>Pierreux, C. E., Nicolas, F. J., Hill, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor+beta-independent+shuttling+of+Smad4+between+the+cytoplasm+and+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor beta-independent shuttling of Smad4 between the cytoplasm and nucleus.</a> Mol Cell Biol. 20 (23), 9041-9054 (2000).</li>
<li>Barrientos, S., Stojadinovic, O., Golinko, M. S., Brem, H., Tomic-Canic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factors+and+cytokines+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+repair+and+regeneration%3A+official+publication+of+the+Wound+Healing+Society+%5Band%5D+the+European+Tissue+Repair+Society%22%5BJournal%5D)">Growth factors and cytokines in wound healing.</a> Wound repair and regeneration: official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 16 (5), 585-601 (2008).</li>
<li>Ansell, D. M., Holden, K. A., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+wound+repair%3A+Are+they+cutting+it%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Animal models of wound repair: Are they cutting it?</a> Exp Dermatol. 21 (8), 581-585 (2012).</li>
<li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="https://search-proquest-com.remotexs.ntu.edu.sg/openview/50d2937ff21b6f438b4d7d0ce03f4186/1?pq-origsite=gscholar&cbl=40569">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).</li>
<li>Insausti, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amniotic+membrane+induces+epithelialization+in+massive+posttraumatic+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regen%22%5BJournal%5D)">Amniotic membrane induces epithelialization in massive posttraumatic wounds.</a> Wound Repair Regen. 18 (4), 368-377 (2010).</li>
<li>Wu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+arrest+in+G0%2FG1+phase+by+contact+inhibition+and+TGF-beta+1+in+mink+Mv1Lu+lung+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cell cycle arrest in G0/G1 phase by contact inhibition and TGF-beta 1 in mink Mv1Lu lung epithelial cells.</a> Am J Physiol. 270 (5 Pt 1), L879-L888 (1996).</li>
<li>Boukamp, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+keratinization+in+a+spontaneously+immortalized+aneuploid+human+keratinocyte+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line.</a> J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).</li>
<li>Marshall, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarshall%2C+J+%22Cell+Migration%3A+Developmental+Methods+and+Protocols%22">Cell Migration: Developmental Methods and Protocols</a>. Wells, C. M., Parsons, M. , Humana Press. 97-110 (2011).</li>
<li>Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. <a target="_blank" href="https://www-sciencedirect-com.remotexs.ntu.edu.sg/science/article/pii/S2214030116300074">An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells.</a> Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).</li>
<li>Szybalski, W., Iyer, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosslinking+of+DNA+by+Enzymatically+or+Chemically+Activated+Mitomycins+and+Porfiromycins%2C+Bifunctionally+%22Alkylating%22+Antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Fed+Proc%22%5BJournal%5D)">Crosslinking of DNA by Enzymatically or Chemically Activated Mitomycins and Porfiromycins, Bifunctionally "Alkylating" Antibiotics.</a> Fed Proc. 23, 946-957 (1964).</li>
<li>Tomasz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitomycin+C%3A+small%2C+fast+and+deadly+%28but+very+selective%29%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitomycin C: small, fast and deadly (but very selective).</a> Chem Biol. 2 (9), 575-579 (1995).</li>
<li>Sherry, D. M., Parks, E. E., Bullen, E. C., Updike, D. L., Howard, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+using+silicone+elastomer+masks+for+quantitative+analysis+of+cell+migration+without+cellular+damage+or+substrate+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh+Migr%22%5BJournal%5D)">A simple method for using silicone elastomer masks for quantitative analysis of cell migration without cellular damage or substrate disruption.</a> Cell Adh Migr. 7 (6), 469-475 (2013).</li>
<li>Dennis, E. A., Rhee, S. G., Billah, M. M., Hannun, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+phospholipase+in+generating+lipid+second+messengers+in+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Role of phospholipase in generating lipid second messengers in signal transduction.</a> FASEB J. 5 (7), 2068-2077 (1991).</li>
<li>Lampugnani, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+into+a+wounded+area+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell migration into a wounded area in vitro.</a> Methods Mol Biol. 96, 177-182 (1999).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması olduğunu ilan eder.

Cilt veya mukoz kesintileri bariyer fonksiyonu fibroblastlar veya epitel ve bağışıklık hücreleri de dahil olmak üzere çok sayıda hücre tipleri eylemleri ile geri yüklenir. Manivela, tabi bu hücreler karmaşık bir işlem apoptosis, nükleer silahların yayılmasına karşı farklılaşma ve önemlisi, fibroblast ve epitel hücre göç, son mekanizması kesintiye dokusunun restorasyonu için sorumlu olan ve Tam da yara tedavisi düzenleyici potansiyelini belirlenirken epitel hücreleri, fizyolojik davranışını tanımlayan kapatma yüzeysel epitel boşluk1,12 böylece, hücre geçiş eğitim yardımcı olur şifa.
Farklı araştırma hayvan modellerinde yapay yaraları yapmadan fizyolojik şartlarda2yakınındaki karmaşık bu süreçte çoğaltılması ve patolojik bazı koşullar değerlendirilmesi veya ilaç etkileri için böylece olanağı sağlar tedaviler13. Ancak, bu yaklaşım genellikle pahalı ve karmaşık lojistik yanı sıra veri gecikmeli moda13' te oluşturabilir külfetli deneysel prosedürler sonuç. Aksine, vitro hücre kültürü hücrelerde süreci şifa yara dahil davranışını araştırma için daha uygun bir çerçeve sağlar. Epitel hücrelerinin birincil hücre kültürü uygun bir seçenek teşkil ederken, elde etmek ve veri toplama karmaşık hale getirebilir hücreleri işlemek zor olabilir. Örneğin, ek olarak tipik düşük geçiş kısıtlama birincil kültürlerin birincil insan lenfositi fibroblast büyüme vitro3için katman besleme gerekir. Aksine, Mv1Lu veya HaCaT, gibi köklü epitel hücre kültür çizgiler o özellikleri davranışı ve özellikleri bu birincil kültür hücreleri3,4gibi bir engel-Alerjik araştırma modeli oluşturur, 14,15. Doğrusu, yara iyileşmesi çalışma için bu iki hücre satırları kritik özellikleri geçirin ve yayılması nedeniyle hücre hücre iletişim inhibisyon izdiham16,17üzerine durdurmak için yeteneklerini korumak.
Kazı-kazan deneyleri göçmen yeteneklerini farklı hücre tipleri, özellikle epitel ve kanser hücrelerinin miktarının için güvenilir ve çok yönlü bir yöntemdir. Kanser hücrelerinin durum için invaziv potansiyeli değerlendirmesi için karalama yöntemi önerdi. Ancak, bu yaklaşım daha belirli yöntemleri hücre dışı matriks18,19nüfuz için gerekli metalloproteases ifade dayanarak karşılaştırıldığında invasiveness gösterge yetersiz kalıyor. Aksine, kazı-kazan deneyleri epitel hücrelerinin göçmen performans ve bu özellik üzerinde farklı tedaviler etkisini değerlendirmek için güvenilirdir. Kanser hücreleri satırları aksine, hangi sık sık kötü uyum ve yetenek çeşitli katmanları, Mv1Lu, HaCaT ve "her ikisi de bağlı olarak bir süreç içinde onların kenar boşluklarını genişletmek diğer epitel hücre hatları sıkıca ilişkili form büyüme adalar─▒", büyümeye göstermek nükleer silahların yayılmasına karşı ama daha da önemlisi üzerinde hücre göç. Sonuç olarak, seyrek veya alt Konfluent hücre yoğunluğu koşulları geleneksel göçmen fizyolojisi üzerinde farklı tedaviler etkileri eğitimi için kullanılır; özellikle sonraki moleküler biyoloji teknikleri uygulandığında, aktif geçirme oranı en üst düzeye çıkarma hücreleri ise bu hücre çevre temas inhibisyonu en aza indirir. Ancak, epitel hücreleri için birleşmesi olmayan koşullar önemli önceden varolan temas inhibisyonu etkiler, örneğin epigenetik düzenleme şeklinde hariç riski teşkil. Böylece, yara iyileşmesi çalışmaya Konfluent koşulları modeli artan sadakat görüşmek.
Kesin tahminleri elde etmek için epitel hücre katmanı biçimi etkilemeden veya göç-e doğru katkıda bulunmak eşlik eden faktörler ele alınması gerekir. İzdiham isteniyorsa, bu aşırı hücre yoğunluğu ya da çok katmanlı kültürler, bu koşullar olumsuz etkileyebilecek beri önlemek önemlidir. Bu nedenle, nükleer silahların yayılmasına karşı yaygın açlık serum-Ücretsiz medya ya da geri dönüşümsüz tutuklamak hücre çoğalması DNA crosslinking3,20tarafından, Mitomycin C gibi kimyasal ilavesi denetlenir 21. belirli hücre çizgileri; davranışını ikisinden biri kullanımına dayanıyor Mitomycin C özellikle ne zaman indirimli serum takviyesi büyük hücre dekolmanı önlemek için gerekli belirtilir. Bu durumda HEK-293T hücreler için önceden Poli-L-lizin kullanarak kültür yüzey kaplama nerede Mytomycin C tedavi önlemek için iyi bir seçenek. Serbest geçiş alter inflamatuar faktörlerin de ele alınması gerekir. Farklı stratejiler, epitel yüzeyi ile sıfırdan tahlil22elde bozulma taklit etmek için silikon ekler üzerinde ağırlıklı olarak kullanılmaktadır. Silikon parça çıkardıktan sonra hücre geçiş izin önceden var olan boşluklar ekler üretmek iken, karalama yöntemi doğrudan boşluğu oluşturmak için epitel monolayer bazılarını kaldırmayı üzerinde dayanır. Tercih boşluğu oluşturmak nasıl kültür yüzey kaplama (Yani, kültür plaka veya Poli-L-lizin) koruma yeteneği ekler üzerinde zararlardan tırmalamak sırasında ayrıca olabilir hasarlı hücreleri faktörler sürümünden en aza indirerek dayanır hücre kültür davranışı23uzlaşma. Bu özelliklere geçirmek için yeteneği kanser hücrelerinin değerlendirilmesi Yani, bazı deneysel ayarları için yararlı olabilir, ancak deneyim önemli sakıncaları ekler çalışmalar şifa yarada kullanmak için bulduk. Mv1Lu hücreleri hücre monolayer silikon parçaları kaldırılması üzerine, yırtılma istemeden sonuçları silikon Ekle dış yüzeyine bağlama yeteneğine sahiptirler. Ayrıca, her ne kadar HaCaT hücreleri için silikon eklemek değil, azalmış yetenek Ekle tarafından oluşturulan boşluklar geçirmek bu hücreler için bulduk. Bu ölçüde, inflamasyon ve geçiş sıkıca ilişkili yanıtlara ve bunlar HaCaT hücrelerde yara iyileşmesi bağlamında birlikte kritik gibi görünüyor. Kültür yüzey tırmalama için plastik bir ipucu uygulama yeteneği hücre yeniden durumunda HaCaT hücreleri, boşluğu doldurmak için hiçbir belirgin sonucu vardır Ayrıca, böyle bir davranışı hücre dışı matriks kalıntıları boşluğu içinde geçişinde yol gösteriyor doğal bir yara dermiste benzer bir biçimde.Ancak, yara yapmak için plastik bir ipucu kullanımı her zaman aynı boyut boşluk işlemez gibi değişim ana kaynağı tırmalamak prosedür kendisini, kalır. Tutarsızlık baskı ve çizik zaman ucunda konumunu nedeniyle farklı örnekleri arasında % 20'e kadar varyasyonları gözlemledim. Bu varyasyonlar daha katı bir nesne ile monolayer yaralama tarafından ele alınması; Ancak, herhangi bir çizik plastik yüzey hücreleri serbest dolaşımı tehlikeye. Yani, ilk çizik değişimler geçiş hesaplamak için dikkate alınmalıdır; tipik olarak, koşul başına ölçüm sayısını artırarak.
Miktar ek olarak, klasik Eğer teknikleri ile birlikte yaralama yordamları uygulama niteliksel hücre göç moleküler süreçlerinin değerlendirebilirsiniz. Coverslips üzerinde büyümeye epitel hücrelerinin iyi bilmek bir özelliktir; Geçmişte, çizik varyasyonları deneyleri dahil hücreleri üzerinde farklı koşullar ardından sabitleme ve yara Tirmigi deneysel Kur24içinde karşılaştırma için boyama maruz coverslips geçirme. Burada, monolayers coverslips üzerinde büyüyen geniş boşluklar oluşturma deneysel zaman içerisinde3,4,7genişletmek için sağlar bulduk. Ayrıca, bu deneylerde artar potansiyel hassas herhangi bir hücre ve hücre altı mekanizmaları incelemek için yordam algılama yetenekleri dahil ve sadece antikorlar bu teknik için uygun kullanılabilirliği ile sınırlıdır ve hücreleri ilgi. Eğer için kullanılan coverslips örnekleri için genişletilmiş koruma izin mikroskop slaytlar monte edilmiştir. Bu uygulama uzun çalışma süreleri, "döşeme" yaklaşımlar burada ve başka yerlerde3,4,7görücüye gibi gerektiren deneysel kurulumları yardımcı olur. "Döşeme" strateji kayma desenleri mekanizmaları geçişinde ilgili yeniden yapılandırma için zamansal veri ile entegre ederken, yazılım analiz araçları uygulanması yarı nicel değerlendirmeler üzerinde yerel Floresans dayalı sağlayabilir yoğunluk ve elde edilen bilgilerin kalitesi daha da zenginleştirmek. Deneyim, döşeme da hücre konumsal bilgi bu tür bir tahlil proteinlerin ifade için eğitim imkanı sunuyor. Bu konum bilgileri anlamak ve hücre göç, özellikle kurulumları epitel hücreleri konumunu göçmen davranışının3 belirlemek çok önemli olduğu farklı ajanlar etkilerini daha iyi çevirmek için çok önemli olduğu gösterilmiştir ,4,14,15.
Her iki yordamlar açıklanan basit uygulama olarak kalite veri üreten büyük kolaylık gösterir. Bu nedenle, mikroskopisi çalışmaları, temel alan bu yaklaşımlar sunan dinamikleri ve morfolojik değişiklikler epitel hücre davranışlara yer çalışmaya benzersiz ve güçlü bir çerçeve ve yaranın normal iyileşmesi sırasında tedavilere yanıt.

Epitel boşluğu son kapatılması ve kesintiye yüzey1restorasyonu için sorumlu olduğu gibi hücre göç yara iyileşmesi için gereklidir. Hayvan modellerinde yapay yaraları yapmadan karmaşık bu süreçte fizyolojik şartlarda2yakınındaki çoğaltma olanağı sağlar. Ancak, bu yaklaşım genellikle potansiyel olarak farklı süreçler, yara iyileşme süreci karmaşık doğası gereği incelenmesi için duyarlık eksikliği pahalı ve karmaşık deneysel prosedürler, sonuç.
Vitro kültür epitel hücre hatları bu hücreler yara iyileşmesi ve hücre göç davranışı üzerinde tedavinin etkilerini oynamak rol araştırma için hayvan modelleri için yararlı bir alternatif sağlar. Epitel hücrelerinin fizyolojisi tarafından Moleküler teknikleri kullanarak birleşmesi kültürler3,4,5,6kez okudu; Ancak, epitel bütünlüğünü bozulma genellikle iyi mekanik insizyon tarafından sağlanır. Hücre kültüründe bu ihmal edilebilir hücre sayısı için yara boşluğu maruz kalabileceğinizi ve moleküler biyoloji teknikleri için çok küçük bir örnek temsil ettikleri anlamına gelir. Ancak, bu lezyonlar vizon akciğer epitel hücre (Mv1Lu) veya kendiliğinden ölümsüzleştirdi insan keratinosit (HaCaT) hücre gibi bazı epitel hücre hatları doğuştan gelen göçmen özelliklerini yararlanarak mikroskobik ölçek okudu olabilir satırları.
Burada nicel veriler üzerinde geçiş3,4,7,8şifa yara bağlamında epitel hücrelerinin elde etmek uygundur mikroskopi için bir yöntem açıklanmıştır. Ayrıca, biz niteliksel moleküler ve morfolojik değişiklikler üzerinde epitel monolayers geçiş sırasında meydana gelen eğitim yararlı ek yöntemler mevcut. Genel olarak, bu yöntemleri yara iyileşmesi sırasında dinamikleri ve morfolojik değişiklikler epitel hücre davranış ve yanıt-e doğru tedaviler ile ilgili çalışma için bir çerçeve sağlar.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Biowest, Nuaill&amp;eacute;, France</td><td>L0102-500</td><td>Optional 10 % FBS supplement</td></tr><tr><td>Eagles&amp;rsquo;s Minimum Essential Medium (EMEM)</td><td>Lonza</td><td>BE12 -662F</td><td>Optional 10 % FBS supplement</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Lonza</td><td>BE17-605E</td><td>Use at 2 mM</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA</td><td>DE17603A</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>T4049</td><td>Dilute as appropriate</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>P9155</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x)</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>14200-067</td><td>Dilute to 1x</td></tr><tr><td>24-well culture plates</td><td>BD FALCON//SARSTED</td><td>734-0020</td><td></td></tr><tr><td>6-well culture plates</td><td>SARSTEDT</td><td>83-3920</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal Growth Factor (EGF)</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>E9644</td><td>Used 10 ng/mL</td></tr><tr><td>Round cover glass</td><td>MENZEL-GL&amp;Auml;SER</td><td>MENZCB00120RA020</td><td>SHORT DEPTH OF FIELD</td></tr><tr><td>Reinforced razor blade no. 743</td><td>Martor (through VWR)</td><td>MARO743.50</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;l sterile aerosol pipet tips</td><td>VWR</td><td>732-0541</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;micro;l sterile aerosol pipet tips</td><td>VWR</td><td>732-0528</td><td></td></tr><tr><td>Digital camera coupled phase contrast microscope</td><td>Motic Spain</td><td>Moticam camera 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>ZEISS Microimaging, Germany</td><td>LSM 510 META</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Culture dish</td><td>BD FALCON</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit polyclonal anti c-Jun antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-1694</td><td>Used 1:100</td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG (polyclonal goat ) AF 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>Used 1:400</td></tr><tr><td>Hoechst-33258</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>14530</td><td>Used 1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red)</td><td>Invitrogen</td><td>A12381</td><td>Used 1:100</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-2323</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Skim milk</td><td>BD DIFCO</td><td>232100</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health, USA</td><td>Release 1.50i</td><td></td></tr><tr><td>Zen LSM 510 image processing software</td><td>ZEISS Microimaging, Germany</td><td>Release 5.0 SP 1.1</td><td></td></tr></tbody></table>

microscopy based methods for the assessment of epithelial cell migration during in vitro wound healing

Hücre göç yara iyileşmesi için zorunlu bir yönüdür. Yapay oluşturma araştırma hayvan modellerinde genellikle pahalı ve karmaşık deneysel prosedürler sonuçlarında potansiyel hassas eksik ise yaralar. Vitro kültür epitel hücre hatları yara iyileşmesi ve tedaviler bu hücrelerde etkisini hücre göç davranışlara araştırma için uygun bir platform sağlar. Epitel hücrelerinin fizyolojisi kez birleşmesi olmayan koşullarda okudu; Ancak, bu yaklaşım koşulları şifa doğal yara benzemeyebilir. Mekanik yollarla epitel bütünlüğünü bozan gerçekçi bir model oluşturur, ancak moleküler tekniklerin uygulanması engelleyebilir. Sonuç olarak, temel mikroskobu teknikleri epitel hücre geçiş eğitimi için en iyi durumda tüp bebek. Burada iki belirli yöntemleri, yapay yara karalama tahlil ve nicel ve nitel veri, sırasıyla, epitel hücreleri göçmen performansı üzerinde elde edebilirsiniz yapay geçiş açık tahlil, ayrıntılı.

Yapay yara karalama tahlil için nicel çalışmalar: Epidermal büyüme faktörü (EGF) promosyon göç değerlendirilmesi:
EGF epitel hücre çoğalması ve geçiş ve böylece olumlu bir denetim geçiş promosyon miktarının için iyi bilinen bir uyarıcı olduğunu. Mv1Lu ve HaCaT hücre monolayers yara karalama deneyleri içinde kullanılan ve ön arıtma resimler elde edilmiştir. 10 ng/mL EGF ile aşı sonra hücreleri için 19 h fiksasyon ve tedavi sonrası resimleri önce inkübe. Nükleer silahların yayılmasına karşı serum açlık koşulları tutarak minimumda tutuldu. Öncesi ve tedavi sonrası kümeleri resimleri ImageJ kullanarak analiz edildi ve merkezi boşluk alanları belirlenmiştir. Deney için her şey dört ölçümleri kayıt Çoğalt, çalıştırıldı. Miktar mutlak göçün yüzeyler fark hesaplanmıştır: (PREGAP − POSTGAP). Uyarılan HaCaT hücrelere (şekil 1B) karşılaştırıldığında uyarılan Mv1Lu hücreleri (şekil 1A) büyük bir göç potansiyeli vardı. Farklar keratinositler, sırasıyla cildi ve Mukoza epitel hücreleri olan hücre kaynaklar tarafından açıklanmıştır.
Yapay geçiş açık tahlil topografik Araştırmaları: hücre iskeleti uyum ve kayma ifade, C-Haziran:
Hücre göç hücre deplasman sürdürmek için sürekli ve derin değişiklikleri sitoiskeleti yapısının içerir. HaCaT hücre monolayers denetim ve stimülasyon koşullar altında geçiş açık deneyleri kullanılmaya başlanmıştır. Eğer gözlenen ve tarama mikroskobu (LSM; lazer hücre iskeleti dynamics EGF ile tedavi potentiates Şekil 2A). EGF tedavi de sinyal sağlam Mitogen-Activated Protein (harita) kinaz ve c-JUN overexpression ile sonuçlanır. LSM resimleri döşemek için kayma desenleri yapılandırılmasına olanak sağlar. Artan ifade, c-Haziran geçirme cepheye bitişik hücreleri, kolayca yazılım görüntü analizi tarafından açığa çıkarılabilir; Burada, biz hangi (2B rakam) c-JUN etiketleme karşılık yeşil kanal için bir gökkuşağı ölçek hayata.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56799/56799fig1.jpg"> 
Şekil 1. Promosyon Mv1Lu ve HaCaT hücrelerdeki EGF tarafından göçün. Faz kontrast mikroskobu görüntüleri Mv1Lu yaralı bölgeye(a)ve HaCaT (B) hücreleri kontrol koşullar altında alınan ve görüntüleri ile 10 ng/mL EGF 19 h için serum serbest koşullarda tedavi hücre karşılaştırılır. Temsilcisi Filmler sıfırdan bir boşluk ve bir 20 µL micropipette ucu ile yaralama sonra elde edilen kapatma ölçüde göster. Büyütme = 10 x; Ölçek çubuğu 100 µm. göç sayılabilir ve tedavi ve kontrol örnekleri her tahlil (rasgele adet; için alan farklılıkları varyasyonu olarak temsil hücre = AU). Arsa her koşul için sekiz bağımsız ölçümlerin temsilcisidir. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56799/56799fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56799/56799fig2.jpg"> 
Şekil 2. Aktin filamentleri ve c-JUN ifade değişiklikleri EGF geçirme HaCaT hücrelerdeki tarafından teşvik. (A) gecede 10 ng/mL EGF tedavi teşvik aktin filamentleri geçirme HaCaT hücrelerdeki biçimsel büyük değişiklikler. Hücreleri geçiş ön kontrol koşullardan sıkı bir şekilde yapılandırılmış aktin filamentleri sitoiskeleti tasvir, zavallı aktin filamentleri organizasyon geçiş ön tarafta hücreleri EGF ile tedavi gösterirken. Büyütme = 63 x; Ölçek çubuğu = 20 µm. F-aktin olduğunu renk kodlu kırmızı ve Höchst mavi renk tarafından temsil edilir. (B) IMMUNO-floresan c-JUN ifade geçirme HaCaT hücreleri üzerinde 10 ng/mL EGF tedaviden sonra çalışmaya LSM Imaging ile birlikte kullanıldığı zaman, döşeme besteleri kayma ifade desenleri ortaya koyuyor. C-Jun floresan (yeşil) görüntülerini c-Jun boyama şiddeti göstermek için sözde renk olarak çevrildi. Renk gökkuşağı ölçeği floresan yoğunluğu c-Haziran, colormaps doğru panellerinde EGF ve denetim için karşılık gelen için temsil eder. Phalloidin (kırmızı) ve Höchst-33258 (mavi) ile birlikte boyama hücre yapısı ve çekirdeği, sırasıyla göstermek için kullanıldı. Görüntüleri confocal mikroskop tarafından alındı. Artan ifade düzeyleri, nükleer c-Haziran yaklaşıyor geçirme açık alanlarda unutmayın. Ölçek çubuğu 40 µm. = <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56799/56799fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing at JoVE.com

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing

Bu el yazması kültürlü epitel hücre monolayers üzerinde yapılan nasıl kesi benzeri lezyonlar elverişli bir konuma sahip modeli şifa vitrogörüntüleme için tarafından confocal sağlayan, yarası. açıklar veya lazer tarama mikroskobu ve yüksek kaliteli sağlayabilir nicel ve nitel veri hücre davranış ve mekanizmaları geçişinde dahil çalışmak için.

Mikroskopi Vitro yara iyileşmesi sırasında epitel hücre göç değerlendirilmesi için yöntemleri temel

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

microscopy-based-methods-for-assessment-epithelial-cell-migration

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

9.3K Görüntüleme.  IMIB-Arrixaca. Bu el yazması kültürlü epitel hücre monolayers üzerinde yapılan nasıl kesi benzeri lezyonlar elverişli bir konuma sahip modeli şifa vitrogörüntüleme için tarafından confocal sağlayan, yarası. açıklar veya lazer tarama mikroskobu ve yüksek kaliteli sağlayabilir nicel ve nitel veri hücre davranış ve mekanizmaları geçişinde dahil çalışmak için.

Video: Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms including wound healing disorder. The physiological process of wound healing is highly complex. The formation of granulation tissue is a key step in this process resulting in a preliminary wound closure and providing a network of new capillary blood vessels &#8211; either through vasculogenesis (novel formation) or angiogenesis (sprouting of existing vessels). Both vasculo- and angiogenesis require functional, directed migration of endothelial cells. Thus, investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of chemical induced wound healing disorders and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention.
We assessed impaired wound healing after alkylating agent exposure and tested potential candidate compounds for treatment. We used a set of techniques outlined in this protocol. A modified Boyden chamber to quantitatively investigate chemokinesis of EEC is described. Moreover, the use of the wound healing assay in combination with track analysis to qualitatively assess migration is illustrated. Finally, we demonstrate the use of the fluorescent dye TMRM for the investigation of mitochondrial membrane potential to identify underlying mechanisms of disturbed cell migration. The following protocol describes basic techniques that have been adapted for the investigation of EEC.

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

Toksik Kimyasalların Maruz sonra Endotel Hücre Göç Değerlendirilmesi

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Gelişim Biyolojisi

Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60

The wound-healing assay is efficient and one of the most economical ways to study cell migration in vitro. Conventionally, images are taken at the beginning and end of an experiment using a phase-contrast microscope, and the migration abilities of cells are evaluated by the closure of wounds. However, cell movement is a dynamic phenomenon, and a conventional method does not allow for tracking single-cell movement. To improve current wound-healing assays, we use live-cell imaging techniques to monitor cell migration in real time. This method allows us to determine the cell migration rate based on a cell tracking system and provides a clearer distinction between cell migration and cell proliferation. Here, we demonstrate the use of live-cell imaging in wound-healing assays to study the different migration abilities of breast epithelial cells influenced by the presence of TIP60. As cell motility is highly dynamic, our method provides more insights into the processes of wound healing than a snapshot of wound closure taken with the traditional imaging techniques used for wound-healing assays.

Here, we present the real-time monitoring of cell migration in a wound-healing assay using TIP60-depleted MCF10A breast epithelial cells. The implementation of live-cell imaging techniques in our protocol allows us to analyze and visualize single-cell movement in real time and across time.

Meme epitel hücre göç TIP60 geçici tükenmesi sonra canlı görüntüleme

The wound-healing assay is efficient and one of the most economical ways to study cell migration in vitro. Conventionally, images are taken at the ...

Kanser Araştırmaları

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration and invasion abilities to understand how cancer cells disseminate, with the aim of developing new treatment strategies. Analysis of the cellular and molecular basis of these abilities has led to the characterization of cell mobility and the physicochemical properties of the cytoskeleton and cellular microenvironment. For many years, the Boyden chamber assay and the scratch wound assay have been the standard techniques to study cell invasion and migration. However, these two techniques have limitations. The Boyden chamber assay is difficult and time consuming, and the scratch wound assay has low reproducibility. Development of modern technologies, especially in microscopy, has increased the reproducibility of the scratch wound assay. Using powerful analysis systems, an &#34;in-incubator&#34; video microscope can be used to provide automatic and real-time analysis of cell migration and invasion. The aim of this paper is to report and compare the two assays used to study cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and an optimized in vitro video microscope-based scratch wound assay.

This study reports two different methods for the analysis of cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and the in vitro video microscope-based wound-healing assay. The protocols for these two experiments are described, and their benefits and disadvantages are compared.

Cep işgali ve geçiş işlemi değerlendirilmesi: Video mikroskop esaslı çizik karşılaştırılması tahlil ve Boyden odası tahlil yara

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration

Understanding the physiologic mechanisms of wound healing has been the focus of ongoing research for many years. This research directly translates into changes in clinical standards used for treating wounds and decreasing morbidity and mortality for patients. Wound healing is a complex process that requires strategic cell and tissue interaction and function. One of the many critically important functions of wound healing is individual and collective cellular migration. Upon injury, various cells from the blood, surrounding connective, and epithelial tissues rapidly migrate to the wound site by way of chemical and/or physical stimuli. This migration response can largely dictate the outcomes and success of a healing wound. Understanding this specific cellular function is important for translational medicine that can lead to improved wound healing outcomes. Here, we describe a protocol used to better understand cellular migration as it pertains to wound healing, and how changes to the cellular environment can significantly alter this process. In this example study, dermal fibroblasts were grown in media supplemented with fetal bovine serum (FBS) as monolayer cultures in tissue culture flasks. Cells were aseptically transferred into tissue culture treated 12-well plates and grown to 100% confluence. Upon reaching confluence, the cells in the monolayer were vertically scratched using a p200 pipet tip. Arsenic diluted in culture media supplemented with FBS was added to individual wells at environmentally relevant doses ranging 0.1-10 &#956;M. Images were captured every 4 hours (h) over a 24 h period using an inverted light microscope to observe cellular migration (wound closure). Images were individually analyzed using image analysis software, and percent wound closure was calculated. Results demonstrate that arsenic slows down wound healing. This technique provides a rapid and inexpensive first screen for evaluation of the effects of contaminants on wound healing.

In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration

This study focuses on an in vitro model of wound healing (scratch assay) as a mechanism for determining how environmental contaminants such as arsenic influence cellular migration. The results demonstrate that this in vitro assay provides rapid and early indications of changes to cellular migration prior to in vivo experimentation.

Vitro Cilt hücre göç arsenik etkilerini göstermek için tahlil kaşı

Understanding the physiologic mechanisms of wound healing has been the focus of ongoing research for many years. This research directly translates into ...

Çevre

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

Bir Üç boyutlu Kollajen Matrix içindeki Hücre Göç Analizi

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Biyomühendislik

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

İçinde üç boyutlu Vitro hücre göç karakterize ortamlar yara

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to stimulate cell migration. Importantly, cell migration is a rate-limiting event during the wound-healing process to re-establish the integrity and normal function of tissue layers after injury. The advantage of this method over the classical assay, which is based on a manually made scratch in a cell monolayer, is the usage of special silicone culture inserts providing two compartments to create a cell-free pseudo-wound field with a well-defined width (500 &#956;m). In addition, due to an automated image analysis platform, it is possible to rapidly obtain quantitative data on the speed of wound closure and cell migration. More precisely, the effect of two frog-skin AMPs on the migration of bronchial epithelial cells will be shown. Furthermore, pretreatment of these cells with specific inhibitors will provide information on the molecular mechanisms underlying such events.

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Here, we present a protocol to evaluate the effect of peptides on the migration of bronchial epithelial cells. This method allows for the rapid and highly reproducible obtainment of quantitative data on the speed of cell migration and wound closure.

Roman Vitro hücre göç değerlendirmek için şifa tahlil yara

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

Vitro Hücre Göç ve Invasion Tahliller

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Biyoloji

Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective treatment. Appropriate in vitro and in vivo approaches are essential for the identification of new target molecules for drug treatments to improve the skin wound healing process. We identified the &#946;3 subunit of voltage-gated calcium channels (Cav&#946;3) as a potential target molecule to influence the wound healing in two independent assays, i.e., the in vitro scratch migration assay and the in vivo dorsal skinfold chamber model. Primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) acutely isolated from wild-type (WT) and Cav&#946;3-deficient mice (Cav&#946;3 KO) or fibroblasts acutely isolated from WT mice treated with siRNA to down-regulate the expression of the Cacnb3 gene, encoding Cav&#946;3, were used. A scratch was applied on a confluent cell monolayer and the gap closure was followed by taking microscopic images at defined time points until complete repopulation of the gap by the migrating cells. These images were analyzed, and the cell migration rate was determined for each condition. In an in vivo assay, we implanted a dorsal skinfold chamber on WT and Cav&#946;3 KO mice, applied a defined circular wound of 2 mm diameter, covered the wound with a glass coverslip to protect it from infections and desiccation, and monitored the macroscopic wound closure over time. Wound closure was significantly faster in Cacnb3-gene-deficient mice. Because the results of the in vivo and the in vitro assays correlate well, the in vitro assay may be useful for the high-throughput screening before validating the in vitro hits by the in vivo wound healing model. What we have shown here for wild-type and Cav&#946;3-deficient mice or cells might also be applicable for specific molecules other than Cav&#946;3.

Here, we present a protocol for an in vitro scratch assay using primary fibroblasts and for an in vivo skin wound healing assay in mice. Both assays are straightforward methods to assess in vitro and in vivo wound healing.

In Vitro ve In Vivo In Vivo Analizi Yara İyileşmesi için Scratch Migration Tahlil ve Dorsal Skinfold Odası

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...

Tıp

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Cell migration is an important process that influences many aspects of health, such as wound healing and cancer, and it is, therefore, crucial for developing methods to study the migration. The scratch assay has long been the most common in vitro method to test compounds with anti- and pro-migration properties because of its low cost and simple procedure. However, an often-reported problem of the assay is the accumulation of cells across the edge of the scratch. Furthermore, to obtain data from the assay, images of different exposures must be taken over a period of time at the exact same spot to compare the movements of the migration. Different analysis programs can be used to describe the scratch closure, but they are labor intensive, inaccurate, and forces cycles of temperature changes. In this study, we demonstrate an optimized method for testing the migration effect, e.g. with the naturally occurring proteins Human- and Bovine-Lactoferrin and their N-terminal peptide Lactoferricin on the epithelial cell line HaCaT. A crucial optimization is to wash and scratch in PBS, which eliminates the aforementioned accumulation of cells along the edge. This could be explained by the removal of cations, which have been shown to have an effect on keratinocyte cell-cell connection. To ensure true detection of migration, pre-treating with mitomycin C, a DNA synthesis inhibitor, was added to the protocol. Finally, we demonstrate the automated optical camera, which eliminates excessive temperature cycles, manual labor with scratch closure analysis, while improving on reproducibility and ensuring analysis of identical sections of the scratch over time.