The authors thank Mike Myles, Sam Saunders, and C.W. Elton at the ECU Multimedia &amp; Technology Services for providing assistance in video production. We acknowledge the grant support from North Carolina Biotechnology Center, Golfers against Cancer, Brody Brothers Endowment Fund, American Heart Association, and ECU/Vidant Cancer Research and Education Fund (L.V.Y. and M.J.R.).

1.. Hücre Kültürü Deneyi yara kapatma <ol><li> Tripsin-EDTA solüsyonu% 0.25 ile doku kültürü hücreleri plakadan ayırın. Santrifüj ile bir 15 ml konik tüp içinde Pelet hücreleri, süpernatant aspire ve kültür ortamı hücreleri yeniden askıya. 24 saat içinde% 100 birleştiği için bir 6-çukurlu plaka içindeki hücrelerin uygun plaka. Not: Testler (örneğin, 1 x 10 6 B16F10 melanom hücrelerinin bir kuyuda tohumlanır nedeniyle hücre tipi ile de kullanılan ölçülerine% 100 izdiham elde etmek için zaman ve hücrelerin sayısını belirlemek için gerekli olabilir 6-çukurlu plaka önce yara kuşağa 24 saat). Seçenek olarak ise, 12-iyi veya 24 oyuklu plakalar kullanılabilir. Not: Varsa, hücreler yara ön-döküm yapan bir tedavi doku kültürü plaka üzerinde bir Kültür-Insert (Ibidi LLC) içine numaralı seribaşı olabilir. A Kültür-takın pipet tarafından zararlardan doku kültürü plaka yüzeyini koruyabilirsiniz. Bir Kültür-Ekle omit adım kullanılırsa1.2. </li><li> Steril bir ortamda (genellikle bir biyogüvenlik kaput) doku kültürü plakasının üst karşı sıkıca basın 200 ul pipet kullanın ve hızla hücre tek tabaka aşağı dikey bir yara olun. Farklı büyüklükte pipet istendiği yara boyut yapmak için kullanılabilmektedir. Bu yüzeye zarar verebilir gibi pipet ile doku kültürü plakası karşı aşırı güç kullanmayın. Yara ön döküm ise bu adım, ihmal edilebilir. </li><li> Dikkatli medya ve hücre artıkları aspire. Yavaş yavaş kuyunun alt kapağı ve ilave ayırma hücreleri önlemek için de duvara kadar bir kültür ortamı eklenir. Yaranın üretimi ve kontrol eden bir ilk görüntü alınmalıdır. Uygun sıcaklık ve CO2 konsantrasyonunda ayarlanmış bir kuluçka makinesi içinde doku kültürü plakayı (tipik olarak 37 ° C ve% 5 CO2). </li><li> Bir kaç zaman noktasında, her 3 saatte bir, örneğin incubat ikinci plakayı kaldırınya da bir anlık resim çekmek için ve yara kapanması kontrol etmek için ters bir mikroskop altında yerleştirin. Zaman atlamalı mikroskopi varsa, her zaman bir sıcaklık süresi ve CO 2 kontrol odası için Fotoğrafa (genellikle her 5 dakika ile başlayarak) dakika her X numarası almak. Hücre tipine bağlı olarak, yara kapanma süresi değişebilir. </li><li> Anlık resimlerin sonuçlarını analiz etmek, bir ölçek çubuğunu kullanarak diğer yaranın bir tarafındaki mesafeyi ölçün. Bir dağılım grafiği veya çubuk grafiği, örneğin Şekil 1 kullanarak analiz eder ve zamanla açık bir şekilde mevcut yara kapama. </li><li> Time-lapse fotoğrafları analiz etmek, bir video yapmak (http://rsb.info.nih.gov/ij/ serbestçe kullanılabilir) ImageJ yazılımı içine resim almak. Bu açık ImageJ yapmak için, İçe Aktar&#39;ı tıklatın ve Görüntü Sırası. Resimlerle dosyasını bulun; dosyasındaki ilk fotoğrafı tıklayın. , Dosya seçerek video kaydetmek gibi kaydedin, ve AVI. Tek göç hücreleri chara kadar görülebiliryönlü hareket cterize. Ayrıca, bu tür lamellipodia oluşumu ve arka kenar olarak geri çekilmesi morfolojik özellikleri (Şekil 2 ve ek video) de incelenebilir. </li></ol> 2.. Transwell Hücre Göç ve Invasion Testi <ol><li> Steril bir ortamda (tipik olarak bir biyo-güvenlik kapağı), bir enzimatik olmayan hücre ayrışma tamponunu ya da% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi, topak santrifüj ile hücreler kullanılarak doku kültürü hücreleri plakadan ayırmak ve mevcut medya pelet hücreleri bırakarak aspire. % 0.1 BSA (sığır serum albümini) içeren serumsuz hücre kültür ortamı içinde yeniden askıya hücreleri. Not: Tripsin-EDTA nedeniyle hücre yüzeyi 17 üzerinde çeşitli reseptörlerinin bölünme hücre göçü ve invazyonu etkileyebilir% 0.25 araştırılmaktadır hücre hattı ile ilgili olarak. Not: ml başına hücre sayısı hücrelerin büyüklüğüne bağlıdır. Ileri testler pro tohumlama yoğunluğu bulmak için gerekli olabiliriyi sonuçları vardır: Command. 24 oyuklu eklemek Transwell kullanırken tipik olarak 1 x 10 6 hücre / ml &#39;çoğu hücre tipi için iyi bir başlangıç ​​noktasıdır. Bir Transwell insert boyutları aralığı ve katma hücre sayısı için buna uygun olarak ayarlanmalıdır bulunmaktadır. </li><li> Levha 100, transwell prospektüste filtre zarı üzerine hücre çözeltisinin ul ve 37 ° C&#39;de 10 dakika boyunca inkübe ve% 5 CO2, hücreler yerleşmek için izin vermek. Not: Kullanılan transwell Zarın gözenek boyutu, belirli bir numunedeki hücrelerin kendi boyutuna bağlıdır. Hücreler, çok küçük, örneğin, bunlar göç kolaylaştırmak için gerek kalmadan gözeneklerden geçebilir ya da çok büyük olduğunda bunlar gözeneklerden uymayabilir. Birkaç transwell 3 ila mikron arasında gözenek boyutları ile uçlar, 5 um, ve hücre göçü deneyleri için 8 mikron vardır. Transwell uçlar örneğin Corning gibi firmalardan ticari olarak temin edilebilir. Not: transwell migration deneyi kolaylıkla hücre istilası tahlili gerçekleştirmek için modifiye edilebilir. Bunu yapmak transwell membran üstüne dışı matris (ECM) malzemeleri ekleyin ve sonra ECM üstüne hücre eklemek için. Örneğin, Matrigel çözülmüş ve buz üzerinde sıvılaştırılmış ve Matrigel 30-50 ul eklemek transwell 24 oyuğa ilave edilir ve bir ince jel tabakası oluşturmak için 15-30 dakika için bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde katılaştırılır. Hücre çözeltisi hücre-dışı matris boyunca işgal taklit etmek için Matrigel kaplamanın üzerine ilave edilir. Not: transwell hücre göçü ve transwell hücre işgali tahliller arasında belirgin farklılıklar vardır. Hücre göçü, transwell tahlil, bir kemo-cezbedici doğru hücrelerin kemotaktik yeteneğini ölçer. Transwell hücre istilası deneyi Ancak, hücre dışı matris boyunca genel olarak kanser metastazı veya embriyonik gelişim bulunan bir işlem hücre kemotaksisi ve hücre işgalini iki ölçer. </li><li> Bir pipet kullanarak, çok carefully, 24 oyuklu bir plaka içerisinde, alt haznesinin alt kısmına istenen kemo-cezbedici 600 ul ekleyin. Transwell yuvasını taşımadan kemo-cezbedici ekleyin ve kabarcıkları oluşmasını önlemek. Alt kuyudaki kemo-çekici sıvı kemotaktik bir gradyan meydana getirmek üzere, üst oyuğundaki membran ile temas emin olun. İnkübasyon süresi, hücre tipine ve kullanılan kemo-cezbedici bağlıdır. Not: Diğer testler kuluçka dönemi belirlemek için gerekli olabilir. Not: yapışık hücreler için, göç eden hücreler zar 1,8 diğer tarafına eklenecektir. Göç eden hücrelerin miktar adımları 2.4 (2,4-2,8 steril bir ortamda yapılması gerekmez adım) 2.8 için aşağıdakilerden yapılabilir. Yapışkan olmayan hücreler için, göç eden hücreler alt bölmede ise ortamı içine düşecektir. Göç eden hücre sayısı hemasitometre kullanılarak sayıldı ve 5 akış sitometresi edilebilir. </li><li> Plakadan transwell yuvasını çıkarın. Gerektiği gibi dikkatli bir şekilde zarar vermeden, zarın üstünden geçirilir olan medya ve kalan hücrelerin çıkarılması için birçok kez bir pamuk uçlu bir aplikatör kullanın. </li><li> Bir 24-yuvalı plaka içinde bir kuyuya% 70 etanol 600-1,000 ul ekleyin. Hücre sabitleşmesi için 10 dakika boyunca% 70 etanol içinde transwell koyunuz. 24-iyi plaka transwell parçayı çıkarın ve zarın üstünden kalan etanolü çıkarmak için bir pamuk uçlu bir uygulama aleti kullanmak. Transwell membran (genelde 10-15 dakika) kurumasını bekleyin. </li><li> Bir 24-yuvalı plaka içinde bir kuyuya% 0.2 kristal violet 600-1,000 ul eklenir ve boyama için zar içine yerleştirin. 5-10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Yavaşça bir pipet ucu ya da pamuklu çubuk ile zarın üstünden kristal mor çıkarın. Gerektiğinde çok dikkatli bir şekilde, sabit bir hücrelerini yıkama önlemek için fazla kristal Viole kaldırmak için pek çok kez damıtılmış su içine daldırma zart. Transwell membran kurumasını bekleyin. </li><li> Görüntüle, ters döndürülmüş bir mikroskop altında ve kemo-cezbedici doğru zardan geçirilir ve zarın alt (Şekil 3) üzerine takılı olan hücrelerin ortalama bir miktar elde etmek için farklı görüş alanları hücrelerin sayısı. </li></ol>

<ol>
	<li>Castellone, R. D., Leffler, N. R., Dong, L., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+tumor+cell+migration+and+metastasis+by+the+proton-sensing+GPR4+receptor.">Inhibition of tumor cell migration and metastasis by the proton-sensing GPR4 receptor.</a> Cancer Lett. 312 (2), 197-208 (2011).</li><li>Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytoskeleton+and+cancer.">The cytoskeleton and cancer.</a> Cancer Metastasis Rev. 28, (2009).</li><li>Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration:+a+physically+integrated+molecular+process.">Cell migration: a physically integrated molecular process.</a> Cell. 84 (3), 359-369 (1996).</li><li>Peter, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+to+apoptotic+&amp;#34;find-me&amp;#34;+signals+is+mediated+via+the+phagocyte+receptor+G2A.">Migration to apoptotic &amp;#34;find-me&amp;#34; signals is mediated via the phagocyte receptor G2A.</a> J. Biol. Chem. 283 (9), 5296-5305 (2008).</li><li>Radu, C. G., Yang, L. V., Riedinger, M., Au, M., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+chemotaxis+to+lysophosphatidylcholine+through+the+G2A+receptor.">T cell chemotaxis to lysophosphatidylcholine through the G2A receptor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (1), 245-250 (2004).</li><li>Buul, J. D., Hordijk, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+in+leukocyte+transendothelial+migration.">Signaling in leukocyte transendothelial migration.</a> Arterioscler Thromb. Vasc. Biol. (5), 824-833 (2004).</li><li>Yang, L. V., Heng, H. H., Wan, J., Southwood, C. M., Gow, A., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+promoters+and+polyadenylation+regulate+tissue-specific+expression+of+Hemogen+isoforms+during+hematopoiesis+and+spermatogenesis.">Alternative promoters and polyadenylation regulate tissue-specific expression of Hemogen isoforms during hematopoiesis and spermatogenesis.</a> 228 (4), 606-616 (2003).</li><li>Yang, L. V., Radu, C. G., Wang, L., Riedinger, M., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gi-independent+macrophage+chemotaxis+to+lysophosphatidylcholine+via+the+immunoregulatory+GPCR+G2A.">Gi-independent macrophage chemotaxis to lysophosphatidylcholine via the immunoregulatory GPCR G2A.</a> Blood. 105 (3), 1127-1134 (2005).</li><li>Yoshida, M., Yoshida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+chemotaxis+and+regulation+of+flagellar+movement+by+Ca2+.">Sperm chemotaxis and regulation of flagellar movement by Ca2+.</a> Mol. Hum. Reprod. 17 (8), 457-465 (2011).</li><li>Albini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+and+endothelial+cell+invasion+of+basement+membranes.+The+matrigel+chemoinvasion+assay+as+a+tool+for+dissecting+molecular+mechanisms.">Tumor and endothelial cell invasion of basement membranes. The matrigel chemoinvasion assay as a tool for dissecting molecular mechanisms.</a> Pathol. Oncol. Res. 4 (3), 230-241 (1998).</li><li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+determinants+of+metastasis.">Critical determinants of metastasis.</a> Semin. Cancer Biol. 12 (2), 89-96 (2002).</li><li>Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+metastasis:+mechanistic+insights+and+clinical+challenges.">Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges.</a> Nat. Med. 12 (8), 895-904 (2006).</li><li>Roussos, E. T., Condeelis, J. S., Patsialou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+in+cancer.">Chemotaxis in cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 11 (8), 573-587 (2011).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+3D+morphology+and+functions+on+genetically+engineered+mouse+melanoma+cells.">Comparative study of 3D morphology and functions on genetically engineered mouse melanoma cells.</a> Integr. Biol. (Camb. 4 (11), 1428-1436 (2012).</li><li>Junger, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+regulation+of+neutrophil+chemotaxis.">Purinergic regulation of neutrophil chemotaxis.</a> Cell. Mol. Life Sci. 65 (16), 2528-2540 (2008).</li><li>Lazennec, G., Richmond, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+and+chemokine+receptors:+new+insights+into+cancer-related+inflammation.">Chemokines and chemokine receptors: new insights into cancer-related inflammation.</a> Trends Mol. Med. 16 (3), 133-144 (2010).</li><li>Huang, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin-induced+proteome+alteration+during+cell+subculture+in+mammalian+cells.">Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells.</a> J. Biomed. Sci. 17, (2010).</li><li>Cortesio, C. L., Boateng, L. R., Piazza, T. M., Bennin, D. A., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calpain-mediated+proteolysis+of+paxillin+negatively+regulates+focal+adhesion+dynamics+and+cell+migration.">Calpain-mediated proteolysis of paxillin negatively regulates focal adhesion dynamics and cell migration.</a> J. Biol. Chem. 286 (12), 9998-10006 (2011).</li><li>Wehrle-Haller, B., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+microtubules+and+focal+adhesion+dynamics+during+cell+migration.">Actin microtubules and focal adhesion dynamics during cell migration.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 35 (1), 39-50 (2003).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Hücre göçü kanser araştırmalarında incelemek için önemli bir yönüdür ve aynı zamanda, gelişim ve yara iyileşmesi immünolojik çalışmalar uygulanabilir. Hücre kültürü kapatma deneyi yara ve transwell hücre göçü ve işgali deneyleri hücre göç davranışları ayrıntılı bilgilerin açığa çıkarılması ve hücre göçü 1,2,10,14 moleküler mekanizmaları araştırmak için kullanılabilir. Çalışmamız B16F10 melanom hücre çizgisinin hareket hızı ve invazyon yeteneklerini...

Motilite canlı hücre bir temel özelliğidir. Hücre göçü ömrü, embriyonik gelişmesi, bağışıklık tepkisi ve kanser metastaz ve enflamasyon 1-9 gibi birçok patolojik süreçlerin kavramında yer almaktadır. Bu nedenle, hücre göç davranışlarını incelemek için yöntemler biyomedikal bilimler, biyoloji, biyomühendislik ve ilgili alanlarda disiplinler geniş bir yelpazede için çok yararlı bir araştırma araçlardır. Kanser hastalarında başlıca ölüm nedenidir metastatik ilerlemesi ile ilgili olarak kanser araştırmalarında hücre göçünün çalışma özel önem taşımaktadır. Vücuda yayılmış ve yaymak için kanser için, kanser hücreleri göç olmalı ve intravasate kan dolaşımı içine, hücre dışı matriks (ECM) ile işgal, uzak bir siteye eklemek, ve nihayet uzak odaklar 1,10-12 oluşturmak için damar dışına. Çeşitli biyolojik yöntemler ayrıntılı olarak bu olayları incelemek için kullanılabilir. Hücre kültürü yara kapanması bird transwell göç ve istila deneyleri geniş bilimsel topluluğun 1,10 kullanılır. Bu testler belirli bir hücre tipi kendiliğinden göç ya da kemo-cezbedici cevap ve yönlendirilerek ona doğru nasıl göç iyi bir anlayış için izin verebilir gerekli verileri sağlayabilir. Çeşitli göç fenotipleri tarif edilmiştir. Hücreler, mezenşimal veya amoeboid benzeri hareket bölgesi veya 13 geçiş akış toplu ya da çok-etiketli hücre hareketi ile görüldüğü gibi, tek bir hücre şeklinde aktarılabilir. Hareketli hücrelerinde kullanılan hareket ait yöntem hali hazırda hücre kültürü yara kapatma tahlili kullanılarak gözlemlenebilir. Hücre göçü çalışma için çok çeşitli yollar arasında, hücre yara kapatma deneyi basit biridir. Bu yöntem, tüm hücre kütlelerinin göç yeteneğini belirlemek için yararlıdır. Bir adım daha ileri alındığı zaman göç 14 sırasında bireysel hücrenin morfolojik özellikleri gözlemlemek için kullanılabilir. Yara kapanmasının analizi takiben birçok fenotipleri ortaya olabilir. Bir kontrol karşılaştırırken zamanla kapalı mesafeyi ölçen spesifik migrasyon değişiklik ya da önceden bilinmeyen bir engelli göçmen fenotip ortaya çıkarabilir. Ayrıca, tek bir hücre lamellipodium oluşumu, kuyruk geri çekme ve yönlü hareket ilgi 14 hücrelerinde bozulmuş veya gelişmiş olabilir ne için ipuçları verebilir. Transwell göç ve istila deneyleri yönde bu kemokinler, büyüme faktörleri, yağlar, ya da nükleotid 4,5,8,15,16 olup çeşitli kemo-cezbedici yanıt tek hücrelerinin yeteneği analiz etmek için kullanılabilmektedir. Ayrıca nedeniyle reseptörünün 1,14 aşırı ifade diferansiyel göçmen yeterliliğini değerlendirmek olabilir. Bu deneyler, aynı zamanda, küçük bir GTPases 2&#39;nin Rho aile olarak hücre göçü anahtar regülatörleri belirlemek ve karakterize etmek için kullanılabilir. Acces kolayca bu kısa ve ardındanmak testleri, hücre göçünün modu ve bir 3-D matrisine işgal etmek için bir hücrenin yeteneği de belirlenebilir.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Gemini</td><td>100106</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-50G</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA 0.25%</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s phosphate buffered saline (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Crystal violet</td><td>Sigma</td><td>C0775-100G</td><td>Dissolved in water at 0.2%</td></tr><tr><td>Cell disassociation buffer</td><td>Gibco</td><td>13151-014</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture incubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Model # 3145</td></tr><tr><td>SterilGARD biosafety hood</td><td>The Baker Company, Inc.&amp;nbsp;</td><td></td><td>Model # VBM-600</td></tr><tr><td>EVOS Fl inverted microscope</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Model # AMF-4302-US</td></tr><tr><td>Tissue culture plate</td><td>Becton Dickinson</td><td>353046</td><td>Catalog number varies depending on the type of culture plate</td></tr><tr><td>Corning Transwell insert</td><td>Fisher</td><td>07-200-150</td><td>Catalog number varies depending on the pore size of the membrane</td></tr></tbody></table>

in vitro cell migration and invasion assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

Burada sunulan deney yara kapatma ve Transwell hücre göçü deneyi, bir model sistem olarak fare B16F10 melanom hücreleri kullanılarak yapıldı. Yara kapatma tahlilde, B16F10 hücrelerinin bir 6-yuvalı doku kültürü plakasında tohumlandı ve 24 saat içinde% 100 konflüansa büyütülür. Yaklaşık 700 mikron genişliğinde bir yara time-lapse mikroskopi kullanılarak kaydedilen bir pipet ve yara kapanmasını (hücre göçü) kullanılarak oluşturulmuştur. Alternatif olarak, yara kapama da time-lapse mikros...

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Cell Migration and Invasion Assays at JoVE.com

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Yaygın olarak kullanılan, in vitro olarak hücre göçü ve işgali incelenmesi için oldukça erişilebilir yöntemler tarif edilmiştir. Birinci yöntem, hücre motilitesini büyüklüğüne hücre yara kapatma deneyidir. İkinci yöntem kemotaktik ve hücrelerin invaziv kapasitesini değerlendirir transwell göç ve istila testtir.

Vitro Hücre Göç ve Invasion Tahliller

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

in-vitro-cell-migration-and-invasion-assays

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Unit 1

Cell Polarization and Migration

SCIENTISTS IN ACTION

137.6K Görüntüleme.  East Carolina University.  Yaygın olarak kullanılan, in vitro olarak hücre göçü ve işgali incelenmesi için oldukça erişilebilir yöntemler tarif edilmiştir. Birinci yöntem, hücre motilitesini büyüklüğüne hücre yara kapatma deneyidir. İkinci yöntem kemotaktik ve hücrelerin invaziv kapasitesini değerlendirir transwell göç ve istila testtir. 

Video: In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms including wound healing disorder. The physiological process of wound healing is highly complex. The formation of granulation tissue is a key step in this process resulting in a preliminary wound closure and providing a network of new capillary blood vessels &#8211; either through vasculogenesis (novel formation) or angiogenesis (sprouting of existing vessels). Both vasculo- and angiogenesis require functional, directed migration of endothelial cells. Thus, investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of chemical induced wound healing disorders and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention.
We assessed impaired wound healing after alkylating agent exposure and tested potential candidate compounds for treatment. We used a set of techniques outlined in this protocol. A modified Boyden chamber to quantitatively investigate chemokinesis of EEC is described. Moreover, the use of the wound healing assay in combination with track analysis to qualitatively assess migration is illustrated. Finally, we demonstrate the use of the fluorescent dye TMRM for the investigation of mitochondrial membrane potential to identify underlying mechanisms of disturbed cell migration. The following protocol describes basic techniques that have been adapted for the investigation of EEC.

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

Toksik Kimyasalların Maruz sonra Endotel Hücre Göç Değerlendirilmesi

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Gelişim Biyolojisi

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration and invasion abilities to understand how cancer cells disseminate, with the aim of developing new treatment strategies. Analysis of the cellular and molecular basis of these abilities has led to the characterization of cell mobility and the physicochemical properties of the cytoskeleton and cellular microenvironment. For many years, the Boyden chamber assay and the scratch wound assay have been the standard techniques to study cell invasion and migration. However, these two techniques have limitations. The Boyden chamber assay is difficult and time consuming, and the scratch wound assay has low reproducibility. Development of modern technologies, especially in microscopy, has increased the reproducibility of the scratch wound assay. Using powerful analysis systems, an &#34;in-incubator&#34; video microscope can be used to provide automatic and real-time analysis of cell migration and invasion. The aim of this paper is to report and compare the two assays used to study cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and an optimized in vitro video microscope-based scratch wound assay.

This study reports two different methods for the analysis of cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and the in vitro video microscope-based wound-healing assay. The protocols for these two experiments are described, and their benefits and disadvantages are compared.

Cep işgali ve geçiş işlemi değerlendirilmesi: Video mikroskop esaslı çizik karşılaştırılması tahlil ve Boyden odası tahlil yara

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

Kanser Araştırmaları

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. Traditional 3D assays such as the Boyden Chamber require that cells are displaced from the original culture location and moved to a new environment. Not only does this disrupt the cellular processes that are intrinsic to the microenvironment, but it often results in a loss of cells. These problems are especially challenging when dealing with cells that are either rare, or extremely sensitive to their microenvironment. Here, we describe the development of a 3D invasion assay that avoids both concerns. In this assay, cells are plated within a small well and an ECM matrix containing a chemoattractant is laid atop the cells. This requires no cell displacement, and allows the cells to invade upwards into the matrix. In this assay, cell invasion as well as cell morphology can be assessed within the collagen gel. Using this assay, we characterize the invasive capacity of rare and sensitive cells; the hybrid cells resulting from fusion between breast cancer cells MCF7 and mesenchymal/multipotent stem/stroma cells (MSCs).

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

This protocol describes an inverted vertical invasion assay that could be used to quantify the migration and invasion capabilities of cells in a three-dimensional setting while preserving the cell microenvironment. This assay is suitable for rare and/or sensitive cells.

Yukarı doğru hareket: Bir basit ve esnek Vitro üç boyutlu işgali tahlil iletişim kuralı

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include rapid proliferation and pervasive invasion into the normal brain. Recurrence is thought to result from the presence of radio- and chemo-resistant brain tumor stem cells (BTSCs) that invade away from the initial cancerous mass and, thus, evade surgical resection. Hence, therapies that target BTSCs and their invasive abilities may improve the otherwise poor prognosis of this disease. Our group and others have successfully established and characterized BTSC cultures from GBM patient samples. These BTSC cultures demonstrate fundamental cancer stem cell properties such as clonogenic self-renewal, multi-lineage differentiation, and tumor initiation in immune-deficient mice. In order to improve on the current therapeutic approaches for GBM, a better understanding of the mechanisms of BTSC migration and invasion is necessary. In GBM, the study of migration and invasion is restricted, in part, due to the limitations of existing techniques which do not fully account for the in vitro growth characteristics of BTSCs grown as neurospheres. Here, we describe rapid and quantitative live-cell imaging assays to study both the migration and invasion properties of BTSCs. The first method described is the BTSC migration assay which measures the migration toward a chemoattractant gradient. The second method described is the BTSC invasion assay which images and quantifies a cellular invasion from neurospheres into a matrix. The assays described here are used for the quantification of BTSC migration and invasion over time and under different treatment conditions.

Here, we describe live-cell imaging techniques to quantitatively measure the migration and invasion of glioblastoma brain tumor stem cells over time and under multiple treatment conditions.

Canlı hücre görüntüleme deneyleri için çalışma Glioblastoma Beyin tümör kök hücre göç ve işgali

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great significance. Migration assays provide basic insight of cell movement at a 2D level, whereas invasion assays are more physiologically relevant, mimicking in vivo cancer cell dislodgment from the original site and invading through the extracellular matrix. The current protocol provides a single workflow for migration and invasion assays. Together with the integrated automated microscopic camera for real-time HD images and built-in analysis module, it gives researchers a time-efficient, simple and reproducible experimental option. This protocol also includes substitutions for the consumables and alternative analysis methods for users to choose from.

The current protocol describes an integrated method investigating cancer cell migration and invasion on a single platform in real-time, providing an easily reproducible and time-efficient option to study cell mobility and morphology.

Otomatik bir canlı hücre Imager kullanarak basit geçiş/işgali iş akışı

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a porous membrane in a process analogous to the initial steps of cancer cell metastasis. The tested cells can be altered for the gene expression or treated with inhibitors to test for changes in the invasion potential. This experiment tests the aggressive phenotype of the mouse mammary tumor cells to discover and characterize the potential oncogenes that promote cell invasion. This technique, however, can be versatile and adapted to many different applications. The experiment itself can be done in one day and the results are acquired by light microscopy in less than a day. The results include counts of the number of invading cells for comparison and analysis. The in vitro invasion assay is a rapid, inexpensive, and clear-cut method for determining cell behavior in a culture that can be used as an initial assessment before more involved in vivo assays.

The in vitro cell invasion assay is used to measure the potential of cancer metastasis by quantifying the cellular potential for invasion and migration using cell culture inserts containing protein matrix. Cells are challenged to migrate through the protein matrix and a porous membrane, towards a chemoattractant, and then quantified by light microscopy.

Onkojenik hücre davranışının bir ölçüsü olarak bir In vitro Invazif tahlil içinde Mouse mammary tümör hücrelerinin kullanımı

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...

Genetik

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration and invasion is demonstrated by pregnancy disorders such as pre-eclampsia and intrauterine growth restriction, which are associated with inadequate trophoblast invasion of the maternal vasculature. Unfortunately, our understanding of the mechanisms by which the placenta develops from migrating trophoblasts is limited. In vitro analysis of cell migration via the scratch assay is a useful tool in identifying factors that regulate trophoblast migratory capacity. However, this assay alone does not define the cellular changes that can result in altered cell migration. This protocol describes three different in vitro assays that are used collectively to evaluate trophoblast cell movement: the scratch assay, the invasion assay, and the proliferation assay. The protocols described here may also be modified for use in other cell lines to quantify cell movement in response to stimuli. These methods allow investigators to identify individual factors that contribute to the cell movement and provide a thorough examination of potential mechanisms underlying apparent changes in cell migration.

Here, we present a highly accessible protocol for evaluating the cell movement in human trophoblast cells using three in vitro assays: the scratch assay, the transwell invasion assay, and the cell proliferation assay.

Vitro deneyleri içinde geçiş, işgal ve ölümsüzleştirdi insan birinci üç aylık dönem Trofoblast hücre hatları yaygın değerlendirmek için

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the actual molecules towards which the cells migrate remain elusive. This modified invasion assay has been developed to identify targets which drive cell migration and invasion. This technique compares the invasion index under three conditions to determine whether a specific hormone, growth factor, or cytokine plays a role in mediating the invasive potential of a cancer cell. These conditions include i) normal fetal bovine serum (FBS), ii) charcoal-stripped FBS (CS-FBS), which removes hormones, growth factors, and cytokines and iii) CS-FBS + molecule (denoted &#8220;X&#8221;). A significant change in cell invasion with CS-FBS as compared to FBS, indicates the involvement of hormones, cytokines or growth factors in mediating the change. Individual molecules can then be added back to CS-FBS to assay their ability to reverse or rescue the invasion phenotype. Furthermore, two or more factors can be combined to evaluate the additive or synergistic effects of multiple molecules in driving or inhibiting invasion. Overall, this method enables the investigator to determine whether hormones, cytokines, and/or growth factors play a role in cell invasion by serving as chemoattractants or inhibitors of invasion for a particular type of cancer cell or a specific mutant. By identifying specific chemoattractants and inhibitors, this modified invasion assay may help to elucidate signaling pathways that direct cancer cell invasion.

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

This video article describes a modified in vitro method to examine the role of hormones, cytokines and/or growth factors in driving cancer cell invasion.

Bir Modifiye<em&gt; In vitro</em&gt; Invasion Deneyi Hormonlar, Açan Kanser Hücre Invasion Sitokinlerin ve / veya Büyüme Faktörleri Potansiyel Rolü belirlemek için

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

Tıp

Real-Time Quantitative Measurement of Tumor Cell Migration and Invasion Following Synthetic mRNA Transfection

Tumor cells are highly motile and invasive and display altered gene expression patterns. Knowledge of how changes in gene expression regulate tumor cell migration and invasion is essential for understanding the mechanisms of tumor cell infiltration into neighboring healthy tissues and metastasis. Previously, it was demonstrated that gene knockdown followed by the impedance-based real-time measurement of tumor cell migration and invasion enables the identification of the genes required for tumor cell migration and invasion. Recently, the mRNA vaccines against SARS-CoV-2 have increased interest in using synthetic mRNA for therapeutic purposes. Here, the method using synthetic mRNA was revised to study the effect of gene overexpression on tumor cell migration and invasion. This study demonstrates that elevated gene expression with synthetic mRNA transfection followed by impedance-based real-time measurement may help identify the genes that stimulate tumor cell migration and invasion. This method paper provides important details on the procedures for examining the effect of altered gene expression on tumor cell migration and invasion.

Many upregulated genes stimulate tumor cell migration and invasion, leading to poor prognosis. Determining which genes regulate tumor cell migration and invasion is critical. This protocol presents a method for investigating the effects of the increased expression of a gene on the migration and invasion of tumor cells in real time.

Sentetik mRNA Transfeksiyonunu Takiben Tümör Hücresi Migrasyonu ve İnvazyonunun Gerçek Zamanlı Kantitatif Ölçümü

Tumor cells are highly motile and invasive and display altered gene expression patterns. Knowledge of how changes in gene expression regulate tumor cell ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to stimulate cell migration. Importantly, cell migration is a rate-limiting event during the wound-healing process to re-establish the integrity and normal function of tissue layers after injury. The advantage of this method over the classical assay, which is based on a manually made scratch in a cell monolayer, is the usage of special silicone culture inserts providing two compartments to create a cell-free pseudo-wound field with a well-defined width (500 &#956;m). In addition, due to an automated image analysis platform, it is possible to rapidly obtain quantitative data on the speed of wound closure and cell migration. More precisely, the effect of two frog-skin AMPs on the migration of bronchial epithelial cells will be shown. Furthermore, pretreatment of these cells with specific inhibitors will provide information on the molecular mechanisms underlying such events.

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Here, we present a protocol to evaluate the effect of peptides on the migration of bronchial epithelial cells. This method allows for the rapid and highly reproducible obtainment of quantitative data on the speed of cell migration and wound closure.

Roman Vitro hücre göç değerlendirmek için şifa tahlil yara

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...