Name: a novel in vitro wound healing assay to evaluate cell migration
Uploaded: 2018-03-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מימון ספיאנצה-אוניברסיטת רומא ועל קרן מחקר סיסטיק פיברוזיס איטלקי (פרוייקט טורבין #11/2014 שאומצה על ידי משלחות מועדון כדורגל מסיינה (siena), כולל Sondrio, Cerea Il Sorriso di ג'ני ו פאביה). חלק מעבודה זו נתמכה גם על-ידי FILAS FILAS פרוט גרנט-RU-2014-1020.
אנחנו אסירי תודה ד ר לורטה פררה (Genova מדיקה, Istituto ג'אנינה Gaslini, U.O.C. Genetica, איטליה) על מתן בתאי אפיתל הסמפונות.

1. תא הכנה
<ol><li>זרע 2.5x106 תאים 10 מ"ל של מינימום הכרחי בינוני (מאמ) בתוספת 2 מ מ גלוטמין (MEMg), בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS), אנטיביוטיקה (0.1 מ"ג/מ"ל של פניצילין, סטרפטומיצין) ו puromycin (0.5 µg/mL מבחר ותחזוקה של תא קו) בבקבוקון T75. דגירה. הבקבוק-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 במשך יומיים. לפני תחילת הניסוי, בדוק המפגש של התאים תחת מיקרוסקופ הפוכה. הערה: התאים המשמשים את הניסוי הם מונצחים הסמפונות אפיתל תאי אדם transduced עם וקטור lentiviral היוועצות התנגדות puromycin. הם מבטאים stably תפקודית CFTR14,15.</li>
	<li>לאחר זרימה התאים הגיעה 90-100%, תשאף האמצעי הבקבוקון ואת למחוק אותו לתוך בקבוק פסולת תחת מחלקה בקבינט בטיחות ביולוגית II. לשטוף את התאים עם 6 מ של פוספט buffered מלוחים ללא סידן ומגנזיום (CMF-PBS). בעדינות סלע את הבקבוקון ידנית ולמחוק CMF-PBS. הערה: יש להיזהר לא לגעת חד שכבתי את התא עם פיפטה.</li>
	<li>להוסיף 10 מ ל- CMF-PBS, דגירה. הבקבוק-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 10 דקות.</li>
	<li>האחות CMF-PBS וזורקים אותו. לאחר מכן להוסיף 2 מ של טריפסין/EDTA הבקבוקון.</li>
	<li>רוק בעדינות את הבקבוק, המאפשר את הפתרון לחלוטין את התאים ולאחר דגירה. הבקבוק-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 10 דקות עד התאים מנותקים בעליל תחת מיקרוסקופ. הערה: בסוף זמן הדגירה, התאים אמורה להופיע מעוגל, לא קשור משטח הפלסטיק. אם התאים נמצאים טוב מנותקת, עצבנות ידנית ייתכן שיהיה צורך.</li>
	<li>להוסיף 10 מ של MEMg בתוספת 10% FBS בטל טריפסין ולאסוף את התאים ע י שטיפת החלק התחתון של הבקבוק. להעביר את עוצמת הקול לתוך צינור חרוטי 50 מ.</li>
	<li>Centrifuge את הצינור עבור 5 דקות ב x 80 גרם.</li>
	<li>וארוקן את תגובת שיקוע והשהה מחדש את התאים 6 מ של MEMg בתוספת 10% FBS. פיפטה שוב ושוב כדי לשבור את כל הגושים.</li>
	<li>להוציא 10 µL של התא השעיה עם micropipette ולהזריק את אמצעי האחסון תחת הזכוכית המכסה בעבר לשים מעל תא Burker או Neubauer.</li>
	<li>לספור את מספר התאים.</li>
</ol>2. התא זריעה בתרבות מוסיף
<ol><li>ב כל טוב של צלחת 12-. טוב, העבר את תותב תרבות עם פינצטה סטרילי (איור 1). השתמש פינצטה כדי ללחוץ לאורך שולי מוסיף על מנת לתקן אותם על פני השטח של הצלחת. הערה: מוסיף יש התחתון דביק המאפשר הדבקה.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56825/56825fig1.jpg"> איור 1 : ייצוג סכמטי של התוספות תרבות סיליקון, מכניסים כראוי בארות של צלחת 12-ובכן. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56825/56825fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<ol start="2"><li>כראוי לדלל התליה תא MEMg בתוספת 10% FBS. ממלאים כל תא של הקדמי µL 70 תא השעיה (על 3.5x104 תאים/תא). הערה: הצפיפות של תאים המוחלת בכל תא תלוי בסוג של תאים. מומלץ להשתמש צפיפות תא שמוביל להשלים זרימה בתוך 24 שעות.</li>
	<li>תחת המיקרוסקופ, בדוק כי תאים לא דולפים מן התאים הוספה דגירה לצלחת 12-ובכן במשך 24 שעות ביממה-CO 37 ° C ו-5%2.</li>
</ol>3. מדומים הפצע Assay הריפוי
<ol><li>לאחר דגירה, דמיינו את התאים במיקרוסקופ הפוך כדי לוודא כי נוצר תא confluent monolayers.</li>
	<li>מחדש להשעות את מבחן תרכובות (למשל, מגברים) ב 1 מ"ל של MEMg. הערה: להכין טרי דילולים אמפר החל מהפתרון מניות המאוחסנים ב-20 ° C.</li>
	<li>הסר בעדינות את המכסים על ידי פינצטה סטרילי. יש להיזהר לא לשבור את התא monolayers. להעביר את המכסים על נייר סופג. הערה: כדי להשתמש מחדש את המכסים אותו, לעקר אותם 70% אתנול במשך לפחות 3 שעות. מומלץ לזרוק אותם לאחר מכן.</li>
	<li>כדי להסיר תאים שאינם מחסידי, להוסיף 1 מ"ל של MEMg לכל שימוש טוב של micropipette. סגור את הצלחת, בעדינות לזעזע אותו. הערה: לא להוסיף בינוני ישירות מעל תא monolayers כדי למנוע הפרעה שלהם.</li>
	<li>האחות המדיום ולהחליף אותו עם 1 מ"ל של MEMg לכל טוב. לסגור את הצלחת והמחש את הפערים נטול תאים (שנוצרו על ידי התוספות) תחת המיקרוסקופ הפוכה בהגדלה X 4, מצוידים עם מצלמת וידיאו. לרכוש תמונות בזמן אפס (T0) ולשמור אותם בתבנית. jpg.</li>
	<li>להסיר את המדיום מן הבארות, לשטוף אותם עם 1 מ"ל ל- PBS, למחוק אותו.</li>
	<li>הוסף את תרכובות מבחן (להכין בשלב 3.2) הבארות. דגימות הבקרה אינו מטופל, הוסיפו 1 מ"ל של MEMg. דגירה לצלחת-CO 37 ° C ו-5%2.</li>
	<li>לאחר 15, 20, וטיפול 24 שעות, להתבונן על נדידת תאים במיקרוסקופ בהגדלה X 4, לרכוש תמונות. הערה: במהלך שלב זה, לנסות ללכוד תמונות בהאזורים באשר T0. הבחירה של מרווחי זמן שבו נלכדים תמונות תלוי מהירות ההעברה של התא.</li>
	<li>כדי לחקור את ההשפעה של כמה מעכבי סלקטיבית, כלומר AG1478, על נדידת תאים, תשאף המדיום של כל תא הוספה לפני הסרת מוסיף.<ol>
<li>לשטוף כל תא עם MEMg טריים ולמלא אותו 70 µL של MEMg בתוספת AG1478.</li>
		<li>לאחר 30 דקות של דגירה-37 ° C ו- 5% CO2, המשך כמתואר מנקודת 3.3. הערה: במהלך שלב כביסה, רעלני של תאים monolayers עם מעכבי ספציפית, יש להיזהר לא להסיר את התוספות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. תמונות ניתוח
<ol><li>עם סיום הניסוי, בחר תמונות של הדגימות הייצוגי ביותר של הקבוצות השונות ניסיוני, וליצור קובץ zip המכיל תמונות יחיד ב- T0, T15, T20, T24 h. הערה: תמונות יחיד נלקחות במרווחי זמן נבחר עבור כל הדגימות. הפעל את triplicates עבור כל ניסוי, אשר חוזר על עצמו לפחות שלוש פעמים. בסוף, לקבוצות בכל ניסיוני, מינימום של 3 תמונות ("a", "b", "c", וכד', הנובע ניסוי עצמאית) בנקודת זמן כל מנותחות.</li>
	<li>להעלות קובץ ה-zip לתוך התוכנה ניתוח תמונה אשר מספק באופן אוטומטי באמצעות דואר אלקטרוני קובץ סיכום הגיליון האלקטרוני המכילה את הנתונים ניסיוני של אזורים מכוסי תא, גירוד (באחוזים) בנקודות זמן נבחר. הערה: ההכרה בחוד החנית ואת אזור הפער מבוססת במידה רבה על שיטת זיהוי קצה (המכוון לזיהוי נקודות בו בהירות התמונה חדה משתנה).</li>
	<li>לשמור את הנתונים ולאסוף אותם. לנרמל את כל הנתונים ביחס הערך הממוצע בזמן אפס. חישוב הערך הממוצע של הנתונים המנורמל של משכפל כל כל נקודת זמן, השגיאה הסטנדרטית היחסי (SEM). באמצעות ניתוח דו כיוונית השונות (ANOVA), לבצע ניתוח סטטיסטי עם תוכנת הסטטיסטיקה נכונה. הבדלים בין קבוצות שטופלו פפטיד וקבוצות שליטה במרווחי זמן שונים נחשבים מבחינה סטטיסטית signiﬁcant עבור p< 0.05.</li>
	<li>להתוות נתונים המתקבלים גרף כמו היסטוגרמה, אשר מציג אחוז מכוסי תא שטח של כל מדגם קבוצות לעומת ממרווחי הזמן שנבחר.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Enyedi, B., Niethammer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+epithelial+wound+detection.">Mechanisms of epithelial wound detection.</a> Trends Cell Biol. 25, 398-407 (2015).</li><li>Kujath, P., Kujath, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complicated+skin,+skin+structure+and+soft+tissue+infections+-+are+we+threatened+by+multi-resistant+pathogens?.">Complicated skin, skin structure and soft tissue infections - are we threatened by multi-resistant pathogens?.</a> Eur J Med Res. 15, 544-553 (2010).</li><li>Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+formation+in+the+cystic+fibrosis+airway.">Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway.</a> Pulm Pharmacol Ther. 21, 595-599 (2008).</li><li>Chiappini, E., Taccetti, G., de Martino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+lung+infections+in+cystic+fibrosis+patients:+an+update.">Bacterial lung infections in cystic fibrosis patients: an update.</a> Pediatr Infect Dis J. 33, 653-654 (2014).</li><li>Mangoni, M. L., McDermott, A. M., Zasloff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+peptides+and+wound+healing:+biological+and+therapeutic+considerations.">Antimicrobial peptides and wound healing: biological and therapeutic considerations.</a> Exp Dermatol. 25, 167-173 (2016).</li><li>Lau, K., Paus, R., Tiede, S., Day, P., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+role+of+stem+cells+in+cutaneous+wound+healing.">Exploring the role of stem cells in cutaneous wound healing.</a> Exp Dermatol. 18, 921-933 (2009).</li><li>Hu, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+and+regenerative+repair+in+wound+healing.">Tissue engineering and regenerative repair in wound healing.</a> Ann Biomed Eng. 42, 1494-1507 (2014).</li><li>Ramot, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+PPARgamma-mediated+signalling+in+skin+biology+and+pathology:+new+targets+and+opportunities+for+clinical+dermatology.">The role of PPARgamma-mediated signalling in skin biology and pathology: new targets and opportunities for clinical dermatology.</a> Exp Dermatol. 24, 245-251 (2015).</li><li>Lai, Y., Gallo, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPed+up+immunity:+how+antimicrobial+peptides+have+multiple+roles+in+immune+defense.">AMPed up immunity: how antimicrobial peptides have multiple roles in immune defense.</a> Trends Immunol. 30, 131-141 (2009).</li><li>Zasloff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+peptides+of+multicellular+organisms.">Antimicrobial peptides of multicellular organisms.</a> Nature. 415, 389-395 (2002).</li><li>Hulkower, K. I., Herber, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+and+invasion+assays+as+tools+for+drug+discovery.">Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery.</a> Pharmaceutics. 3, 107-124 (2011).</li><li>Di Grazia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+frog+skin-derived+antimicrobial+peptide+esculentin-1a(1-21)NH2+promotes+the+migration+of+human+HaCaT+keratinocytes+in+an+EGF+receptor-dependent+manner:+a+novel+promoter+of+human+skin+wound+healing?.">The frog skin-derived antimicrobial peptide esculentin-1a(1-21)NH2 promotes the migration of human HaCaT keratinocytes in an EGF receptor-dependent manner: a novel promoter of human skin wound healing?.</a> PLoS One. 10, e0128663 (2015).</li><li>Di Grazia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D-Amino+acids+incorporation+in+the+frog+skin-derived+peptide+esculentin-1a(1-21)NH2+is+beneficial+for+its+multiple+functions.">D-Amino acids incorporation in the frog skin-derived peptide esculentin-1a(1-21)NH2 is beneficial for its multiple functions.</a> Amino Acids. 47, 2505-2519 (2015).</li><li>Cappiello, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esculentin-1a-derived+peptides+promote+clearance+of+Pseudomonas+aeruginosa+internalized+in+bronchial+cells+of+cystic+fibrosis+patients+and+lung+cell+migration:+biochemical+properties+and+a+plausible+mode+of+action.">Esculentin-1a-derived peptides promote clearance of Pseudomonas aeruginosa internalized in bronchial cells of cystic fibrosis patients and lung cell migration: biochemical properties and a plausible mode of action.</a> Antimicrob Agents Chemother. 60, 7252-7262 (2016).</li><li>Bebok, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Failure+of+cAMP+agonists+to+activate+rescued+deltaF508+CFTR+in+CFBE41o-+airway+epithelial+monolayers.">Failure of cAMP agonists to activate rescued deltaF508 CFTR in CFBE41o- airway epithelial monolayers.</a> J Physiol. 569, 601-615 (2005).</li><li>Trinh, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+defective+cystic+fibrosis+airway+epithelial+wound+repair+after+CFTR+rescue.">Improvement of defective cystic fibrosis airway epithelial wound repair after CFTR rescue.</a> Eur Respir J. 40, 1390-1400 (2012).</li><li>Gan, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidermal+growth+factor+receptor+(EGFR)+tyrosine+kinase+inhibitor+AG1478+increases+the+formation+of+inactive+untethered+EGFR+dimers.+Implications+for+combination+therapy+with+monoclonal+antibody+806.">The epidermal growth factor receptor (EGFR) tyrosine kinase inhibitor AG1478 increases the formation of inactive untethered EGFR dimers. Implications for combination therapy with monoclonal antibody 806.</a> J Biol Chem. 282, 2840-2850 (2007).</li><li>Tokumaru, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+keratinocyte+migration+via+transactivation+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+by+the+antimicrobial+peptide+LL-37.">Induction of keratinocyte migration via transactivation of the epidermal growth factor receptor by the antimicrobial peptide LL-37.</a> J Immunol. 175, 4662-4668 (2005).</li><li>Tjabringa, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antimicrobial+peptide+LL-37+activates+innate+immunity+at+the+airway+epithelial+surface+by+transactivation+of+the+epidermal+growth+factor+receptor.">The antimicrobial peptide LL-37 activates innate immunity at the airway epithelial surface by transactivation of the epidermal growth factor receptor.</a> J Immunol. 171, 6690-6696 (2003).</li><li>Di Grazia, A., Luca, V., Segev-Zarko, L. A., Shai, Y., Mangoni, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporins+A+and+B+stimulate+migration+of+HaCaT+keratinocytes+and+kill+intracellular+Staphylococcus+aureus.">Temporins A and B stimulate migration of HaCaT keratinocytes and kill intracellular Staphylococcus aureus.</a> Antimicrob Agents Chemother. 58, 2520-2527 (2014).</li></ol>

המחברים אין לחשוף

נדידת תאים הוא תהליך חיוני באירועים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים כולל ריפוי הפצע, התפתחות של סרטן גרורות. ההליך הבסיסי לימודים תא העברה במבחנה כרוך: (i) היצירה של חד שכבתי תא, (ii) הייצור של פצע מדומה בשכבה confluent של תאים, הסגר (iii) לכידת תמונות במרווחי זמן שונים עד הפציעה נגיש , ו- (ד) הניתוח של רצף תמונות בכדי לכמת את מהירות ההעברה של התאים שבחרת.
התוצאות שלנו הראו כי היישום של תרבות מוסיף הוא אובייקטיבי ובלתי אמין ניסיוני טכניקת הערכה כמותית של מאפייני ההעברה תא. Assay זה יכול להתבצע על ידי כל קבוצת המחקר עם ציוד מעבדה בסיסית. עם זאת, יש לשקול כמה צעדים קריטיים של הפרוטוקול כדי להשיג הפארמצבטית. לדוגמה, חשוב להגדיר, על-ידי טייס הניסויים, המספר המדויק של תאי זרע בתוך כל תא כדי לקבל באותה המידה של זרימה בתוך כל דוגמאות בודדות. לכוונה זו, יש תאים עם שלב מחזור מסונכרן והימנעות תא גושים לפני זריעה היא קריטית. דרך אפשרית כדי למזער את הצליעה היא מעבר עדין של הבולם התא באמצעות מחט מזרק. עם זאת, להגדיל את גודל הדגימות באופן משמעותי יתרום להפחתת השתנות בין התאים.
בנוסף, היצירה של פער עם רוחב מוגדרים היטב כל דוגמאות חיוני. למטרה זו, מוסיף סיליקון לא אמור מחדש לשמש יותר מפעמיים. יתר על כן, יש להימנע את הצמיחה של תאים מתחת לחומה ההפרדה סיליקון. כדי למנוע בעיה זו, לחץ רך על גבי תותב, פעם להציב לתוך המנה לצלחת/טוב, יכול להיות מיושם באופן ידני באמצעות פינצטה סטרילי כדי להגדיל את הידבקות של התותב, כדי הפלסטיק. הסרת זהיר של הקדמי גם ה"בלתי הגדלה של פני השטח ללא תא עם הפרעה של טפט התא.
עם זאת, לאחר כראוי תותב. הוא ניתק, פצע מדומה מופק בצורה מושלמת, כמה שורות תאים ניתן לנתק מעל פני השטח פלסטיק, במיוחד אם הם מודגרת בתקשורת ללא סרום או תוספי מזון כמו ויטמינים, חומצות אמינו, גורמי גדילה. העדר של גורמים אלה במדיום תרבות תא ניתן להכתיב את העובדה כי הם יכולים להפריע לפעילות קידום ריפוי פצע של תרכובות מבחן כדי לעקוף בעיה זו, בחירה רציונלית של תרבות בינוני הרכב מומלץ מאוד.
צעד קריטי נוסף שיש להביא בחשבון לפני הגדרת ריפוי הליך זה הפצע הוא מהירות העברה שונים שקיים בין סוגי תאים שונים. גם במקרה זה, ניסויים מוקדמים צריך להיות מתוכנן במטרה קביעת מרווחי הזמן הנכון שבו יש תמונות ללכידה. יש גם צורך לשקול כי מגבלה אחת שכרוכות בשיטה זו הוא מוסיף תרבות כזה אינו יכול להיות מועסק ללמוד את ההעברה של תאים שגדלים ההשעיה (למשל, אורך חייהם לויקוציטים).
למרות ריפוי פצע מבחני ביצע עם התרבות סיליקון מוסיף יקרים יותר וזמינותו מאפס קלאסית, הם מאפשרים רפרודוקציה מהיר ומדויק של נתונים על פעילות התא ההעברה. חשוב, לאחר הגדרת המערכת, אותו ניתן להרחיב את הידע על המנגנון המולקולרי שבבסיס הפצע ריפוי פעילות מאולצת מגורמים אקסוגניים או אנדוגני. לשם כך, רעלני של תאים monolayers עם מולקולות ספציפיות (למשל, מעכבי) יכול להתבצע לפני יצירת הפצע מדומה. דוגמה לכך ניתנת על ידי רעלני של תאים עם (i) תא התפשטות חוסם מיטומיצין C לחקור האם הסגר של השדה "הפצוע" המושרה על ידי אמפר מושפע על ידי חלוקת התא קצב מעכבי20 או (ii) metalloprotease כדי לוודא התרומה של metalloproteases הפעלת בתיווך EGFR איתות לשביל12.
חשוב, בתהליך סגירת הפצע, עשוי להיות קבוע ודוגמאות מטופלים עם כתמי המתאים עבור זיהוי שלד התא, גרעינים (phalloidin, דאפי, בהתאמה) כדי לחזות שינויים בהיבט מורפולוגי של תאים (למשל, היווצרות lamellipodia בחוד החנית) על ידי פלורסנט/קונפוקלית. יתר על כן, הטיפול של תאים עם המגבר התווית על-ידי פלורסנט עשוי לאפשר את החזיית הסלולר תפוצתו (משטח רפידה או לוקליזציה תאיים/intranuclear) בזמנים שונים, מאז תחילת הפעילות נדידת תאים. יתר על כן, מוסיף אלה עלול לנצל לניתוח פעילות ריפוי הפצע על תאים אפיתל מקוטב ו הבדיל (למשל, תאים הסמפונות העיקריים ומתוחזק על הממשק אוויר נוזלי), לאחר שיש להציב אותם על transwell מתאימים תומך חדיר.
לסיכום, שיטת המתואר יש פוטנציאל משמעותי לשפר באופן משמעותי את הבנת התכונות הנדידה של סוגים שונים של חסיד בעל חיים תאים/רקמות אפיתל, כמו גם על הבחירה של המבטיחים ביותר-ריפוי הפצע היזמים ו/או מעכבי, תוך זמן קצר, עם רמת דיוק גבוהה.

היא ידועה בעיקר כי ריפוי הפצע בבעלי חיים הוא תהליך מהותי לכונן מחדש את תקינות ואת תפקוד תקין של רקמות שכבות לאחר פציעה1. למרות אפיתל משטחים חשופים לסביבה החיצונית (למשל, העור, מערכת הנשימה, ו נרחבים במערכת העיכול) ליצור מחסום מגן מפני עלבונות פיזיקליות, כימיות, היווצרות הפצעים יכול בקלות להתרחש, במיוחד אחרי ניתוח או זיהומים חיידקים2. לדוגמה, קולוניזציה של רקמת הריאה על ידי פתוגן חיידקי הזדמנותית Pseudomonas aeruginosa, במיוחד אצל חולי סיסטיק פיברוזיס (CF), מוביל לפגיעה של האפיתל איירווייז עם כשל נשימתי הסוגר3, 4. ריפוי הפצע הוא מנגנון תיקון מארח מורכבים כדי לשחזר את הארכיטקטורה נורמלי של רקמות הפצועים5. היא מאופיינת על ידי דלקת ראשונית, ואחריו נקודה ההתחדשות המקיף epithelialization, אנגיוגנזה, ושחזור רקמות עם ייצור קולגן תא בידול6,7,8 . כדי להבטיח את תקינות אפיתל וכדי לשלוט התפשטות חיידקים, כל היצורים החיים לייצר מולקולות ההגנה, לרבות מיקרוביאלית פפטידים (אמפר)9,10. תהליך ריפוי הפצע קשה מאוד לדמות במבחנה בשל היעדר שאריות תאים ואינטראקציות מורכבים בין סוגי תאים שונים. עם זאת, במבחנה היכולת של פפטיד כדי להאיץ את הסגר על פצע מדומה על ידי גירוי נדידה של תאים אפיתל היא מעידה על היכולת לרפא האפיתל הנגוע. אכן, נדידת תאים הוא אירוע הגבלת קצב בריפוי הפצע, לומד גורמים שיכולים להשפיע על נדידת תאים יעזור היעד טיפולים לריפוי הפצע משופרת.
כאן, assay ניסיוני מאוד לשחזור מסופק המבוססת על סיליקון מיוחד תרבות מוסיף להעריך תא העברה בתוך חוץ גופית. היא מבוססת על יצירת פער μm 500 (הפצע מדומה) על טפט התא confluent. התאים בקצה השדה "הפצוע" מלאכותי יתחיל נודדות לאזור ללא תאים, ויצרו קשרים תאים תאים חדשים. הוסף תרבות מייצג כלי חדש עבור ריפוי ניסויים הפצע מהר. שני מאגרים המופרדות על-ידי קיר μm 500 הינם מסופקים, ושיחות ניתן כהלכה להניח לתוך צלחת צלחת 3-ס"מ או בבאר של צלחת 12-. טוב. מילוי כל תא של הקדמי עם השעיה התא מאפשר לתאים לגדול בכל אזור המיועד עד למפגש, בזמן ההסרה של הקדמי לעורר רווח נקי ללא תא של 500 μm (באותו רוחב כמו חומת ההפרדה). מדיום התרבות התא הנכון עם תרכובת מבחן אז ניתן להוסיף לתוך המנה לצלחת/טוב. לאחר מכן, ניתן לאבחן על סגירת הפער במרווחי זמן שונים תחת מיקרוסקופ הפוכה, רצוי אחד מצויד מצלמת וידיאו עבור ייבוא תמונות. לבסוף, מדידה של שינויים באזור המכוסה תא על-ידי התוכנית ניתוח תמונות אוטומטית מבוססת אינטרנט יאפשר כימות של מהירות ההעברה הסגר ותא הפצע. בסך הכל, שיטה זו היא צעד אחד קדימה ביחס וזמינותו קלאסי, בו שריטה מתבצעת באופן ידני על-ידי אם תא confluent monolayers עם מחט סטרילית או פיפטה עצה11. אכן, ההליך האחרון יכול להרוס בתחתית קערה פלסטיק צלחת/טוב, הציפוי על פני השטח, יצירת קמטים. בנוסף, האזור "הפצוע" לא קיימת רוחב מוגדרים היטב לכל אורכו של הפער, מכיוון שזה מאוד תלוי הלחץ שהופעל על ידי חוקרים המחט/טיפ. יתר על כן, התאים ונדרש שיכולים להיווצר גושים של תאים חי וגם מת בקצוות של השריטה; יתר על כן, הפצת התאים החיים לאזור "הפצוע" יכול להתערב עם המהירות של נדידת תאים, הפקת תוצאות שאינן לשחזור12.
בנוסף, הודות פלטפורמה ניתוח תמונת הטיוטה, משתמשים יכולים במהירות לקבל (בתוך דקות) נתונים כמותיים על ההתנהגות הנדידה של התאים שנבחרו ללא הצורך ברכישת תוכנות נוספות. פלטפורמה זו הוא מסוגל לנתח שלב תמונות מיקרוסקופ בניגודיות נמוכה (~ 5 X), בינוני (~ 10 X), הגדלה גבוהה (~ 20 X). לאחר העלאת קובץ zip של תמונות (ב- *.jpg, *.jpeg, *.jp2, *.png, *.gif, *.tiff תבנית) הניתוח מבוצע באופן אוטומטי כדי ליצור קובץ סיכום המציגה את אחוז מכוסי תא אזורים ואזורי מאפס, כמו גם המהירות של התא הגירה, במרווחי זמן שונים.
בעבודה זו, באמצעות כח-נגזרת צפרדע-עור, קרי Esc(1-21), שלה diastereomer Esc(1-21) - 1c13, קו תא הסמפונות לבטא את תפקודי CF מוליכות transmembrane הרגולטור (CFTR)14,15, דוגמה של נדידת תאים פפטיד-induced לעומת דגימות ללא טיפול (בקרה) מסופק. שימו לב כי אפיתל דרכי הנשימה ואת CFTR לשחק תפקיד מכריע בשמירה על תפקוד הריאות, פצע תיקון16. יתר על כן, על-ידי מעכבי סלקטיבית (למשל, AG1478)17 של קולטן גורם הגדילה באפידרמיס (EGFR), כרוך ראיות כי ההעברה של תאים הסמפונות המושרה על ידי פפטידים הנ ל ההפעלה של EGFR12, 18 הוא דיווח.
לסיכום, המטרה של נוהל זה היא להראות כיצד השימוש כזה מוסיף תרבות סיליקון מייצג של assay מהיר ונגיש בקלות כדי לקבוע במדויק נדידה של תאים חסיד (למשל, ברונכיט תאים אפיתל) ומולקולרית מנגנוני שליטה אירועים כאלה.

<table><tbody><tr><td>Minimum essential medium (MEM)&amp;nbsp;</td><td>Euroclone</td><td>ECB2071L</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Euroclone</td><td>ECB3000D</td><td></td></tr><tr><td>Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Euroclone</td><td>ECS0180DH&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin and Streptomycin</td><td>Euroclone</td><td>ECB3001D</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA 1X in PBS</td><td>Euroclone</td><td>ECB3052D</td><td>Warm at room temperature before use</td></tr><tr><td>DPBS without calcium and magnesium (CMF-PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>DPBS with calcium and magnesium (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>Ibidi Culture-Insert 2 well</td><td>Ibidi&amp;nbsp;</td><td>80209</td><td></td></tr><tr><td>Wimasis Image Analysis</td><td>Ibidi&amp;nbsp;</td><td>30002</td><td></td></tr><tr><td>PRISM software&amp;nbsp;</td><td>GraphPad</td><td>version 6.0</td><td></td></tr></tbody></table>

a novel in vitro wound healing assay to evaluate cell migration

מטרת עבודה זו היא להציג שיטה להעריך את היכולת של מולקולות immunomodulatory, כגון מיקרוביאלית פפטידים (אמפר), כדי לעורר את נדידת תאים. חשוב לציין, נדידת תאים הוא אירוע הגבלת קצב במהלך תהליך ריפוי פצע לכונן מחדש את תקינות ואת תפקוד תקין של רקמות שכבות לאחר פציעה. היתרון של שיטה זו על וזמינותו הקלאסית, אשר מבוסס על שריטה עשה באופן ידני בטפט התא, הוא שהשימוש של תרבות סיליקון מיוחד מוסיף מתן שני תאים כדי ליצור שדה מדומים הפצע נטול תאים עם רוחב מוגדרים היטב (500 μm ). בנוסף, עקב פלטפורמה ניתוח התמונה האוטומטי, אפשרי להשיג במהירות נתונים כמותיים על מהירות ההעברה הסגר ותא הפצע. ליתר דיוק, ההשפעה של שני אמפר עור הצפרדע על ההעברה של תאי אפיתל כנגד ברונכיט יוצגו. יתר על כן, רעלני של תאים אלה עם מעכבי ספציפית יספק מידע על המנגנונים המולקולריים שבבסיס אירועים כאלה.

פרוטוקול זה שימש כדי לקבוע את הפצע ריפוי אפקט Esc(1-21) ו- Esc(1-21) - 1 ג מבחינת פעילות ההעברה התאים המושרה בתאי אפיתל הסמפונות, המבטאת את CFTR פונקציונלי. ב הזה assay, תרבות מוסיף הונחו בבארות של צלחת 12-. ובכן, כל תא היה נזרע עם 35,000 בתאים MEMg בתוספת 10% FBS. התאים הגיעו למפגש מלא בתוך 24h. אחר כך, נוצר פער 500 μm, כל טוב היה מלא MEMg המכיל את פפטיד בריכוזים שונים. הניסוי היה בן ארבע פעמים. כמצוין באיור2, הסגר כמעט מוחלטת של השדה מדומים הפצע מיוצר על טפט תא היה המושרה על ידי שני פפטידים בתוך ה ~ 20 בריכוזים אופטימליים של 1 μM ו- 10 μM עבור Esc(1-21) - 1c ו- Esc(1-21), בהתאמה. אפשרות זו מציינת Esc(1-21) - 1 c יעיל יותר בקידום epithelialization מחדש של פצע מדומה בתאים הסמפונות.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56825/56825fig2v3.jpg"> איור 2 : השפעת esculentin-1a נגזר אמפר על הסגר על פצע דמה שנוצרו ב- טפט של תאי אפיתל כנגד ברונכיט. התאים היו נזרע בכל תא של הקדמי תרבות סיליקון, לאחר הסרתו, התאים צולמו על ראיות של נדידת תאים 15, 20, 24 שעות לאחר התוספת של פפטידים. האחוז של האזור מכוסה תא בכל נקודה חושבה בהשוואה לתאי הבקרה ללא טיפול (Ctrl) ודיווח על ציר y. כל הנתונים הם האמצעי של ניסויים עצמאית 4 ± SEM, לקוחים מן המחקר הקודם14. הרמות של מובהקות סטטיסטית לבדיקות בין דגימות שטופלו ובקרה הם: *p< 0.05, * *p< 0.01, * * *p< 0.001, ו * * *p< 0.0001. Micrographs מציג תוצאות נציג לפני (T0) ו- 20 h לאחר טיפול של תאים עם כל פפטיד-ריכוז μM 1, בהשוואה הפקד, מדווחים גם. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56825/56825fig2v3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
כדי לוודא אם ההפעלה של EGFR שיחק תפקיד לסגירת הפצע Esc-induced, תאים הסמפונות היו preincubated למשך 30 דקות עם 5 μM של AG1478, מעכב סלקטיבי של EGFR, לפני הוספה הסרה. מאז האחוז של האזור מכוסה תא צומצם באופן משמעותי במרווחי זמן כל לעומת התוצאות שנמצאו כאשר התאים היו לא pretreated עם המינהל פפטיד מוקדמת מעכב (איור 3), זה מצביע על פפטיד-induced נדידת תאים כולל הפעלה של EGFR. עם זאת, עוד יותר מחקרים, יהיה צורך להבהיר את האירועים המולקולריים המופעלות על-ידי Esc-פפטידים (למשל, הפעלת EGFR ישירה או טרנס-הפעלת מתווכת על-ידי metalloproteases, אשר הוכחו קליב ליגנדים EGFR המעוגנת קרום 19).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56825/56825fig3v3.jpg"> איור 3 : השפעה של AG1478 מעכב על פפטיד-induced ההעברה של תאי אפיתל כנגד ברונכיט. לפני הוספה הסרה, התאים היו מראש incubated עם 5 μM AG1478 במשך 30 דקות ולאחר מכן שטופלו פפטיד לבד ריכוז זהה. כל הנתונים לקוחים מתוך העבודה הקודמת שלנו14הינם האמצעי של ארבעה ניסויים עצמאית ± SEM. הרמות של מובהקות סטטיסטית לבדיקות בין הדגימות קבוצה המוצע הם: *p< 0.05; p< 0.0001. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56825/56825fig3v3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration at JoVE.com

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את ההשפעה של פפטידים על ההעברה של תאי אפיתל כנגד ברונכיט. שיטה זו מאפשרת הקניית מהיר ולא מאוד לשחזור נתונים כמותיים על מהירות הסגר ההעברה וגמר התא.

הרומן במבחנה פצע ריפוי הנועד להעריך את נדידת תאים

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

a-novel-in-vitro-wound-healing-assay-to-evaluate-cell-migration

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

21.8K Views.  Sapienza University of Rome. כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את ההשפעה של פפטידים על ההעברה של תאי אפיתל כנגד ברונכיט. שיטה זו מאפשרת הקניית מהיר ולא מאוד לשחזור נתונים כמותיים על מהירות הסגר ההעברה וגמר התא.

Video: A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms including wound healing disorder. The physiological process of wound healing is highly complex. The formation of granulation tissue is a key step in this process resulting in a preliminary wound closure and providing a network of new capillary blood vessels &#8211; either through vasculogenesis (novel formation) or angiogenesis (sprouting of existing vessels). Both vasculo- and angiogenesis require functional, directed migration of endothelial cells. Thus, investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of chemical induced wound healing disorders and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention.
We assessed impaired wound healing after alkylating agent exposure and tested potential candidate compounds for treatment. We used a set of techniques outlined in this protocol. A modified Boyden chamber to quantitatively investigate chemokinesis of EEC is described. Moreover, the use of the wound healing assay in combination with track analysis to qualitatively assess migration is illustrated. Finally, we demonstrate the use of the fluorescent dye TMRM for the investigation of mitochondrial membrane potential to identify underlying mechanisms of disturbed cell migration. The following protocol describes basic techniques that have been adapted for the investigation of EEC.

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

הערכה של נדידת תאי האנדותל לאחר חשיפה לכימיקלים רעילים

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Developmental Biology

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration and invasion abilities to understand how cancer cells disseminate, with the aim of developing new treatment strategies. Analysis of the cellular and molecular basis of these abilities has led to the characterization of cell mobility and the physicochemical properties of the cytoskeleton and cellular microenvironment. For many years, the Boyden chamber assay and the scratch wound assay have been the standard techniques to study cell invasion and migration. However, these two techniques have limitations. The Boyden chamber assay is difficult and time consuming, and the scratch wound assay has low reproducibility. Development of modern technologies, especially in microscopy, has increased the reproducibility of the scratch wound assay. Using powerful analysis systems, an &#34;in-incubator&#34; video microscope can be used to provide automatic and real-time analysis of cell migration and invasion. The aim of this paper is to report and compare the two assays used to study cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and an optimized in vitro video microscope-based scratch wound assay.

This study reports two different methods for the analysis of cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and the in vitro video microscope-based wound-healing assay. The protocols for these two experiments are described, and their benefits and disadvantages are compared.

הערכה של הפלישה התא, תהליך ההעברה: השוואה של השריטה מבוסס-מיקרוסקופ וידאו פצע Assay ואת וזמינותו קאמרית בוידן

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

Cancer Research

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor metastasis. In this assay, cells are grown to form a confluent monolayer and a mechanical wound is created by scratching with a device. Then the migration rate of the cells towards the denuded area can be monitored by imaging. Our 8-channel mechanical wounder is designed to tackle most of the problems associated with the cell migration assay. Firstly, our wounder can be easily sterilized by autoclaving or with common disinfectants. Secondly, the individual adjustable pins allow even contact with the cell culture plate so that sharp and reproducible wounds can be created. Thirdly, the guiding bars on both sides of the wounder ensure consistent wounding position in each well. The use of disposable plastic pipette tips for wounding can further provide better handling of the wounder as well as to minimize cross-contamination. In conclusion, our cell wounder can provide researchers with a user friendly and reproducible device for performing the cell migration assay using the standard 96-well culture plate.

Here, we present a protocol to perform a semi-high throughput cell migration assay on a 96-well cell culture plate. This protocol is a fast, simple and economical method to create consistent scratch wounds on a cell monolayer.

מכשיר לביצוע נדידת תאים / ריפוי פצעים צלחת 96-ובכן

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration

Understanding the physiologic mechanisms of wound healing has been the focus of ongoing research for many years. This research directly translates into changes in clinical standards used for treating wounds and decreasing morbidity and mortality for patients. Wound healing is a complex process that requires strategic cell and tissue interaction and function. One of the many critically important functions of wound healing is individual and collective cellular migration. Upon injury, various cells from the blood, surrounding connective, and epithelial tissues rapidly migrate to the wound site by way of chemical and/or physical stimuli. This migration response can largely dictate the outcomes and success of a healing wound. Understanding this specific cellular function is important for translational medicine that can lead to improved wound healing outcomes. Here, we describe a protocol used to better understand cellular migration as it pertains to wound healing, and how changes to the cellular environment can significantly alter this process. In this example study, dermal fibroblasts were grown in media supplemented with fetal bovine serum (FBS) as monolayer cultures in tissue culture flasks. Cells were aseptically transferred into tissue culture treated 12-well plates and grown to 100% confluence. Upon reaching confluence, the cells in the monolayer were vertically scratched using a p200 pipet tip. Arsenic diluted in culture media supplemented with FBS was added to individual wells at environmentally relevant doses ranging 0.1-10 &#956;M. Images were captured every 4 hours (h) over a 24 h period using an inverted light microscope to observe cellular migration (wound closure). Images were individually analyzed using image analysis software, and percent wound closure was calculated. Results demonstrate that arsenic slows down wound healing. This technique provides a rapid and inexpensive first screen for evaluation of the effects of contaminants on wound healing.

In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration

This study focuses on an in vitro model of wound healing (scratch assay) as a mechanism for determining how environmental contaminants such as arsenic influence cellular migration. The results demonstrate that this in vitro assay provides rapid and early indications of changes to cellular migration prior to in vivo experimentation.

במבחנה לגרד Assay כדי להדגים את השפעת הרעל על נדידת תאים בעור

Understanding the physiologic mechanisms of wound healing has been the focus of ongoing research for many years. This research directly translates into ...

Environment

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

ניתוח של נדידת תאים בתוך קולגן מטריקס תלת ממדי

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Bioengineering

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

אפיון נדידת תאים בתוך תלת מימדי במבחנה פצע סביבות

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated experimental procedures, while potentially lacking in precision. In vitro culture of epithelial cell lines provides a suitable platform for researching the cell migratory behavior in wound healing and the impact of treatments on these cells. The physiology of epithelial cells is often studied in non-confluent conditions; however, this approach may not resemble natural wound healing conditions. Disrupting the epithelium integrity by mechanical means generates a realistic model, but may impede the application of molecular techniques. Consequently, microscopy based techniques are optimal for studying epithelial cell migration in vitro. Here we detail two specific methods, the artificial wound scratch assay and the artificial migration front assay, that can obtain quantitative and qualitative data, respectively, on the migratory performance of epithelial cells.

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing

This manuscript describes how incision-like lesions made on cultured epithelial cell monolayers conveniently model wound healing in vitro, allowing for imaging by confocal or laser scanning microscopy, and which can provide high-quality quantitative and qualitative data for studying both cell behavior and the mechanisms involved in migration.

מיקרוסקופ המבוסס על שיטות להערכה של נדידת תאים אפיתל במהלך במבחנה ריפוי הפצע

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

Medicine

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

נדידת תאים במבחנה ומבחני פלישה

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Biology

Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective treatment. Appropriate in vitro and in vivo approaches are essential for the identification of new target molecules for drug treatments to improve the skin wound healing process. We identified the &#946;3 subunit of voltage-gated calcium channels (Cav&#946;3) as a potential target molecule to influence the wound healing in two independent assays, i.e., the in vitro scratch migration assay and the in vivo dorsal skinfold chamber model. Primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) acutely isolated from wild-type (WT) and Cav&#946;3-deficient mice (Cav&#946;3 KO) or fibroblasts acutely isolated from WT mice treated with siRNA to down-regulate the expression of the Cacnb3 gene, encoding Cav&#946;3, were used. A scratch was applied on a confluent cell monolayer and the gap closure was followed by taking microscopic images at defined time points until complete repopulation of the gap by the migrating cells. These images were analyzed, and the cell migration rate was determined for each condition. In an in vivo assay, we implanted a dorsal skinfold chamber on WT and Cav&#946;3 KO mice, applied a defined circular wound of 2 mm diameter, covered the wound with a glass coverslip to protect it from infections and desiccation, and monitored the macroscopic wound closure over time. Wound closure was significantly faster in Cacnb3-gene-deficient mice. Because the results of the in vivo and the in vitro assays correlate well, the in vitro assay may be useful for the high-throughput screening before validating the in vitro hits by the in vivo wound healing model. What we have shown here for wild-type and Cav&#946;3-deficient mice or cells might also be applicable for specific molecules other than Cav&#946;3.

Here, we present a protocol for an in vitro scratch assay using primary fibroblasts and for an in vivo skin wound healing assay in mice. Both assays are straightforward methods to assess in vitro and in vivo wound healing.

שיטת העברת שריטות וחדר מתקפל לחלל מתורבת בניתוח Vivo של ריפוי פצעים

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Cell migration is an important process that influences many aspects of health, such as wound healing and cancer, and it is, therefore, crucial for developing methods to study the migration. The scratch assay has long been the most common in vitro method to test compounds with anti- and pro-migration properties because of its low cost and simple procedure. However, an often-reported problem of the assay is the accumulation of cells across the edge of the scratch. Furthermore, to obtain data from the assay, images of different exposures must be taken over a period of time at the exact same spot to compare the movements of the migration. Different analysis programs can be used to describe the scratch closure, but they are labor intensive, inaccurate, and forces cycles of temperature changes. In this study, we demonstrate an optimized method for testing the migration effect, e.g. with the naturally occurring proteins Human- and Bovine-Lactoferrin and their N-terminal peptide Lactoferricin on the epithelial cell line HaCaT. A crucial optimization is to wash and scratch in PBS, which eliminates the aforementioned accumulation of cells along the edge. This could be explained by the removal of cations, which have been shown to have an effect on keratinocyte cell-cell connection. To ensure true detection of migration, pre-treating with mitomycin C, a DNA synthesis inhibitor, was added to the protocol. Finally, we demonstrate the automated optical camera, which eliminates excessive temperature cycles, manual labor with scratch closure analysis, while improving on reproducibility and ensuring analysis of identical sections of the scratch over time.

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Here we describe a procedure to test the cell migration in vitro with an automated optical camera microscope. The scratch assay has been widely used where the closure of the scratch is followed for a set period. The optical microscope enables dependable and cheap detection of cell migration.