Name: development of a human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes co-cultured with breast cancer cell lines
Uploaded: 2017-09-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines at JoVE.com

Yibin SCP2 hücre kültürünü sağlamak için Kang ve Cristiano Verna Editör Yardım için teşekkür etmek istiyorum.

insan Osteoklastlar farklılaşmış PBMCs yazılı Onam çalışmaya katılmak için veren sağlıklı donör dan. Çalışma Protokolü 1964 Helsinki Bildirgesi içinde ortaya konan etik standartlarına uygun olarak yerel Etik Komitesi tarafından kabul edildi.
 1. Osteoklast farklılaşma Not: toplamak periferik kan veya buffy kat EDTA içinde sağlıklı insan bağışçılardan. Daha az 20 mL periferik kan kullanmayın. Onlar mononükleer hücreler büyük bir bolluk var çünkü buffy kat tercih edilir. Steril doku kültürü mahallede tüm aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
<ol><li>Seyreltik EDTA tam kan fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x 1 ile 1:1. De yeniden askıya.</li>
	<li>Katman lenfosit ayrılık medya (PBS kan: lenfosit ayrılık medya, 2:1) 50 mL tüpler.
	<ol><li>30 mL 50 mL tüp içine PBS içinde seyreltilmiş kan pipet.</li>
		<li>Yavaşça lenfosit ayrılık medya 15 mL 50 mL tüp dibine temelini.</li>
	</ol></li> <li>(Fren yok) oda sıcaklığında 10 dakika vasıl 757 × g santrifüj.</li>
	<li>Mononükleer hücre toplama: <ol><li>5 mL pipet içeren mononükleer hücrelerin beyaz katman Tantanacı olmadan toplamak ve yeni bir 50 mL tüp içinde yerleştirin.</li>
		<li>20 mL PBS ile toplanan PBMCs sulandırmak.</li>
	</ol></li> <li>PBMCs yıkama: <ol><li>oda sıcaklığında 5 min için 225 x g, santrifüj.</li>
		<li>Süpernatant tüp ters çevirme tarafından atmak. Bir kez yineleyin.</li>
	</ol></li> <li>RBC lizis: Not: hücre Pelet kırmızı hücreleri arabellek çözüm lysing kırmızı kan hücresi ile tedavi edin (bkz. Tablo malzeme).
	<ol><li>Buz üzerinde 50 mL tüp</li>
		<li>Alyuvar arabellek lysing 5 mL ekleyin.</li>
		<li>Eritrosit lizis tamamlamak için 3-5 dakika bekleyin. Zaman eritrosit kirlilik derecesine göre değişir.</li>
		<li>Reaksiyon PBS 20 mL ekleyerek durdurmak.</li>
		<li>Santrifüj 225 x g oda sıcaklığında 5 min için. Süpernatant tüp ters çevirme tarafından atın. 
		Not: İsteğe bağlı: RBC lizis gerçekleştirilirse, aşağıda açıklandığı gibi PBMCs yıka.</li>
	</ol></li> <li>Yıkama PBMCs: <ol><li>, 225 x g oda sıcaklığında 5 min için PBS ve santrifüj 20 mL ekleyin.</li>
		<li>Tüpü ters çevirme süpernatant atmak.</li>
	</ol></li> <li>Tam α-MEM (%1 glutamin (ilk toplama 100 X) ve % 10 fetal sığır serum ile desteklenmiş) hücreleri yeniden askıya alma.</li>
	<li>Neubauer odası içeren hücreleri saymak.
	<ol><li>Örnek 1: 100 buzul Asetik asit seyreltik ve hücreleri saymak için seyreltme 10 µL kullanın.</li>
		<li>En az iki kez saymak ve hücre toplam ortalama sayısı toplanan almak için çoğaltır ortalamasını hesaplamak.</li>
	</ol></li> <li>Plaka hücreleri: <ol><li>plaka 750.000 PBMCs cm 2 başına bir konsantrasyon hücreleri.</li>
		<li>% 5 CO 2 atmosferde 37 ° C'de bir kuluçka kaplama hücreleri depolamak. 
		Not: Normal tam α-MEM MCSF veya RANKL GFs. unutmayın her koşul en az 3'te teknik gerçekleştirmek için olmadan ile tedavi hücreler negatif denetimleri eklemek için deneme tasarım çoğaltır. En az 3 Biyolojik çoğaltır gerçekleştirmek.</li>
	</ol></li> <li>GFs ile desteklenmiş orta değiştirin: <ol><li>3 h hücre tohum sonra bekleyin ve orta tarafından pipet (200-1000 µL)-enkaz, ekli olmayan hücreleri ve eritrositler atmak için Kaldır. 
		Not: hücre dekolmanı önlemek için orta değiştirirken dikkatli olun.</li>
		<li>Eklemek yeni tam α-20 ng/mL ile MCSF takıma MEM (500 µL/de). 
		Not: ne zaman kanser hücreleri ile ortak kültür, gün PBMC tohum sonra tohum kanser hücreleri.</li>
	</ol></li> <li>Medya her 2-3 gün (α-MEM 20 ng/mL ile MCSF takıma) değiştirme: <ol><li>200-1000 µL pipet tarafından orta atın.</li>
		<li>Ekle yeni taze medyum tarafından 200-1000 µL pipet.</li>
	</ol></li> <li>6-7 gün sonra hücre tohum, RANKL 20 ng/mL eklemek için tam α-MEM + MCSF.</li>
	<li>Orta değiştirin (tam α-MEM + MCSF + RANKL) 2-3 günde: <ol><li>200-1000 µL pipet ile orta atın.</li>
		<li>200-1000 µL pipet ile yeni orta ekleyin. Endüksiyon farklılaşma hücre tohum sonra 14 gün durdurmak.</li>
		<li>Atma orta ve yıkama PBS ile ikinci kez.</li>
	</ol></li> <li>Paraformaldehyde ile hücreleri tamir: <ol><li>hücreleri kurumaya bırakın.</li>
		<li>% 4 paraformaldehyde Ekle (Tablo malzemeleri görmek).</li>
		<li>Incubate oda sıcaklığında 20 dk için.</li>
	</ol></li> <li>At paraformaldehyde ve yıkama iki kez 500 µL PBS ile. 
	Dikkat: Paraformaldehyde toksik; Lütfen eldiven, maske ve gözlük tak.</li>
	<li>Hücreleri kuru izin.</li>
	<li>Tuzak gerçekleştirmek üretici göre boyama &#39; s yönergeleri (Tablo malzemeleri görmek).</li>
	<li>El ile 10 X büyütmede mikroskop altında Osteoklast benzeri hücreleri saymak; NA 0,30. 
	Not: Osteoklast benzeri hücreler tuzak + en az 4 çekirdekleri ile polycarion hücreleri olarak tanımlanan.</li>
</ol> 2. Kanser hücre kültürleri Not: meme adenokarsinom hücre hatları SCP2 17, üçlü negatif insandan kaynaklanan bir osteotropic hücre kültürünü gibi farklı türleri ile deneyler yapılabilir meme kanseri hücre kültürünü (MDA-MB-231) ve hormon reseptör pozitif hücre kültürünü MCF7.
<ol><li>Kültür hücreleri bir monolayer 75 cm 2 şişeler içinde olarak.
	<ol><li>75 cm 2 şişeye tohum 1.000.000 kanser hücrelerinde.</li>
		<li>Hücreleri 37 ° C'de % 1 glutamin ve % 10 fetal sığır serum %5 CO 2 atmosferde ile takıma tam α-MEM orta saklayın.</li>
	</ol></li> <li>% 90'ı confluency, hücre bağlantısını kesin: <ol><li>Orta atmak, PBS ile yıkayın ve tripsin 1 X 2-3 mL içinde PBS ekleyin.</li>
		<li>Kuluçkaya hücreler için 37 dakika 3-5 ° C.</li>
		<li>Müstakil hücrelerin enzimatik reaksiyon durdurmak için tam orta 8 mL ekleyerek bir 10 mL pipet tarafından 75 cm 2 şişeye toplamak.</li>
		<li>Vasıl 225 x g 5 dakika süreyle santrifüj</li>
	</ol></li> <li>Kanser hücrelerinin yıkama: <ol><li>PBS 10 mL ekleyin.</li>
		<li>Vasıl 600 x g 5 dakika süreyle santrifüj</li>
	</ol></li> <li>Saymak kanser hücrelerinin Neubauer odası.
	<ol><li>Kanser hücrelerinin sayısı en az iki kez ve hücre toplam ortalama sayısı toplanan almak için çoğaltır ortalamasını hesaplamak.</li>
	</ol></li></ol> 3. Ortak kültür kanser hücrelerinin bir nd monosit geçiren farklılaşma Osteoklastlar doğru doğrudan <ol><li>kanser hücreleri ekler (gözenek çapı 0.4 µm) üzerinde tohum: <ol><li>adlı bir konsantrasyon cm 2 başına 4.000 hücrelerin kanser hücrelerinin tohum.</li>
		<li>Kuluçkaya 37 ° C ve % 5 CO 2 ' de. 
		Not: Gün sonra PBMC 0.4 µm ekler ortak kültür deneyde için tohum tohum kanser hücreleri.</li>
	</ol></li> <li>24 saat bağlı kalmak hücreleri izin vermek bekleyin.</li>
	<li>Yer numaralı seribaşı eklemek kültür mononükleer kültürler üzerinde ortak kültür (bakınız Bölüm 1.10 Protokolü) başlatmak için.</li>
	<li>Medya 2-3 günde tam α-MEM ile değiştirin.
	<ol><li>200-1000 µL pipet ile orta atın.</li>
		<li>Ekle 500 µL taze orta. 
		Not: Kanser hücrelerinin osteoclastogenic gücünü anlamak için birincil amacı, ortak kültür olduğunu, bu nedenle, GFs α-MEM için eklenmez. Ortak kültür her denemeye ne dahilgative denetimleri (bkz: Not Adım 1,10 iletişim kuralı) ve RANKL ve MCSF (kanser hücreleri) tarafından ayrıştırılan Osteoklastlar pozitif kontrol eder. Kanser hücrelerinin mononükleer hücrelerin üstünde yerleştirilmedi ekler numaralı seribaşı ortak kültür negatif bir kontrol kullanılan.</li>
	</ol></li> <li>Ortak kültür durdurun ve kanser hücreleri aşağı akım analizi için kullanın: <ol><li>13 gün sonra PBMC tohum ve kanser hücre tohum sonra 12 gün yeri ekleme yeni bir tabağa.</li>
		<li>Durdurmak kanser hücre kültürü olan aşağı akım analizlerdir (konuya bakın) gerçekleştirilecek.</li>
	</ol></li> <li>Gün 14, durdurmak Osteoklast farklılaşma ve adım 1,15 bildirildiği gibi hücreleri, düzeltmek.</li>
	14-30 gün içinde veya hemen gerçekleştirmek tuzak <li>boyama. 
	Not: İsteğe bağlı boyama: tuzak + polycarion hücreleri Osteoklastlar olduğunu doğrulamak için araştırmacılar to, bir Osteoklast özgü marker algılamak için ek boyama gerçekleştirebilirsiniz. F-aktin yüzük tespiti başka bir Osteoklast özel boyama tahlil 12 , 13 , 14 yaşında.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ibrahim, T., Mercatali, L., Amadori, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+and+cancer:+the+osteoncology.">Bone and cancer: the osteoncology.</a> Clin Cases Miner Bone Metab. 10 (2), 121-123 (2013).</li><li>Coleman, R. E., Rubens, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+course+of+bone+metastases+from+breast+cancer.">The clinical course of bone metastases from breast cancer.</a> Br J Cancer. 55 (1), 61-66 (1987).</li><li>Ibrahim, T., Mercatali, L., Amadori, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+emergency+in+oncology:+bone+metastases+in+breast+cancer+patients.">A new emergency in oncology: bone metastases in breast cancer patients.</a> Oncol Lett. 6 (2), 306-310 (2013).</li><li>Swartz, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+microenvironment+complexity:+emerging+roles+in+cancer+therapy.">Tumor microenvironment complexity: emerging roles in cancer therapy.</a> Cancer Res. 72 (10), 2473-2480 (2012).</li><li>Roodman, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+bone+metastasis.">Mechanisms of bone metastasis.</a> N Eng J Med. 350 (12), 1655-1664 (2004).</li><li>Patel, L. R., Camacho, D. F., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cancer+cell+metastasis+to+the+bone:+a+multistep+process.">Mechanisms of cancer cell metastasis to the bone: a multistep process.</a> Future Oncol. 7 (11), 1285-1297 (2011).</li><li>Chen, Y. C., Sosnoski, D. M., Mastro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+metastasis+to+the+bone:+mechanisms+of+bone+loss.">Breast cancer metastasis to the bone: mechanisms of bone loss.</a> Breast Cancer Res. 12 (6), 215 (2010).</li><li>Guise, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+bone+metastases:+it's+all+about+the+neighborhood.">Breast cancer bone metastases: it's all about the neighborhood.</a> Cell. 154 (5), 957-959 (2013).</li><li>Ell, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-induced+osteoclast+miRNA+changes+as+regulators+and+biomarkers+of+osteolytic+bonemetastasis.">Tumor-induced osteoclast miRNA changes as regulators and biomarkers of osteolytic bonemetastasis.</a> Cancer Cell. 24 (4), 542-556 (2013).</li><li>Lu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VCAM-1+promotes+osteolytic+expansion+of+indolent+bone+micrometastasis+of+breast+cancer+by+engaging+&#945;4&#946;1-positive+osteoclast+progenitors.">VCAM-1 promotes osteolytic expansion of indolent bone micrometastasis of breast cancer by engaging &#945;4&#946;1-positive osteoclast progenitors.</a> Cancer Cell. 20 (6), 701-714 (2011).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+osteogenic+niche+promotes+early-stage+bone+colonization+of+disseminated+breast+cancer+cells.">The osteogenic niche promotes early-stage bone colonization of disseminated breast cancer cells.</a> Cancer Cell. 27 (2), 193-210 (2015).</li><li>Liverani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CSF-1+blockade+impairs+breast+cancer+osteoclastogenic+potential+in+co-culture+systems.">CSF-1 blockade impairs breast cancer osteoclastogenic potential in co-culture systems.</a> Bone. 66, 214-222 (2014).</li><li>Mercatali, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+everolimus+in+an+in+vitro+model+of+triple+negative+breast+cancer+and+osteoclasts.">The effect of everolimus in an in vitro model of triple negative breast cancer and osteoclasts.</a> Int J Mol Sci. 1 (11), e1827 (2016).</li><li>Glantschnig, H., Fisher, J. E., Wesolowski, G., Rodan, G. A., Reszka, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-CSF,+TNFalpha+and+RANK+ligand+promote+osteoclast+survival+by+signaling+through+mTOR/S6+kinase.">M-CSF, TNFalpha and RANK ligand promote osteoclast survival by signaling through mTOR/S6 kinase.</a> Cell DeathDiffer. 10 (10), 1165-1177 (2003).</li><li>Sugatani, T., Hruska, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt1/Akt2+and+mammalian+target+of+rapamycin/Bim+play+critical+roles+in+osteoclast+differentiation+and+survival,+respectively,+whereas+Akt+is+dispensable+for+cell+survival+in+isolated+osteoclast+precursors.">Akt1/Akt2 and mammalian target of rapamycin/Bim play critical roles in osteoclast differentiation and survival, respectively, whereas Akt is dispensable for cell survival in isolated osteoclast precursors.</a> J Biol Chem. 280 (5), 3583-3589 (2005).</li><li>Bertoldo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+bone+metastatic+cancer:+role+of+the+mTOR+pathway.">Targeting bone metastatic cancer: role of the mTOR pathway.</a> Biochim Biophys Acta. 1845 (2), 248-254 (2014).</li><li>Kang, Y., Siegel, P. M., Shu, W., Drobnjak, M., Kakonen, S. M., Cord&#243;n-Cardo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multigenic+program+mediating+breast+cancer+metastasis+to+bone.">A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone.</a> Cancer Cell. 3 (6), 537-549 (2003).</li><li>Simone, V., Ciavarella, S., Brunetti, O., Savonarola, A., Cives, M., Tucci, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Everolimus+restrains+the+paracrine+pro-osteoclast+activity+of+breast+cancer+cells.">Everolimus restrains the paracrine pro-osteoclast activity of breast cancer cells.</a> BMC Cancer. 14 (15), 692 (2015).</li></ol>

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Kanser hücreleri ve kemik hücreleri arasında çapraz karışma mekanizmaları eğitim preklinik vitro modelleri yeni tedavi stratejileri oluşturmak için kullanılan kemik metastaz mekanizmaları tanımlamak için gereklidir. Osteoclastogenesis insan periferik kan (şekil 3) üzerinden tamamen insan vitro modeli geliştirdik. Metodoloji en iyileştirme sırasında bir dizi kritik noktaları tespit ve giderilir. İlk tohum mononükleer hücrelere miktarı ilgili. Lenfositler ve monosit, tohum osteoclastogenesis deneme için hedef hücrelere ikinci olmak arasında ayırt etmek zor olduğu gibi mikroskop sayısına göre elde edilen hücre sayısı yalnızca kaba bir miktar var. Monosit lenfositler için plastik yüzey uymayan ve çoğu orta ilk değişiklik böylece elendi çünkü tanımlamak başardık. Hücreleri hücrelere farklılaşma, özellikle de osteoclastogenesis öncesi Osteoklastlar birbirine yakın sigorta ve olmak için olması gereken ikinci aşaması için etkileşim ile her diğer edebilmek için gerekli olduğu gibi yüksek yoğunluklu, seribaşı Olgun Osteoklastlar. Olduğunda birden çok deneysel koşullar bunlar hücre sayısının yüksek ve çok miktarda kan gerektirdiği için daha fazla zorluk ortaya çıkar. Olası bir çözüm PBMCs, örneğinyüksek konsantrasyon var buffy kat kullanmak için 4 x 105-6 x 106 mononükleer hücreler normalde 50 mL buffy kat örnekten daha az 1 x 105 toplanan PBMCs göre toplanan bir 20 mL kan örneği.
Kan örnekleri farklı gönüllüler toplandı olduğu ölçüde değişkenlik osteoclastogenesis tahlil. Böylece her tahlil ile en az 3-4 teknik çoğaltır gerçekleştirmek önemliydi. Biyolojik çoğaltır da ihtiyaç vardı ve farklı sağlıklı bağış kullanıldı gibi biz normalde farklı deneyler tarafından elde edilen değerlerin ortalamasını hesaplama değil. Biz farklı testler eğilimleri eşdeğer ve o zaman bir el yazması dahil edilecek sağlıklı bağışçıların bir deney açmadı sağlamıştır.
Preklinik modelimiz ile kanser hücrelerinin farklılaşma geçiren monosit, ortak kültür içerir. Biz daha önce gösterdiğim gibi kanser hücrelerinin de vitro osteoclastogenesis12,13karşılayabilir. Kanser hücreleri ve Osteoklastlar üzerinde birkaç aşağı akım analizleri gerçekleştirmek mümkün olduğu kadar bu sistemi ilaçları test veya etkileşim mekanizmaları araştırmak için kullanılabilir. Aslında, kanser hücrelerinin ve gen ifade analizleri/Western blot deneyleri her iki kanser hücreleri ve Osteoklastlar13proliferasyon deneyleri gerçekleştirmek mümkündür. Bu olmak nasıl salgılanan proteinler anlamak için ilgi farklı farklı koşullarda. Bizim modeli bir çok avantaj, Yani, bu fare hücre hatları, literatürde bildirilen çeşitli modeller farklı olarak bağımlı değildir tamamen insan modeli. Modeli de oldukça sağlam ve tekrarlanabilir ve başka amaçlar için kullanılabilir. Örneğin, diğer kanser hücre satırları Osteoklastlar ve osteoclastogenic güçlerini okudu farkı ile birlikte kültürlü olabilir. Ayrıca, bu sistem kemik Biyoloji ve Osteoklast aracılı Osteoporoz gibi hastalıkların anlayışımızı geliştirmek için diğer fizyolojik veya patolojik mekanizmaları değerlendirmek için kullanılabilir. Diğer sitokinler ve hücre türü de Osteoklastlar bağlı olarak deneme amacı ile birlikte ortak kültürlü olabilir.
Birkaç aşağı akım analizleri bu model ile mümkündür. Çalışma tasarım aşamasında ne karar vermek önemlidir böylece kuyu yeterli sayıda seribaşı analizler yapılır.
Aşağı akım deneyleri Osteoklastlar ile:
(i) gen ifade analizleri. Osteoklastlar toplam RNA, ayıklamak için ek kuyu planı tuzak değerlendirme için lekeli wells RNA çıkarma için kullanılabilir değil. (ii) Western blot analizi. (iii) miktar Osteoklast yüzey alanının. Osteoklast boyutu parametresi Osteoklast olgunlaşma için ImageJ gibi açık kaynak yazılımlar kullanarak sayılabilir.
Kanser hücreleri ile aşağı akım deneyleri:
(i) proliferasyon deneyleri MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromür gibi. (ii) gen ifade analizleri. (iii) Western blot analizi.
Aşağı akım deneyleri Osteoklastlar ve kanser hücrelerinin (ortak kültür):
Kanser hücreleri ve Osteoklastlar aynı kültür orta payı olarak, onların etkileşim hangi analyzesthe salgılanması belirli sitokinler, GFs ve diğer proteinler salgılanan ELISA tahlil ile okudu.
Bu model geliştirilmesi projemiz için çok önemli ve biz yakın gelecekte daha da geliştirmek için plan. Önemli bir adım ileri 3D mineralize kollajen iskele kopyalama kemik matrisi için monosit ayırt etmek olurdu. Sonra doğrudan Osteoklast etkinlik kemik rezorpsiyonu tahlil ile değerlendirmek mümkün olacaktır. Kemik metastazı düzenleyen için kemik remodeling fizyolojik ve patolojik işleme arasında değişen içinde Osteoklastlar oynadığı farklı rolleri hakkında daha fazla bilgi devam ederken, bizim model yalıtmak ve Osteoklastlar tüp bebek eğitimi araştırmacılar olanak sağlar .

Kemik metastaz kemik metastazı hastalığı1,2,3boyunca gelişen hastaların % 20-25 ile birincil tümörler prostat, akciğer ve göğüs kanseri gibi farklı türleri için ortak bir sitedir. Özellikle, meme kanserli hastalarda % 70'i ölüm4' de kemik metastaz kanıtı taşımak. Tümör ve stromal hücre etkileşim birincil kanser ve ikincil Lezyonlar kanser ilerlemesi için gerekli. Kemik microenvironment osteolitik kemik metastazı meme kanseri kanser hücreleri, kemik hücreleri ve kemik microenvironment arasında meydana gelen patolojik bir kısır döngü kurulması bağlıdır. Kanser hücreleri kemik rezorpsiyonu5,6,7artan kemik dengesini bozabilir.
Yeni Matris, para yatırmak içinde dokusunu, yeni kemik oluşumu8için sorumlu ise normal ve patolojik koşullarda Osteoklastlar kemik rezorpsiyonu için sorumlu hücrelerdir. Osteoklast etkinlik dokusunu aracılığıyla onun reseptör sırası öncesi Osteoklast yüzeyinde bağlar, ön Osteoklast füzyon, olgun Osteoklastlar içine farklılaşması için gerekli bir işlem inducing RANKL, ifade tarafından düzenlenmiştir. Osteoclastogenesis indüksiyon kemik rezorpsiyonu artırır. Vivo çalışmalar çok sayıda anlayışımız kemik metastaz oluşumu9,10,11önemli ölçüde iyileştirilmiştir. Meme kanseri hücrelerinin birincil tümör ve kemik microenvironment osteoclastogenesis teşvik kemik Homeostazı, huzursuz ve kemik rezorpsiyonu8. Bu senaryoda, ortaya çıkan tüm moleküler arasındaki etkileşimler kanser hücreleri ve Osteoklastlar çok önemli önemlidir. Zaten belirtildiği gibi kemik metastaz oluşumunu mekanizmasının vivo içinde fare modellerinde aydınlatılmamıştır. Ancak, tüm in vivo hayvan deneyleri Etik Komitesi tarafından onaylanması gereksiniminin yanı sıra, in vivo deneyler yüksek maliyetler ve zaman alıcı yöntemleri de dahil olmak üzere performans çeşitli dezavantajları vardır. Birden çok yazar öncesi Osteoklastlar RAW246.79,10,11denilen bir fare satırını kullanarak osteoclastogenesis preklinik in vivo ve in vitro modelleri birleştirdik. Bu model sakıncaları hücreleri zaten öncesi Osteoklastlar olmaya kararlı olan ve insan kaynağı değildir aslında kaynaklanıyor. Bu nedenlerden dolayı translasyonel araştırma kemik kanseri hücre etkileşimleri çalışmaya vitro tamamen insan preklinik modelleri kullanılabilirliğini büyük ölçüde yarar.
Osteoclastogenesis vitro insan periferik kan örnekleri12,13başlayarak yöntemi en iyi duruma getirilmiş. Periferik kan örneklerinde var, olmayan bir küçük ölçüde de olsa, monosit, Osteoklastlar kaynaklanmaktadır. Mononükleer hücreler eritrositler ve granülosit tam kan içinde mevcut gelen ilk Ficoll yoğunluk gradient tarafından ayrılır; Onlar o zaman aksine lenfositler plastik yüzey uygun yeteneği sayesinde seçilir. Tohum sonra hücre için 14 gün kültürlü. MCSF ve RANKL monosit tarafından ilk makrofajlar ve sonra içine Osteoklastlar14,15ayırt etmek için gereken GFs vardır. RANKL farklılaşma süreci osteoclastogenesis geç dönemlerinde ikna etmek için kullanılır, ancak MCSF testin süresi boyunca gereklidir. Farklılaşma erken aşamasında MCSF çoğalırlar ve14,15hayatta monosit yardımcı olur. Osteoclastogenesis ikinci bölümü sırasında hücreleri birlikte sigorta ve yüzükler aktin F karakteristik dağılımını gösteren ve tartarat dayanıklı asit fosfataz (tuzak) ve Kalsitonin reseptör gibi belirli işaretleri ifade Osteoklastlar olarak olgun (TO) 14 , 15. bizim yöntem MCSF monosit kültür deneme ve bir arada MCSF ve RANKL ilk 7 gün 7-14 gün sonra ekleyerek oluşur. Deneme sonunda osteoclastogenesis farklılaşmış hücreler, aşağıda açıklandığı gibi sayılarak analiz edilir.
GFs tarafından ayırt etmek için indüklenen monosit kültürler preklinik modelimiz temelini oluşturur. Ortak kültür sistemi olmadan GFs meme kanseri hücrelerinin osteoclastogenic gücünü daha iyi anlamak için en iyi duruma getirilmiş. Biz ilk geliştirilen bir model dolaylı ortak kültürlerin bir orta ekleyerek (% 80 α-en az gerekli orta (α-MEM) ve % 20 şartına orta toplanan meme kanseri hücrelerinin bir kültür yaklaşık % 90 birleşmesi hücrelere farklılaşma12 geçirmekte olduğunu . (Serum yoksunluğu koşullar altında toplanan değil) şartına orta 24 saat sonra toplanan ve bir oran 1:4, taze orta karışık. Klimalı orta negatif kontrol ile ilgili olarak önemli Osteoklast farklılaşma indüklenen. Kanser hücreleri ve kemik hücreleri arasındaki karşılıklı etkileşimi hakkında bilgi kayıp olarak dolaylı ortak kültürler kullanırken, ancak, biz bizim sistemi doğrudan ortak kültürler taşıyarak geliştirilmiş. Kanser hücreleri µM ekler ve wells nerede mononükleer hücreler kaplama yerleştirdiler 0,4 numaralı seribaşı. Bu yöntemi kullanarak, hücreleri aynı ortamı paylaşmak ve salgılanan proteinler değişimi. Böylece kanser hücreleri13tarafından indüklenen osteoclastogenesis tamamen insan preklinik modeli yarattık.
Bu sistem son derece çok yönlü ve farklı araştırma amaçlı, örneğin, farmakolojik çalışmalar kemik metastaz uyuşturucu rolünün araştırılması için kullanılabilir. Bizim model çalışma etkinliği ve mekanizmaları eylem kemik hedefli tedaviler ve/veya kemik microenvironment kanser hücreleri13huzurunda antitümör ilaçların olanak sağlar. Doğru kontroller ile deney tasarımı, Yani, kanser hücrelerinin ve tek tek, kültürlü Osteoklastlar yapar uyuşturucu faaliyeti hakkında ortak kültür etkisini anlamak daha kolay. Her iki kanser hücreleri ve Osteoklastlar, örneğin, everolimus16okudu uyuşturucu hedefleyen bu yaklaşım daha da ilginç hale gelir. Bu model de kanser hücreleri ve kemik hücreleri arasındaki etkileşimin yeni yollar tanımlamak için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>&amp;alpha;MEM</td><td>Euroclone</td><td>BE12-169F</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Life-technologies</td><td>ECB3000D</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Life-technologies</td><td>ECS0180DPR</td><td></td></tr><tr><td>hMCSF</td><td>Peprotech</td><td>300-25</td><td>Storage indications must be respected</td></tr><tr><td>hRANKL</td><td>Peprotech</td><td>310-01</td><td>Storage indications must be respected</td></tr><tr><td>Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>387 A</td><td></td></tr><tr><td>Lymphocyte separation media</td><td>Biowest</td><td>L0560-100</td><td></td></tr><tr><td>Red Blood cell lysing buffer</td><td>SIgma</td><td>11814389001&lt;br/&gt; ROCHE</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>EuroClone</td><td>COD.&lt;br/&gt; ECB3052D</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>157-4-100</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231 cell line</td><td>ATCC</td><td>CRM-HTB-267</td><td></td></tr><tr><td>MCF7</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Corning</td><td>3470-Clear</td><td>These inserts are for 24-well plates;&lt;br/&gt; 6.5 mm, 0.4 &amp;mu;M;&lt;br/&gt; pore size</td></tr></tbody></table>

development of a human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes co-cultured with breast cancer cell lines

Tümör hücreleri ve kemik microenvironment kemik hücreleri arasında çapraz karışma kemik metastaz oluşumunu mekanizmasını anlamak için önemlidir. Meme kanseri hücreleri ve farklılaşma Osteoklastlar doğru geçiren monosit ortak bir kültürün bir vitro tamamen insan preklinik modeli geliştirdik. Periferik kan sağlıklı bağışçılardan toplanan başlayarak osteoclastogenesis modeli en iyi duruma getirilmiş. Periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) yoğunluk gradient Santrifüjü tarafından ayrılmış ilk, yüksek yoğunluklu seribaşı ve iki büyüme faktörleri (GDS) ekleyerek ayırt etmek için indüklenen: reseptör aktivatör nükleer faktör-κB ligand (RANKL) ve makrofaj Koloni uyarıcı faktör (MCSF). Hücreleri kültüründe 14 gün boyunca yaptı ve sonra sabit ve aşağı akım analizi ile analiz. Osteolitik kemik metastazı osteoclastogenesis indüksiyon etkileri kemik kanseri hücre varış biridir. Biz böylece meme kanseri hücreleri kanser hücrelerinin GFs ile ilgili olarak ayırt etme gücünü çalışmaya ortak kültürleri modelimizle meydan. Kanser hücre-Osteoklast etkileşim okuyan bir kolay yolu meme kanseri hücre kültürleri toplanan ve taze orta ile karışık şartına orta kullanımı dayalı dolaylı ortak kültürler gerçekleştirmektir. Bu karışım daha sonra Osteoklast farklılaşma ikna etmek için kullanılır. Biz de en iyi duruma getirilmiş bir yöntem hangi kanser hücreleri ve başkalaşım geçiren monosit orta paylaşmak ve salgılanan etkenler Döviz doğrudan ortak kültür. Araştırmacılar iki hücre tiplerinin karşılıklı etkileşimleri gözlemlemek ve kanser hücreleri ve Osteoklastlar için aşağı akım çözümlemesi gibi özgün dolaylı ortak kültür yöntemi üzerinde önemli bir gelişme bu. Bu yöntem metastatik kemik microenvironment ve tohum hücrenin satırlarına meme kanserinden türetilmiş dışındaki ilaçlar etkisini incelemek bize sağlar. Modeli de diğer hastalıklar gibi Osteoporoz veya diğer kemik koşulları incelemek için kullanılabilir.

Bir yöntem Osteoklastlar insan periferik kan monosit kolayca ayırt etmek için optimize edildi. Monosit kültür ile kanser hücrelerinin, kanser hücrelerinin osteoclastogenesis kemik metastazı olarak sürdürülmesi yeteneğine sahiptirler (edebiyat18' açıklandığı gibi) teyit kültürlü. Osteoklastlar kanser hücreleri ayrıştırılan ve GFs şekil 1' de gösterilmiştir. Bir Osteoklast benzeri hücre 4 veya daha fazla hücre çekirdeği ile bir hücre ve (mor hücreleri) Boyama tuzak için olumlu. Kabul edilen kesme bir Osteoklast tanımlamak için kullanılan çekirdek sayısı 3 olan18, ama biz karar için en az yanlış mutlak riskini azaltmak için 4 kullanın.
Kanser hücreleri tarafından indüklenen Wells Osteoklastlar sayısı pozitif kontrol (Şekil 2) elde için benzer olduğu için model bu meme kanseri hücreleri sürekli osteoclastogenesis gösterir. Şekil 2Agösterildiği gibi hücre sayısı da kendiliğinden Osteoklastlar negatif kontrol içine farklı. Model kullanışlılığı onaylamak için sistem bir antitümör uyuşturucu12,13ile karşılaşıyordu. Osteoklast numaraları ortak kültür koşullar ve negatif kontrol (to-) örneklerinde pozitif kontrol (CTR +) örnekleri daha yüksekti. Osteoklast numaraları ortak kültür koşulları ve olumlu denetimleri (CTR +) ilaç (everolimus) varlığında önemli ölçüde azalmıştır. İstatistiksel analizler için t-Testi kullanılmıştır. Hücrelerin her biri sayılan iyi. Yüzey bacaklarindan Osteoklast olgunlaşma özelliğidir ve ImageJ gibi açık kaynak yazılımlar kullanılarak analiz edilebilir. GDS türetilmiş Osteoklastlar kanser hücreleri (şekil 2B) tarafından indüklenen daha büyük. Bir antitümör ilaç (everolimus) ile tedavi GFs efektler açılır. Yararlı bilgiler osteoclastogenesis inhibisyon ilaç rolünü sağlanan. Şekil 2C osteoclastogenesis huzurunda uyuşturucu azalma gösterir. Bu sonuçlar co-op culture kaynaklı osteoclastogenesis tarafından elde edilmiştir. Protokol bölümünde açıklandığı gibi bir dizi diğer aşağı akım analizleri mekanizmaları çapraz karışma ve/veya analiz ilaçların araştırmak için gerçekleştirilebilir. Şekil 3 ' te özetlenmiştir modeli son derece versatileand uyuşturucu etkisi kanser hücreleri, özellikle, Osteoklastlar çalışma için kullanılabilir olduğunu.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56311/56311fig1.jpg"> 
Şekil 1. Osteoclastogenesis tahlil. Hücre kültüründe 14 gün sonra lekeli. TO-monosit büyüme faktörleri yokluğunda kültürlü; RANKL ve MCSF büyüme faktörleri ile kültürlü CTR + monosit; COCO, kan hücreleri kanser hücreleri ile birlikte kültür tarafından elde edilen Osteoklastlar. 10 X büyütme. Osteoklast benzeri hücreler hücreleri ile tuzak (mor hücreleri) pozitif en az 4 çekirdek olduğunu. Hücreleri her şey hücrelerde sayarak sayısal; Her koşul için 4 çoğaltır gerçekleştirilen ve ortalama hesaplanır. Ölçek çubuğu 400 µm var. Görüntüyü yakınlaştırma alt panelinde (100 X) 2 Osteoklastlar (kırmızı daireler) yüzey alanı gösterir. Oklar Osteoklast çekirdekler gösterir. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56311/56311fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56311/56311fig2.jpg"> 
Şekil 2. Osteoclastogenesis tedavi everolimus etkisi. (A)bir ilaç varlığı/yokluğu göre Osteoklastlar sayısı; Her koşul için 4 çoğaltır yapıldı. TO-monosit büyüme faktörleri yokluğunda kültürlü; RANKL ve MCSF büyüme faktörleri ile kültürlü CTR + monosit; COCO, kan hücreleri kanser hücreleri ile birlikte kültür tarafından elde edilen Osteoklastlar. Verileri ortalama ± SE ifade edilir. Önemi t-testi tarafından değerlendirilmiştir; * p &#60; 0,05. Yüzey alanı ImageJ tarafından hesaplanmıştır (B) Osteoklast açık kaynak yazılım. Koşul başına en az 50 Osteoklastlar ölçüldü. TO-monosit büyüme faktörleri yokluğunda kültürlü; RANKL ve MCSF büyüme faktörleri ile kültürlü CTR + monosit; COCO, kan hücreleri kanser hücreleri ile birlikte kültür tarafından elde edilen Osteoklastlar. Hücre kültürü yokluğu veya bir antitümör ilaç (everolimus) varlığı içinde 14 gün sonra (C) görüntüler. 10 X büyütme; Ölçek çubuğu var. 400 µm <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56311/56311fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56311/56311fig3.jpg"> 
Şekil 3. Ortak kültür modeli. Düzeni modeli ve olası aşağı akım analizleri ve gelecekteki uygulamalar. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56311/56311fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines at JoVE.com

Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

Bu iletişim kuralı bir vitro insan preklinik modeli osteoclastogenesis kanser hücre-Osteoklast etkileşimi taklit etmek için meme kanseri hücre hatları ile kültürlü periferik kan monosit üzerinden gelişimi anlatılmaktadır. Model kemik metastaz oluşumunu anlayışımız daha fazla ve tedavi olanakları geliştirmek için kullanılabilir.

Osteoclastogenesis periferik kan monosit kültürlü meme kanseri hücre hatları ile birlikte gelen bir insan preklinik modelinin geliştirilmesi

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

development-human-preclinical-model-osteoclastogenesis-from

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

7.0K Görüntüleme.  IRCCS. Bu iletişim kuralı bir vitro insan preklinik modeli osteoclastogenesis kanser hücre-Osteoklast etkileşimi taklit etmek için meme kanseri hücre hatları ile kültürlü periferik kan monosit üzerinden gelişimi anlatılmaktadır. Model kemik metastaz oluşumunu anlayışımız daha fazla ve tedavi olanakları geliştirmek için kullanılabilir.

Video: Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract (ECME)-based Three-dimensional System

Embedded in the extracellular matrix (ECM), normal and neoplastic epithelial cells intimately communicate with hematopoietic and non-hematopoietic cells, thus greatly influencing normal tissue homeostasis and disease outcome. In breast cancer, tumor-associated macrophages (TAMs) play a critical role in disease progression, metastasis, and recurrence; therefore, understanding the mechanisms of monocyte chemoattraction to the tumor microenvironment and their interactions with tumor cells is important to control the disease. Here, we provide a detailed description of a three-dimensional (3D) co-culture system of human breast cancer (BrC) cells and human monocytes. BrC cells produced high basal levels of regulated on-activation, normal T-cell expressed and secreted (RANTES), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (G-CSF), while in co-culture with monocytes, pro-inflammatory cytokines Interleukin (IL)-1 beta (IL-1&#946;) and IL-8 were enriched together with matrix metalloproteinases (MMP)-1, MMP-2, and MMP-10. This tumor stroma microenvironment promoted resistance to anoikis in MCF-10A 3D acini-like structures, chemoattraction of monocytes, and invasion of aggressive BrC cells. The protocols presented here provide an affordable alternative to study intra-tumor communication and are an example of the great potential that in vitro 3D cell systems provide to interrogate specific features of tumor biology related to tumor aggression.

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract ECME-based Three-dimensional System

Here, we describe a three-dimensional culture method to analyze the morphology of primary breast cancer cells, as well as to study their direct/indirect interactions with monocytes and the outcomes such as collagen degradation, immune cell recruitment, cell invasion, and promotion of cancer-related inflammation.

Monosit ve bir hücre dışı matriks içinde birincil meme kanseri hücreleri arasındaki iletişimi analiz özü (ECME)-üç boyutlu sistem tabanlı

Embedded in the extracellular matrix (ECM), normal and neoplastic epithelial cells intimately communicate with hematopoietic and non-hematopoietic cells, ...

Kanser Araştırmaları

Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. 
Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.
This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.

Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

Fare Osteoklast Öncüleri Notch Sinyal uyarılması

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro ...

Gelişim Biyolojisi

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods rely on the ability of cells either to attach to a solid substratum of a tissue culture dish or to grow in suspension in liquid medium. Multiple immortal cell lines have been created and grown using such approaches, however, these methods frequently fail when primary cells need to be grown ex vivo. Such failure has been attributed to the absence of the appropriate extracellular matrix components of the tissue microenvironment from the standard systems where tissue culture plastic is used as a surface for cell growth. Extracellular matrix is an integral component of the tissue microenvironment and its presence is crucial for the maintenance of physiological functions such as cell polarization, survival, and proliferation. Here we present a 3-dimensional tissue culture method where primary bone marrow cells are grown in extracellular matrix formulated to recapitulate the microenvironment of the human bone (rBM system). Embedded in the extracellular matrix, cells are supplied with nutrients through the medium supplemented with human plasma, thus providing a comprehensive system where cell survival and proliferation can be sustained for up to 30 days while maintaining the cellular composition of the primary tissue. Using the rBM system we have successfully grown primary bone marrow cells from normal donors and patients with amyloidosis, and various hematological malignancies. The rBM system allows for direct, in-matrix real time visualization of the cell behavior and evaluation of preclinical efficacy of novel therapeutics. Moreover, cells can be isolated from the rBM and subsequently used for in vivo transplantation, cell sorting, flow cytometry, and nucleic acid and protein analysis. Taken together, the rBM method provides a reliable system for the growth of primary bone marrow cells under physiological conditions.

In standard culture methods cells are taken out of their physiological environment and grown on the plastic surface of a dish. To study the behavior of primary human bone marrow cells we created a 3-D culture system where cells are grown under conditions recapitulating the native microenvironment of the tissue.

İlköğretim İnsan Kemik İliği ve Maligniteleri Eğitim Bir Üç boyutlu Doku Kültürü Modeli

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

Tıp

Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little is known about breast cancer cell properties and behaviors within the native microenvironment of human bone tissue.We have developed approaches to track, quantify and modulate human breast cancer cells within the microenvironment of cultured human bone tissue fragments isolated from discarded femoral heads following total hip replacement surgeries. Using breast cancer cells engineered for luciferase and enhanced green fluorescent protein (EGFP) expression, we are able to reproducibly quantitate migration and proliferation patterns using bioluminescence imaging (BLI), track cell interactions within the bone fragments using fluorescence microscopy, and evaluate breast cells after colonization with flow cytometry. The key advantages of this model include: 1) a native, architecturally intact tissue microenvironment that includes relevant human cell types, and 2) direct access to the microenvironment, which facilitates rapid quantitative and qualitative monitoring and perturbation of breast and bone cell properties, behaviors and interactions. A primary limitation, at present, is the finite viability of the tissue fragments, which confines the window of study to short-term culture. Applications of the model system include studying the basic biology of&#160;breast cancer and other bone-seeking malignancies within the metastatic niche, and developing therapeutic strategies to effectively target breast cancer cells in bone tissues.

Protocols are described for studying breast cancer cell migration, proliferation and colonization in a human bone tissue explant model system.

Kültürleme İnsan Femur Doku Eksplantlarından yöntemleri Metastatik Niche Meme Kanseri Hücre Kolonizasyon Eğitim için

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...

Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro

It is well established that the bone marrow microenvironment provides a unique site of sanctuary for hematopoietic diseases that both initiate and progress in this site. The model presented in the current report utilizes human primary bone marrow stromal cells and osteoblasts as two representative cell types from the marrow niche that influence tumor cell phenotype. The in vitro co-culture conditions described for human leukemic cells with these primary niche components support the generation of a chemoresistant subpopulation of tumor cells that can be efficiently recovered from culture for analysis by diverse techniques. A strict feeding schedule to prevent nutrient fluxes followed by gel type 10 cross-linked dextran (G10) particles recovery of the population of tumor cells that have migrated beneath the adherent bone marrow stromal cells (BMSC) or osteoblasts (OB) generating a "phase dim" (PD) population of tumor cells, provides a consistent source of purified therapy resistant leukemic cells. This clinically relevant population of tumor cells can be evaluated by standard methods to investigate apoptotic, metabolic, and cell cycle regulatory pathways as well as providing a more rigorous target in which to test novel therapeutic strategies prior to pre-clinical investigations targeted at minimal residual disease.

Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro

The current report summarizes a protocol that can be utilized to model the influence of the bone marrow microenvironment niche on leukemic cells with emphasis placed on enrichment of the most chemoresistant subpopulation.

Modelleme Kemoterapi Dayanıklı Lösemi<em&gt; İn Vitro</em

It is well established that the bone marrow microenvironment provides a unique site of sanctuary for hematopoietic diseases that both initiate and ...

Differentiation and Characterization of Osteoclasts from Human Induced Pluripotent Stem Cells

This protocol details the propagation and passaging of human iPSCs and their differentiation into osteoclasts. First, iPSCs are dissociated into a single-cell suspension for further use in embryoid body induction. Following mesodermal induction, embryoid bodies undergo hematopoietic differentiation, producing a floating hematopoietic cell population. Subsequently, the harvested hematopoietic cells undergo a macrophage colony-stimulating factor maturation step and, finally, osteoclast differentiation. After osteoclast differentiation, osteoclasts are characterized by staining for TRAP in conjunction with a methyl green nuclear stain. Osteoclasts are observed as multinucleated, TRAP+ polykaryons. Their identification can be further supported by Cathepsin K staining. Bone and mineral resorption assays allow for functional characterization, confirming the identity of bona fide osteoclasts. This protocol demonstrates a robust and versatile method to differentiate human osteoclasts from iPSCs and allows for easy adoption in applications requiring large quantities of functional human osteoclasts. Applications in the areas of bone research, cancer research, tissue engineering, and endoprosthesis research could be envisioned.

This protocol presents the differentiation of human osteoclasts from induced pluripotent stem cells (iPSCs) and describes methods for the characterization of osteoclasts and osteoclast precursors.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Osteoklastların Farklılaşması ve Karakterizasyonu

This protocol details the propagation and passaging of human iPSCs and their differentiation into osteoclasts. First, iPSCs are dissociated into a ...

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused by increased differentiation and activation of OCs, so the inhibition of this pathobiology is a key therapeutic principle.Two key factors drive the differentiation of OCs from myeloid precursors: macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) and receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL). Human circulating CD14+ monocytes have long been known to differentiate into OCs in vitro. However, the exposure time and the concentration of RANKL influence the differentiation efficiency. Indeed, protocols for the generation of human OCs in vitro have been described, but they often result in a poor and lengthy differentiation process. Herein, a robust and standardized protocol for generating functionally active mature human OCs in a timely manner is provided. CD14+ monocytes are enriched from human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and primed with M-CSF to upregulate RANK. Subsequent exposure to RANKL generates OCs in a dose- and time-dependent manner. OCs are identified and quantified by staining with tartrate acid-resistant phosphatase (TRAP) and light microscopy analysis. Immunofluorescence staining of nuclei and F-actin is used to identify functionally active OCs. In addition, OSCAR+CD14&#8722; mature OCs are further enriched via flow cytometry cell sorting, and OC functionality quantified by mineral (or dentine/bone) resorption assays and actin ring formation. Finally, a known OC inhibitor, rotenone, is used on mature OCs, demonstrating that adenosine triphosphate (ATP) production is essential for actin ring integrity and OC function. In conclusion, a robust assay for differentiating high numbers of OCs is established in this work, which in combination with actin ring staining and an ATP assay&#160;provides a useful in vitro model to evaluate OC function and to screen for novel therapeutic compounds that can modulate the differentiation process.

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Osteoclasts are key bone-resorbing cells in the body. This protocol describes a reliable method for the in vitro differentiation of osteoclasts from human peripheral blood monocytes. This method can be used as an important tool to further understand osteoclast biology in homeostasis and in diseases.

Fonksiyonel Osteoklastların İnsan Periferik Kanı CD14+ Monositlerinden Farklılaşması

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the organic and inorganic matrices of bone means that they play a key role in regulating skeletal remodeling. Together, osteoblasts and osteoclasts are responsible for the dynamic coupling process that involves both bone resorption and bone formation acting together to maintain the normal skeleton during health and disease.
As the principal bone-resorbing cell in the body, changes in osteoclast differentiation or function can result in profound effects in the body. Diseases associated with altered osteoclast function can range in severity from lethal neonatal disease due to failure to form a marrow space for hematopoiesis, to more commonly observed pathologies such as osteoporosis, in which excessive osteoclastic bone resorption predisposes to fracture formation.
An ability to isolate osteoclasts in high numbers in vitro has allowed for significant advances in the understanding of the bone remodeling cycle and has paved the way for the discovery of novel therapeutic strategies that combat these diseases. 
Here, we describe a protocol to isolate and cultivate osteoclasts from mouse bone marrow that will yield large numbers of osteoclasts.

Osteoclasts are the principal bone-resorbing cell in the body. An ability to isolate osteoclasts in large numbers has resulted in significant advances in the understanding of osteoclast biology. In this protocol, we describe a method for isolation, cultivating and quantifying osteoclast activity in vitro.

Fare Kemik İliği osteoklast türetilmesi

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

Biyoloji

A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

Mature osteoclasts are multinucleated cells that can degrade bone through the secretion of acids and enzymes. They play a crucial role in various diseases (e.g., osteoporosis and bone cancer) and are therefore important objects of research. In vitro, their activity can be analyzed by the formation of resorption pits. In this protocol, we describe a simple pit assay method using calcium phosphate (CaP) coated cell culture plates, which can be easily visualized and quantified. Osteoclast precursors derived from human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were cultured on the coated plates in the presence of osteoclastogenic stimuli. After 9 days of incubation, osteoclasts were fixed and stained for fluorescence imaging while the CaP coating was counterstained by calcein. To quantify the resorbed area, the CaP coating on plates was stained with 5% AgNO3 and visualized by brightfield imaging. The resorption pit area was quantified using ImageJ.

A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

Here, we present a simple and effective assay procedure for resorption pit assays using calcium phosphate coated cell culture plates.

Osteoklastik Rezorpsiyonu In Vitro Görselleştirmek ve Ölçmek için Basit Bir Pit Tahlil Protokolü

Mature osteoclasts are multinucleated cells that can degrade bone through the secretion of acids and enzymes. They play a crucial role in various diseases ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or macrophage precursors. Excessive bone resorption is one the most significant cellular mechanisms leading to osteolytic diseases, including osteoporosis, periodontitis, and periprosthetic osteolysis. The main physiological function of osteoclasts is to absorb both the hydroxyapatite mineral component and the organic matrix of bone, generating the characteristic resorption appearance on the surface of bones. There are relatively few osteoclasts compared to other cells in the body, especially in adult bones. Recent studies have focused on how to obtain more mature osteoclasts in less time, which has always been a problem. Several improvements in the isolation and culture techniques have developed in laboratories in order to obtain more mature osteoclasts. Here, we introduce a method that isolates bone marrow in less time and with less effort compared to the traditional procedure, using a special and simple device. With the use of density gradient centrifugation, we obtain large amounts of fully differentiated osteoclasts from rat bone marrow, which are identified by classical methods.

Osteoclasts are tissue-specific macrophage polykaryons derived from the monocyte-macrophage lineage of hematopoietic stem cells. This protocol describes how to isolate bone marrow cells so that large quantities of osteoclasts are obtained while reducing the risk of accidents found in traditional methods.

Osteoclastogenesis periferik kan monosit kültürlü meme kanseri hücre hatları ile birlikte gelen bir insan preklinik modelinin geliştirilmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler